《International Journal for Parasitology》：The Application of Ultrastructure Expansion Microscopy Reveals the Apical Microtubule Architecture of Babesia
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为解决Babesia spp.因尺寸极小（1–2.5 μm）导致的亚细胞结构解析难题，研究人员应用超微结构膨胀显微镜（U-ExM）对B. divergens进行4.3倍各向同性物理放大。研究首次发现了顶端微管花冠（ATRo）这一独特结构，分辨率媲美透射电镜但兼容多色荧光标记，为研究寄生虫入侵机制及药物靶点提供了新工具。
背景：被“小”难住的寄生虫
巴贝斯虫（Babesia）是一类蜱传顶复门（Apicomplexa）寄生虫，能入侵红细胞引发人畜共患的巴贝斯虫病（Babesiosis）。其中，Babesia divergens是欧洲人类感染的主要病原，对免疫缺陷患者致死率可达40%。然而，这类寄生虫的细胞生物学研究长期滞后，核心障碍在于其尺寸极小（属于“小型巴贝斯虫”，仅1.0–2.5 μm），传统光学显微镜无法分辨其精细内部结构，而电镜虽分辨率高却难以进行多蛋白标记和动态分析。
顶复门寄生虫依赖独特的微管骨架（如皮层下微管、锥状结构）进行形态维持和入侵。虽然Babesia基因组编码全部6类微管蛋白（α, β, γ, δ, ε, ζ），但其在虫体顶端的实际组装形态一直是个谜。此前，超微结构研究多集中在Plasmodium（疟原虫）和Toxoplasma（弓形虫）上，Babesia的亚细胞结构几乎处于“黑箱”状态。
技术路线概览
本研究首次将超微结构膨胀显微镜（U-ExM）成功应用于Babesia divergens。通过将虫体连同宿主红细胞进行4.3倍各向同性物理膨胀，利用常规共聚焦显微镜实现了纳米级分辨率成像。研究团队优化了从培养、固定（比较了PFA/GA化学固定与高压冷冻-冷冻置换两种方法）、凝胶化到免疫标记的全流程，并结合透射电镜（TEM）和系统发育分析，重点解析了虫体顶端的微管骨架结构。
研究结果解析
3.1. U-ExM 突破分辨率极限，清晰展示虫体内部结构
应用U-ExM后，B. divergens的尺寸被放大至可清晰测量的程度（营养体直径约5.6 μm，梨形虫体长度约7.8 μm）。通过Hoechst（染核）和NHS-ester（染蛋白）标记，研究首次在光镜水平清晰呈现了虫体的内部空间布局，包括细胞核、胞质区室以及顶端的致密结构，且未出现明显的各向异性变形。
3.2. 发现全新的顶端微管结构——ATRo
这是本研究最核心的发现。通过α/β-微管蛋白抗体标记，研究者在B. divergens的顶端极区发现了一个此前从未被描述的顶端微管花冠（Apical Tubulin Rosette, ATRo）。该结构由6–7根放射状排列的微管“棘”构成，形态上既不同于Toxoplasma的锥状体（conoid），也不同于Plasmodium描述的顶端极环（apical polar ring），代表了一种新的微管组装模式。这一发现解释了Babesia如何利用有限的微管蛋白库构建独特的入侵机器。
3.3. 技术优势：分辨率媲美电镜，功能更强大
通过与TEM数据的对比，研究证实U-ExM在解析微管单根纤维和顶端结构方面，分辨率与TEM相当。但U-ExM具有显著优势：支持多色免疫荧光标记（可同时观察微管、核、膜等结构）、样品制备更简单、通量更高，且能通过抗体标记直接关联特定蛋白（如γ-微管ulin）。这解决了电镜只能看形态、难以做分子鉴定的痛点。
结论与意义
本研究成功建立了U-ExM在Babesia研究中的标准流程，并揭示了其独特的ATRo结构。这一成果具有三重意义：
- 1.
技术革新：U-ExM为研究微小寄生虫的亚细胞结构提供了“光学电镜”级的新工具，极大降低了纳米级细胞生物学研究的门槛。
- 2.
结构生物学突破：ATRo的发现丰富了顶复门寄生虫细胞骨架的多样性，提示不同属的寄生虫在进化中“定制”了不同的顶端入侵器械。
- 3.
药物靶点潜力：由于寄生虫微管蛋白与宿主差异显著，ATRo作为Babesia特有的关键结构，其组成蛋白有望成为开发特异性抗寄生虫药物的新靶点。
