在密集生长的Mythimna separata中，两种角质蛋白的上调与对Beauveria bassiana的抗性相关 李文萌（Wenmeng Li） 廖静（Jing Liao） 李玲玲（Lingling Li） 戴长庚（Changgeng Dai） 胡阳（Yang Hu） 钱宇涵（Yuhan Qian） 李洪波（Hongbo Li）

《Insects》：Upregulation of Two Cuticular Proteins Is Associated with Resistance to Beauveria bassiana in Crowded Mythimna separata Wenmeng Li, Jing Liao, Lingling Li, Changgeng Dai, Yang Hu, Yuhan Qian and Hongbo Li

　　**简单总结**
鞘翅目害虫Mythimna separata表现出与种群密度相关的防御机制（density-dependent prophylaxis, DDP），但除了免疫调节之外的机制仍需进一步探究。本研究表明，两种角质蛋白基因MsCP1和MsCP2对该害虫的DDP具有重要作用。与独居（低密度）个体相比，群居（高密度）幼虫的角质层中这两种基因的表达显著增强。通过星形多阳离子（star polycation, SPc）纳米载体干扰MsCP1和MsCP2在群居幼虫中的表达，使其表达水平降至与独居对照组相当，并导致蜕皮异常、角质层变薄以及超微结构改变。此外，沉默这些基因后的群居幼虫在感染Beauveria bassiana时死亡率增加，与独居幼虫类似。这些结果表明，MsCP1和MsCP2通过调节角质层性质增强了昆虫对真菌的抵抗力，为了解DDP机制和制定生物防治策略提供了新的依据。

**摘要**
Mythimna separata是一种重要的粮食作物害虫，具有与种群密度相关的防御机制（DDP）。以往的研究主要集中在免疫系统调节方面。本研究发现，两种角质蛋白基因MsCP1和MsCP2参与了这种害虫的DDP过程。在群居高密度阶段的4-6龄幼虫中，这两种基因的表达显著高于独居低密度阶段的个体。当利用星形多阳离子（SPc）纳米载体进行RNA干扰（RNAi）处理后，群居幼虫中的MsCP1和MsCP2表达水平显著下降，其表现与dsGFP/SPc处理的独居幼虫相似。进一步的研究表明，沉默这些基因会导致群居幼虫蜕皮异常、超微结构改变及角质层变薄。感染昆虫病原菌Beauveria bassiana后，沉默MsCP1和MsCP2的群居幼虫死亡率显著高于dsGFP/SPc处理的群居幼虫，但与dsGFP/SPc处理的独居幼虫死亡率无显著差异。这些结果表明，MsCP1和MsCP2的上调与群居Mythimna separata对Beauveria bassiana的抵抗力有关，为深入理解昆虫DDP机制及生物防治提供了重要见解。

**1. 引言**
昆虫是自然界中最成功的动物群体之一，这主要归功于它们高效的免疫系统，能够有效抵御入侵病原体。除了先天免疫外，昆虫的免疫系统还具有可塑性，可根据环境条件和生理状态调整免疫能力[1,2]。研究表明，种群密度的变化会影响昆虫的免疫反应[3]，通常认为高种群密度会因资源匮乏和生理压力导致免疫能力下降[4,5]。有趣的是，某些昆虫在高种群密度下表现出增强的抗病性，这种现象被称为“与种群密度相关的防御机制（DDP）”[6]。DDP首次在Pseudaletia separata中被发现[7]，随后在Tenebrio molitor[8]、Schistocerca gregaria[9]、Bombus terrestris[10]、Locusta migratoria[11]、Anticarsia gemmatalis[12]、Plutella xylostella[13]、Ceratina okinawana[14]和Spodoptera litura[15]等物种中也得到验证。这些研究表明，DDP普遍存在于多种昆虫中，尤其是在具有阶段性多态性的物种中。部分昆虫物种的DDP机制已被阐明：例如，某些物种在高密度条件下，酚氧化酶活性、溶菌酶活性和血细胞总数显著增强[9,16,17,18]。值得注意的是，不同病原体可能触发不同的免疫应答机制——例如，Mythimna separata幼虫在每瓶10只幼虫的密度下对苏云金芽孢杆菌最具抵抗力，而在每瓶30只幼虫的密度下对Beauveria bassiana的抵抗力最强[18]。这些发现表明，昆虫可能针对不同病原体激活不同的免疫信号通路。

