《Frontiers in Plant Science》：Pseudomonas alliivorans, Pseudomonas asturiensis, and Pseudomonas viridiflava multi-infections and competitive interactions in wilted plants of Rosmarinus officinalis L
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本文针对意大利南部田间迷迭香出现的萎蔫与枝节症状，首次鉴定出由假单胞菌属三种病原菌（Pseudomonas viridiflava、P. asturiensis 和 P. alliivorans）共同侵染引起的复合病害。研究通过LOPAT、BIOLOG、多位点序列分析（MLSA）明确病原，并利用离体与活体实验揭示三者间以竞争为主的互作关系，无协同致病效应。成果为理解多病原复合侵染的生态互作提供了新视角，对迷迭香病害防控具有重要指导意义。
迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）作为一种兼具观赏价值与药用功效的常绿灌木，在全球范围内被广泛栽培。然而，随着栽培集约化程度的提高，各种真菌与细菌病原体引发的植保问题日益突出。2018年，意大利南部一处露天迷迭香种植园中，近10%的植株出现了枝叶萎蔫、茎秆增生结节甚至整株枯死的严重症状。传统的病害诊断往往聚焦于单一病原体，但田间复杂的症状暗示可能存在更复杂的病原互作。为揭开这场“植物瘟疫”的真相，研究者开展了一项系统的病原鉴定与互作机制研究。相关成果发表于植物科学领域的知名期刊《Frontiers in Plant Science》。
为了回答上述问题，研究团队运用了多项关键技术。首先，从田间典型病株的组织中进行病原菌的分离与纯化。接着，通过经典的LOPAT（利文-氧化酶-果胶酶-精氨酸双水解酶-烟草过敏反应）系列生化测定、BIOLOG GEN III 表型微阵列系统对分离菌株进行初步分类与代谢特征分析。为了获得更精确的物种鉴定结果，研究采用了基于16S rDNA、gyrB、rpoB 和 rpoD 基因的多位点序列分析（MLSA）构建系统发育树。在明确病原身份后，研究通过离体实验（如交叉划线、培养滤液互抑、挥发性有机物(VOCs)抑制、生物膜形成测定）和活体实验（在迷迭香和番茄植株上进行单菌、两两组合及三菌共接种的致病性测定），系统评估了不同病原菌之间的互作关系及其对病害发展的影响。
3.1 细菌分离与表征
从病株组织共分离到8株具有假单胞菌特征的菌落。LOPAT测试和KB培养基荧光特性分析初步将其分为两个类群，但结果与后续分子鉴定存在差异，提示传统方法在鉴定近缘种时可能存在局限性。
3.2 系统发育分析与菌株鉴定
基于MLSA的最终鉴定结果表明，引起迷迭香病害的病原菌分属三个不同的假单胞菌物种：Pseudomonas viridiflava（包括典型菌株和产黄色黏液的非典型菌株）、P. asturiensis 以及 P. alliivorans。其中，P. alliivorans 和 P. asturiensis 是首次在意大利被报道。系统发育树清晰地将所有菌株归入三个独立的单系群，证实了物种划分的可靠性。
3.3 迷迭香致病性测定与共感染实验
选取三个物种的代表菌株（1N3: P. alliivorans; 2N5: P. asturiensis; 3N1: P. viridiflava）进行接种实验。结果显示，三者均能致病，但毒力差异显著：P. alliivorans 1N3 引起的症状最严重，植株萎蔫率高达83.3%；P. asturiensis 2N5 毒力最弱。当1N3与2N5共接种时，病害严重度显著低于1N3单独接种，表明2N5对1N3的致病性产生了拮抗作用。在所有两两或三菌共接种组合中，均未观察到症状加重的协同效应。
3.4 番茄植株致病性测定与共感染实验
为更精细地研究互作动态，研究以番茄为模型宿主进行了时序接种实验。在单菌接种中，1N3和3N1毒力较强，2N5毒力较弱且症状发展迟缓。三菌同时接种的病害严重度与1N3或3N1单接种无显著差异，但高于2N5单接种。更重要的是，接种顺序显著影响病害结局：以1N3为首个接种菌的组合毒力最强，而以2N5为首时，能显著抑制后续接种的1N3在感染早期的毒力表达，再次印证了2N5的竞争/拮抗潜力。主成分分析（PCA）进一步证实，病害发展动态主要由首个接种的菌株驱动。
