综述：胰腺胰岛细胞单细胞分辨率钙离子成像：首发响应、高度连接（Hub）及领导型β细胞的功能鉴定

《Frontiers in Endocrinology》：Pancreatic islet cell calcium ion imaging at single-cell resolution: functional identification of first-responder, highly connected (“hub”), and leader beta-cells

本综述详细介绍了在单细胞分辨率下利用GCaMP6f等传感器进行胰岛Ca2+成像的全流程，重点解析了first-responder、hub、leader等β细胞功能亚群在调控胰岛素分泌网络中的关键作用，为揭示糖尿病等代谢疾病中Ca2+信号失调机制提供了标准化方法学参考。

　　

Abstract

胞质游离Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）的升高是胰岛β细胞的关键信号，通常是响应葡萄糖或其他促分泌剂而触发胰岛素分泌所必需的。利用高速成像技术监测单个或多个胰岛平面上的Ca²⁺变化，可用于探索胰岛素精确分泌调控所需的功能网络。这些网络由功能各异的β细胞亚群构成：首发响应细胞（first-responders）、高度连接的中心细胞（hubs）和领导细胞（leaders），它们分别负责启动、连接和主导空间组织的Ca²⁺振荡模式。β细胞间Ca²⁺协调性的改变会导致胰岛素分泌缺陷，这是所有类型糖尿病的基础。本文提供了在分离的啮齿类胰岛（重点是表达遗传Ca²⁺传感器GCaMP6的小鼠胰岛）中进行Ca²⁺成像的详细方案，包括评估胰岛Ca²⁺动力学、协调性、连接性的一般参数以及鉴定特定功能亚群的步骤指南。该方法可应用于研究协调性对正常功能至关重要的组织中的Ca²⁺动力学和协调性。

1 Introduction

细胞通讯是组织的基本属性，通常需要协调大量细胞对刺激的反应。在心脏中，心肌细胞通过缝隙连接电耦合，使细胞能快速协调功能，胞质游离Ca²⁺的升高触发收缩。在大脑中，神经元回路通过高度连接的“枢纽”（hub）神经元协调功能。同样，胰岛表现出集体行为以感知营养、增殖和分泌胰岛素。

胰岛是分散在胰腺中的微器官，约由1000个细胞组成，包含分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞、分泌生长抑素的δ细胞和分泌胰多肽的γ/PP细胞。不同物种的细胞类型比例和结构不同：啮齿类呈β细胞在内、α细胞在外的核心-外套（core–mantle）结构；斑马鱼和人类则呈α细胞分散分布。但所有物种的β细胞在响应葡萄糖时，均表现出空间组织的Ca²⁺波协调性。

所有β细胞都配备有感知葡萄糖和分泌胰岛素的分子机制。餐后血糖升高，葡萄糖通过转运体（啮齿类主要为GLUT2，人类为GLUT1/2/3）进入细胞，经葡萄糖激酶（glucokinase）磷酸化及线粒体代谢后，ATP/ADP比值升高，关闭ATP敏感性K⁺通道（K_ATP），触发膜去极化，激活电压门控Ca²⁺通道（VDCCs）。Ca²⁺内流增加[Ca²⁺]_i，刺激胰岛素胞吐。在多细胞层面，β细胞以空间组织的Ca²⁺波形式协调其[Ca²⁺]_i升高。

历史上β细胞曾被认为是同质群体，但单细胞RNA测序（scRNA-seq）等研究证实其具有异质性。例如，根据细胞表面ST8SIA1和CD9的差异表达，β细胞可分为四种抗原性不同的亚型；发育中的β细胞可能来源于特定的祖细胞亚群；DNMT3A介导的DNA甲基化在胚胎发生期间指定了Neuronatin（Nnat）阳性和阴性亚群。然而，组学数据通常代表单一快照，且存在技术局限性，分子异质性是否反映功能异质性仍有待阐明。

高糖刺激后，胰岛表现出空间组织的细胞内Ca²⁺波，呈现复杂的节律性振荡，大致分为第一时相和第二时相。研究表明，特定的β细胞功能亚群主导了胰岛Ca²⁺动力学：包括“首发响应细胞”（first-responders）、“领导细胞”（leaders）和高度连接的“枢纽细胞”（hubs），各占β细胞总数的5%–10%。首发响应细胞在第一时相启动对葡萄糖的反应；领导细胞启动Ca²⁺波，而枢纽细胞在第二时相或稳态Ca²⁺振荡期间连接整个胰岛网络。

本文旨在提供逐步的方法学，包括胰岛分离、快速Ca²⁺成像、量化峰宽、振幅、频率、曲线下面积（AUC）等动力学参数，以及基于单细胞Ca²⁺动力学鉴定功能亚群。

2 Islet isolation

我们根据Ravier等人描述的方案或下述改良方案（LD偏好）分离胰岛，每只小鼠可释放200-300个胰岛，约占总胰岛数的10%。该方法可在约40分钟内快速高效地完成小鼠胰岛分离，通常使用6-20周龄小鼠（如db/db、C57BL/6J等品系）。