过去十年中，人们在对昆虫DDP的分子机制理解方面取得了重要进展。早期转录组分析显示，群居蝗虫中编码蛋白酶抑制剂、抗氧化剂和模式识别蛋白的基因表达上调[11]。近年来，RNA干扰（RNAi）技术成为基因功能研究和害虫管理的有效工具[19]。例如，Wang等人发现，通过RNAi沉默模式识别蛋白gnbp3，群居蝗虫对Metarhizium anisopliae的敏感性显著降低[11]。Toll-Sp?tzle信号通路是昆虫先天免疫系统的核心组成部分，在防御细菌、真菌等病原体感染中起关键作用。Jiang等人发现，随着幼虫密度增加，MsToll-1和MsSp?tzle-4在Mythimna separata中的表达显著增强[20]；RNAi干扰这些基因后，群居幼虫的免疫相关基因表达下调，感染苏云金芽孢杆菌后的存活率也降低[20]。此外，研究表明，高密度条件下饲养的Mythimna separata幼虫的血淋巴中 octopamine 含量增加，该激素参与多种生理过程[18]；外源性注射octopamine可增强幼虫的酚氧化酶活性和血细胞数量[18]，而其拮抗剂epinastine则抑制这些免疫参数的上调[18]。在高密度条件下饲养的幼虫中沉默 Octopamine 合成酶tyramine β-hydroxylase（Tβh）基因后，暴露于Beauveria bassiana后的存活率降低25.1%[21]。这些结果表明，昆虫通过未知机制感知种群密度变化，并激活octopamine介导的神经内分泌系统和Toll–Sp?tzle免疫通路，从而增强抗病性。然而，其他基因或通路是否参与这一过程尚不清楚。

昆虫角质层是一种多层结构，既作为外骨骼，又提供物理屏障抵御不良环境因素[22]。其主要成分包括角质蛋白（CPs）、几丁质、脂质和水分[23]。角质蛋白在昆虫生长发育中起重要作用[24,25,26,27]。最新研究表明，角质蛋白还参与昆虫对农药的抵抗力[28]。长期接触农药会增厚角质层并上调编码角质蛋白的基因表达，降低农药的渗透能力[29,30,31,32,33]。昆虫病原真菌会附着在角质层并侵入体内。目前尚不清楚角质蛋白是否直接参与昆虫的DDP机制。
东方粘虫Mythimna separata是亚洲粮食作物的主要害虫，具有DDP现象[34]。我们的研究表明，群居高密度幼虫的角质层更厚，角质蛋白表达更高[35]，推测角质蛋白在DDP中起关键作用。为此需要可靠的基因功能分析工具。RNAi已被广泛用于昆虫基因研究，但在鳞翅目昆虫中效果有限，因为其血淋巴和中肠存在降解dsRNA的核酸酶[36]。为克服这一障碍，开发了多种基于纳米材料的dsRNA递送系统，如壳聚糖纳米粒子、脂质体、碳纳米管和星形多阳离子（SPc）[37,38,39]。其中，SPc介导的dsRNA递送技术在多种昆虫中表现出显著效果[40,41,42,43]。本研究首先从Mythimna separata转录组数据库中鉴定出两种角质蛋白基因（命名为MsCP1和MsCP2），并分析其在不同发育阶段和组织的表达情况。随后通过SPc介导的RNAi干扰这些基因，评估其对角质层形态和抗Beauveria bassiana能力的影响，为该害虫的生物防治提供了新策略。