3.6 铁载体与运动性测定
表征了与竞争和定殖相关的生理特性。P. alliivorans 1N3 的铁载体产量和运动（游动与群游）能力最强，P. asturiensis 2N5 次之，P. viridiflava 3N1 最弱。这暗示1N3在获取铁营养和扩散定殖方面可能具有优势。
3.7 不同菌株组合的生物膜形成
共培养实验显示，菌株间互作对生物膜形成普遍呈抑制作用，无协同增强效应。特别是当 P. viridiflava 3N1 存在时，能显著抑制其他菌株的生物膜形成，表明了其在界面竞争中的潜力。
3.9 菌株间的协同或抑制效应
在贫营养液体培养基中进行的培养滤液互作实验揭示了更明显的竞争关系。P. asturiensis 2N5 的培养滤液能显著抑制另外两种菌的生长，而 P. alliivorans 1N3 的滤液反而促进了 P. viridiflava 3N1 的生长。这解释了活体实验中2N5对1N3毒力的拮抗现象，并提示1N3与3N1之间可能存在某种代谢相容性。600 in the absence or in the presence of the culture filtrates (Filt) obtained from the other bacteria. Error bars represent standard errors, with different letters indicating statistically significant differences (p < 0.05) based on one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post hoc test (or Kruskal–Wallis with Dunn’s post hoc test if normality and homogeneity of variances assumptions were not met).">
3.10 挥发性有机物的抑制活性
VOCs 实验表明，P. asturiensis 2N5 和 P. viridiflava 3N1 产生的挥发性物质能显著抑制 P. alliivorans 1N3 的生长，这为种间竞争提供了另一种潜在机制。
结论与讨论
本研究的核心结论是，在意大利南部迷迭香上发生了一种新的、由 Pseudomonas viridiflava、P. asturiensis 和 P. alliivorans 三种病原菌共同侵染引起的复合病害。三者虽均具致病性，但毒力存在差异，其中 P. alliivorans 最强。更为关键的是，研究通过体内外实验证实，这三种病原菌在共同侵染时，主要以竞争性相互作用为主，未发现协同加剧病害的迹象。具体表现为：
- 1.
竞争主导：P. asturiensis 2N5 在活体接种（特别是作为先导菌时）和离体培养滤液实验中，均显示出对最强毒力菌株 P. alliivorans 1N3 的拮抗作用，能降低其引起的病害严重度。
- 2.
无协同效应：无论在迷迭香还是番茄上，两两或三菌共接种均未产生比最强毒力单菌接种更严重的症状，排除了协同致病的可能性。
- 3.
竞争机制多样：这种竞争可能源于多种因素，包括高度的营养生态位重叠、P. asturiensis 2N5 产生的可溶性抑制物质及其挥发性有机物（VOCs）对其他菌株（尤其是 P. alliivorans 1N3）的抑制、以及对生物膜形成的相互干扰等。
这项研究的意义重大。首先，它首次报道了 P. alliivorans 和 P. asturiensis 在意大利的存在及其对迷迭香的致病性，更新了该地区植物病原菌名录。其次，它系统地揭示了一个多细菌病原复合侵染体系中，种间竞争而非协同是主要的互作形式，这挑战了对于复合病害（如番茄髓部坏死病中常观察到协同作用）的常规认知，强调了互作类型的多样性。最后，研究指出 P. asturiensis 虽然毒力较弱，但其强大的竞争与拮抗能力可能在田间病原群落动态和病害发展中扮演着重要的调节者角色。这为理解自然生态和农业环境中复杂微生物群落的互作网络，以及未来开发基于微生物互作的生态防控策略提供了新的理论基础和案例参考。当然，病原菌与寄主植物三者之间的互作极为复杂，本研究主要聚焦于细菌间的相互作用，未来进一步探究植物免疫系统在此多侵染过程中的响应，将能更完整地揭示该病害发生的全貌。