对于Ca²⁺成像研究，我们通常使用双转基因小鼠Ins1Cre: GCaMP6f^Flox/Flox。Ins1Cre系在Ins1基因中敲入Cre重组酶，GCaMP6f^Flox/Flox盒敲入Rosa26基因位点，从而在β细胞中特异性表达遗传编码的Ca²⁺指示剂（GECI）GCaMP6f。GCaMP传感器由环状置换绿色荧光蛋白（cpGFP）连接钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶的M13肽组成。低Ca²⁺时荧光弱，Ca²⁺结合后发生构象变化，绿色荧光显著增强。除GCaMP6外，也可使用JGCaMP8等新一代绿色GECI，或JRCaMP、JRGECO、K-GECO等红色GECI，甚至远红GECI（FR-GECO），但需针对各传感器调整激活阈值。

2.1 培养基与试剂

1. 1.
   基础RPMI-1640（含11 mM葡萄糖），补充10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素后称为完全RPMI，4℃保存。
2. 2.
   胶原酶溶液：用无Ca²⁺PBS溶解胶原酶IV型（800 CDU/mg）至1 mg/mL，每只动物准备4 mL，现配现用，冰上保存。
3. 3.
   密度梯度离心试剂：Histopaque 1119和1077。
4. 4.
   仪器：体视显微镜、镊子、剪刀、5 mL注射器、30 G针头、离心管、悬浮培养皿等。
5. 5.
   动物：若无Ins1Cre: GCaMP6f双转基因鼠，可使用化学Ca²⁺染料替代（见第3节）。

2.2 实验方案

1. 1.
   预冷离心机至4℃。
2. 2.
   深度麻醉后，通过颈椎脱位或伦理批准的方案处死动物。
3. 3.
   消毒后切开腹部皮肤，暴露内脏，定位连接肝脏、胰腺和肠道的胆总管。
4. 4.
   在体视镜下（2×），上推肝脏，拨开其他器官，暴露胃和肠道周围的胰腺，找到胆囊。
5. 5.
   准备含4 mL胶原酶溶液的5 mL注射器，连接弯成约90°的30 G针头。
6. 6.
   定位胆囊与肝管汇合的分叉处，在导管一侧做小切口（勿切断）。
7. 7.
   将针头插入胆总管向胰腺方向约2–5 mm，缓慢注入约3–4 mL冰上胶原酶溶液，直至胰腺完全膨胀。
8. 8.
   沿肠道至胃部解剖胰腺，去除脾脏，将胰腺放入50 mL离心管，冰上保存不超过1小时。
9. 9.
   消化：37℃水浴12分钟。前10分钟后剧烈摇晃10次，继续消化2分钟。注意：延长时间会破坏胰岛。
10. 10.
    终止消化：加入约25 mL基础RPMI，剧烈摇晃，462 g离心3分钟，弃上清以洗去胶原酶。所有接触胰腺的溶液需用10%漂白剂或机构规定溶液中和。
11. 11.
    密度梯度分离：将沉淀重悬于4 mL Histopaque 1119，转入15 mL离心管，依次缓慢加入4 mL Histopaque 1077和4 mL基础RPMI，形成三层（共12 mL）。
12. 12.
    339 g、4℃离心20分钟。
13. 13.
    回收前两层（基础RPMI和Histopaque 1077层）至含10 mL基础RPMI的悬浮培养皿中。
14. 14.
    体视镜下（4×），胰岛为直径50–500 μm的不透明球体。用手工挑选胰岛至含12 mL完全RPMI的新培养皿中，在37℃、5% CO₂培养箱中最多培养2天。建议过夜培养后立即实验，因随培养时间延长，胰岛素分泌和Ca²⁺动力学会减弱。

2.3 注意事项

胰腺导管注射胶原酶时的充分膨胀是胰岛分离效率最关键的一步。

3 Islet culture

3.1 培养基与试剂

1. 1.
   12孔悬浮培养板、完全RPMI。
2. 2.
   病毒转导：过夜恢复后，可用腺相关病毒（AAV）或腺病毒（Ad）转导胰岛，表达GCaMP等遗传Ca²⁺传感器。通常感染复数（MOI）为30–100，需优化MOI以平衡感染效率与细胞死亡率。病毒操作需遵守机构生物安全指南（通常为N2级）。
3. 3.
   感染后4–24小时，将胰岛转移至含1 mL新鲜完全RPMI的新12孔悬浮板中。若使用转基因鼠（如Ins1Cre: GCaMP6f），则无需转导。

3.2 实验方案

1. 1.
   对于未表达GECI的胰岛，可在实验当天使用化学Ca²⁺指示剂（如Cal-520 AM）进行负载。
2. 2.
   将约30–50个胰岛转移至含2 mL Krebs–Ringer bicarbonate HEPES（KRBH）缓冲液（含2.8 mM葡萄糖）的12孔板中，37℃孵育45分钟。
3. 3.
   配制Cal-520 AM工作液：在DMSO中溶解Cal-520 AM，与Pluronic F-127混合，用KRBH稀释至终浓度3–5 μM。
4. 4.
   移除KRBH，加入1 mL Cal-520 AM工作液，37℃避光孵育45分钟。
5. 5.
   用含2.8 mM葡萄糖的KRBH洗涤两次，每次37℃孵育10分钟，以去酯化染料。
6. 6.
   将胰岛转移至成像室，准备成像。

3.3 注意事项

1. 1.
   化学染料可能不均匀地负载到所有细胞，且可能部分淬灭或滞留在线粒体中；遗传传感器（如GCaMP6f）通常更均匀、稳定。
2. 2.
   若使用化学染料，需注意AM酯形式可能被某些细胞类型主动排出，且高浓度染料可能缓冲Ca²⁺信号或产生毒性。