**2. 材料与方法**
2.1. 昆虫群体与真菌菌株
本研究使用的长期实验室种群最初于2014年在中国迁西市从玉米上采集的幼虫开始建立。该群体包含独居和群居个体的Mythimna separata，按照先前方法繁殖[44]，在25 ± 1°C、光照14小时/黑暗10小时的条件下以玉米为基础饲料饲养。成虫被转移到尼龙笼中，提供10%蜂蜜/水混合物和塑料绳用于产卵。
用于递送dsRNA的星形多阳离子（SPc）纳米载体由中国农业大学Yan教授提供，并储存在4°C环境中。本研究中使用的Beauveria bassiana菌株来自山西潞海农药科技有限公司（中国山西），储存在-80°C直至使用。实验前，将菌株接种在土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基（土豆200克、葡萄糖20克、琼脂20克、胰蛋白酶5克、蒸馏水1000毫升）上，在人工气候箱中培养10天（温度26 ± 1°C、相对湿度80% ± 5%、光照12小时/黑暗12小时）。根据初步实验结果，将孢子稀释至1.0 × 10^7 CFU/mL浓度。
2.2. MsCP1和MsCP2的生物信息学分析
MsCP1和MsCP2的cDNA序列来自我们最近测序的Mythimna separata转录组数据库[43]。使用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）鉴定核苷酸和推导的氨基酸序列，并通过SMART（http://smart.embl.de/）预测保守结构域。利用DNAMAN（https://www.lynnon.com/）将其他昆虫中的角质蛋白氨基酸序列与MsCPs进行比较，采用MEGA v. 7.0和邻接聚类算法构建系统发育树（重复次数2000次）。
2.3. 群居与独居Mythimna separata中MsCP基因的表达
由于群居效应在3龄后才会显现，因此从4-6龄幼虫中采集样本。收集这两种发育阶段幼虫的头部、角质层、血淋巴、脂肪体、肠道和足部组织。根据Promega公司的方案（美国威斯康星州Madison）使用Eastep? Super Total RNA Isolation Kit提取总RNA，并用DNase I去除基因组DNA。检测RNA质量并确定浓度后，使用iScript cDNA Synthesis Kit（美国加州Hercules）合成第一链cDNA。定量实时PCR（qRT-PCR）在CFX96实时PCR系统（美国加州Hercules）上进行：预热95°C 2分钟，随后进行35个循环（95°C 5秒、60°C 30秒）。通过β-Actin和Tubulin作为发育阶段和组织的参考基因，利用2^-ΔΔCt方法测定两种MsCP的表达水平[45]。每个实验包含3个独立重复样本，每个重复样本包含3-5只幼虫。所用引物列于表S1中。
2.4. MsCP1和MsCP2的RNAi干扰
使用含有T7启动子的特异性引物扩增MsCP1和MsCP2的双链RNA（dsRNA）[表S1]。使用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit（美国马萨诸塞州Waltham）合成dsRNA。纯化后的dsRNA溶解在ddH2O中，浓度为5 μg/μL。由于RNAi在鳞翅目昆虫中的效果较低，采用星形多阳离子（SPc）纳米载体进行递送，稍作修改[40]。具体步骤为：将dsRNA和SPc分别稀释至5 μg/μL和10 μg/μL，混合后于25°C孵育30分钟形成复合物，再稀释至最终浓度2.5 μg/μL。在第四龄幼虫阶段的第1天，我们使用了群居（G）和独居（S）阶段的个体进行RNA干扰（RNAi）实验。每只幼虫被注射了1微升的双链RNA（dsRNA）/SPc（2.5微克/微升）。处理组包括以下几种：（1）注射dsGFP/SPc的独居幼虫（S-dsGFP/SPc）；（2）注射dsMsCP1/SPc的群居幼虫（G-dsMsCP1/SPc）；（3）注射dsMsCP2/SPc的群居幼虫（G-dsMsCP2/SPc）；以及（4）再次注射dsGFP/SPc的群居幼虫（G-dsGFP/SPc）。注射后48小时，收集样本用于RNA提取，并通过qRT-PCR来确定MsCP1和MsCP2表达的抑制效果。每个处理组观察并使用数码相机（DS-Fi3，尼康，东京，日本）拍摄了表型照片。每个处理组观察了20只幼虫。

2.5 扫描电子显微镜
为了评估MsCPs敲低对表皮发育的潜在影响，我们通过扫描电子显微镜（SEM）分析了上述四种处理下的幼虫表皮的超微结构。在RNAi处理后72小时，解剖了独居和群居幼虫的背部表皮。解剖后的样本用PBS（pH 7.4）冲洗，室温下固定2小时，然后冷藏4°C备用。固定后的样本再用0.1 M PBS冲洗三次，每次15分钟。接着将样本转移到1% OsO4中浸泡2小时，并在室温下避光孵育，之后再次用0.1 M PBS冲洗三次。清洗过的表皮在梯度乙醇系列（30、50、70、80、90、95和100%）中孵育15分钟，然后用EM CPD300临界点干燥器（莱卡，索尔姆斯，德国）进行干燥。随后使用K550X溅射镀膜机（Electron Microscopy Sciences，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州，美国）对样本进行30秒的镀金处理。由于我们没有观察到同一阶段幼虫表皮之间的差异，因此比较了表皮的中间区域。每个阶段各使用了五只个体进行SEM分析。

2.6 透射电子显微镜
通过透射电子显微镜（TEM）评估了注射dsRNAs的独居和群居幼虫的表皮厚度。根据之前的方法[29]准备了四种处理组的表皮样本，并使用JEM-1210透射电子显微镜（HT7800，日立，东京，日本）在80 kV下观察解剖后的表皮。每个样本的数字图像被拍摄下来，并使用Image J2（https://imagej.net/ij/）测量厚度。由于在我们之前的研究[34]中没有发现不同表皮切片之间的明显差异，因此随机选择了群居（n = 4）和独居幼虫（n = 4）的五个表皮区域进行厚度分析。

2.7 对B. bassiana的抗性
为了评估MsCP1和MsCP2敲低对疾病抗性的影响，在注射后24小时收集存活的幼虫，并暴露于含有1.0 × 10^7 CFU/mL的B. bassiana悬浮液中。幼虫暴露于B. bassiana溶液中5秒，然后在室温下风干并转移回初始饲养条件。每天记录存活率，直到幼虫死亡或化蛹。该实验包含三个独立的生物重复实验，每个重复实验包含20只幼虫。

2.8 统计分析
通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定处理组之间的显著差异，随后使用Tukey的Honest Significant Difference（HSD）检验进行进一步分析。使用学生t检验（Student’s t-test）评估群居和独居幼虫阶段之间的差异，显著性水平分别为p < 0.05（*）、p ≤ 0.01（**）和p ≤ 0.001（***）。数据表示为均值±标准误差（SE）。所有统计分析均使用DPS v. 17.0软件[46]进行。

3 结果
3.1 MsCP1和MsCP2的生物信息学分析
在M. separata的转录组中鉴定出两个表皮蛋白基因，分别命名为MsCP1和MsCP2；这两个基因编码的开放阅读框（ORFs）长度分别为396 bp和336 bp，推导出的蛋白质序列含有131个和111个氨基酸（图S1）。序列分析显示，这两个基因在RR1亚家族中都包含一个几丁质结合域。分析了这两个MsCPs与其他昆虫物种的CPs的系统发育关系。如图S2所示，系统发育树明显分为两个分支，一个是鳞翅目物种，另一个是其他物种。在鳞翅目分支内，MsCP1和MsCP2与Mythimna loreyi中的CP聚类在一起，而与Colics croceus中的CP位于同一分支上。

3.2 MsCP1和MsCP2在群居和独居M. separata中的表达
通过qRT-PCR分析了这两个MsCPs的发育和组织特异性表达模式。如图1所示，这两个基因在4-6龄幼虫中的表达不同，并且随着发育的进行而上调（MsCP1：Fsolitary = 31.96，p = 0.0006；Fgregarious = 4.83，p = 0.0362；MsCP2：Fsolitary = 47.642，p = 0.0002；Fgregarious = 17.921，p = 0.0029）。当进行t检验分析时，群居4-5龄幼虫中的MsCP1和MsCP2表达水平高于独居幼虫，但在6龄幼虫中两个阶段的表达没有显著差异（图1A,B）。

图1. MsCP1和MsCP2在群居和独居M. separata中的表达水平。图（A,B）分别显示了群居和独居M. separata各发育阶段的MsCP1和MsCP2表达水平。图（C,D）展示了群居和独居M. separata 5龄幼虫中MsCP1和MsCP2的组织特异性表达模式。缩写：L4–L6，表示第四至第六龄幼虫。数据表示为均值±SE（n = 3）。不同的小写字母或大写字母表示基于单因素方差分析和Tukey的Honest Significant Difference检验，在p ≤ 0.05水平上表示阶段或组织间的显著差异。星号（*）、（**）和（****）分别表示群居和独居幼虫在p ≤ 0.05、p ≤ 0.01和p ≤ 0.001水平上的显著差异。“ns”表示两个阶段之间没有显著差异。组织分布分析显示，这两个基因在各种组织类型中的表达存在差异（MsCP1：Fsolitary = 27.66，p < 0.001；Fgregarious = 105.27，p < 0.001；MsCP2：Fsolitary = 31.56，p < 0.001；Fgregarious = 122.40，p < 0.001）。例如，与群居阶段的昆虫相比，独居个体的头部和中肠中MsCP1的表达较高；然而，在血淋巴、脂肪体和足部及表皮中的表达水平在群居幼虫中高于独居个体（图1C,D）。与独居个体相比，群居幼虫的血淋巴和足部中MsCP2的表达较低，但在头部、中肠、脂肪体和表皮中的表达较高（图1C,D）。

3.3 通过RNAi敲低MsCP1和MsCP2的表达
为了探讨MsCP1和MsCP2的功能，我们通过向群居和独居M. separata的4龄幼虫注射dsCP/SPc复合物来沉默这两个基因。用dsMsCP1/SPc或dsMsCP2/SPc处理的群居幼虫中，MsCP1和MsCP2的表达水平分别比对照组（G-dsGFP/SPc）降低了65.12%和46.00%，并且与用dsGFP（S-dsGFP/SPc）处理的独居幼虫的表达没有显著差异（图2A,B）。与用dsGFP/SPc处理的群居幼虫相比，MsCP1和MsCP2的表达敲低导致群居幼虫的蜕皮异常（图2C）。

图2. SPc介导的RNAi后MsCPs的沉默效率及幼虫表型。图（A,B）分别显示了注射dsRNA/SPc后48小时的MsCP1和MsCP2表达水平。图（C）显示了注射dsRNA/SPc的独居和群居幼虫的表型。缩写：S-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的独居幼虫；G-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的群居幼虫；G-dsMsCP1/SPc和G-dsMsCP2/SPc，分别表示注射dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc的群居幼虫。β-actin作为参考基因。数据点表示来自三个独立生物重复实验和三个技术重复实验的均值±SE。不同的小写字母表示基于单因素方差分析和Tukey的Honest Significant Difference检验，在p ≤ 0.05水平上表示处理组间的显著差异。

3.4 MsCPs表达沉默后的表皮SEM分析
为了进一步研究MsCP1和MsCP2的作用，我们使用SEM观察了注射dsMsCP1/SPc、dsMsCP2/SPc或dsGFP/SPc的群居和独居幼虫的表皮超微结构（图3）。结果显示，沉默群居幼虫中的MsCP1或MsCP2会导致表皮表面模糊（图3B，dsMsCP1/SPc）或形成向上的多边形颗粒（图3C，dsMsCP2/SPc），这与用dsGFP/SPc处理的群居幼虫（图3A，G-dsGFP/SPc）相比有所不同。此外，dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc处理的群居个体中颗粒之间的距离更大，这与用dsGFP/SPc处理的独居幼虫观察到的结果相似（图3D，S-dsGFP/SPc）。

图3. SPc介导的RNAi对群居幼虫表皮超微结构的影响。图（A,D）分别显示了注射dsGFP/SPc的群居（G）和独居（S）幼虫的表皮超微结构。图（B,C）显示了注射dsMsCP1/SPc或dsMsCP2/SPc的群居幼虫的表皮超微结构。图像是用TM-1000扫描电子显微镜在3 kV加速电压下生成的。

3.5 MsCPs敲低后的表皮厚度TEM分析
用dsGFP/SPc处理的幼虫的表皮纵向切片相对光滑，而dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc处理的幼虫的表皮表面更为不均匀，并出现裂纹（图4）。此外，dsMsCP1/SPc或dsMsCP2/SPc处理的群居幼虫的表皮厚度显著低于用dsGFP/SPc处理的群居幼虫（dsMsCP1/SPc：40.42 μm，dsMsCP2/SPc：38.54 μm），也低于用dsGFP/SPc处理的独居幼虫的厚度（110.12 μm）（图4和图5）。

图4. 透射电子显微镜显示，通过SPc介导的RNAi敲低MsCP1和MsCP2会改变M. separata群居幼虫的表皮形态和厚度。图（A,D）分别显示了注射dsGFP/SPc的群居（G）和独居（S）幼虫的表皮纵向切片。图（B,C）显示了注射dsMsCP1/SPc或dsMsCP2/SPc的群居幼虫的表皮纵向切片。图像是用JEM-1210透射电子显微镜在80 kV下获得的。绿线表示群居和独居幼虫的表皮厚度。

图5. SPc介导的RNAi降低了群居幼虫的表皮厚度。缩写：S-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的独居幼虫；G-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的群居幼虫；G-dsMsCP1/SPc和G-dsMsCP2/SPc，分别表示注射dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc的群居幼虫。数据表示来自四个独立生物重复实验的均值±SE。不同的小写字母表示基于单因素方差分析和Tukey的Honest Significant Difference检验，在p ≤ 0.05水平上表示处理组间的显著差异。

3.6 对B. bassiana的抗性检测
如图6所示，暴露于B. bassiana后，无论是用dsGFP/SPc处理的独居还是群居幼虫的死亡率都逐渐增加。在感染B. bassiana后的第8天，用dsGFP/SPc处理的群居幼虫的累积死亡率（38.33%）显著低于用dsGFP/SPc处理的独居幼虫（75.00%）。然而，在B. bassiana感染后，用dsMsCP1/SPc或dsMsCP2/SPc处理的群居幼虫的累积死亡率（dsMsCP1/SPc：76.67%；dsMsCP2/SPc：71.66%）高于用dsGFP/SPc处理的群居对照组（G-dsGFP/SPc）。

图6. SPc介导的RNAi降低了感染B. bassiana的群居M. separata幼虫的死亡率。缩写：S-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的独居幼虫；G-dsGFP/SPc，表示注射dsGFP/SPc的群居幼虫；G-dsMsCP1/SPc和G-dsMsCP2/SPc，分别表示注射dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc的群居幼虫。星号（****）表示根据学生t检验，在p ≤ 0.001水平上表示群居和独居幼虫之间的显著差异。

4 讨论
在受到M. separata感染的作物中，导致产量大幅下降的一个主要因素是高种群密度下形成的群居阶段。值得注意的是，群居的M. separata幼虫表现出更好的免疫力，并且对真菌杀虫剂的敏感性降低，从而促进了田间作物的病害爆发[47]。在之前的研究中，我们发现群居的M. separata幼虫比独居个体对B. bassiana具有更强的抵抗力[34]。然而，M. separata中这种群体行为的机械基础尚不清楚。多项研究表明，神经激素和Toll–Sp?tzle免疫途径为M. separata提供了更有效的防御机制[18,20,21]。在当前的研究中，我们鉴定出两个表皮蛋白基因MsCP1和MsCP2，它们通过改变表皮的超微结构和厚度增强了群居M. separata对B. bassiana的抵抗力。据我们所知，这是第一份关于介壳蛋白在昆虫DDP中的作用的研究报告。为了探讨介壳蛋白在DDP中的生物学功能，我们首先研究了M. separata的两个发育阶段中MsCP1和MsCP2的表达情况。这些基因在群居型M. separata的4龄和5龄幼虫中的表达量高于独居个体。这一结果与先前的研究结果相似，那些研究中观察到群居型M. separata和蝗虫的应激相关基因明显上调[44,48,49]。这两种MsCPs的上调可能是由于M. separata在4龄和5龄幼虫期出现的群体拥挤现象所致。此外，这些介壳蛋白基因的表达增加表明M. separata可能通过强化其介壳来作为一种防御策略。

在这项研究中，我们对群居型M. separata的4龄幼虫进行了针对MsCP1和MsCP2的SPc介导的RNAi处理。注射dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc后，群居幼虫的形态发生了变化，表现为体型变小和蜕皮异常，这表明MsCPs在介壳发育中起作用。通过SEM进一步观察了dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc处理后的幼虫形态变化。与先前的研究结果一致[35]，dsGFP/SPc处理的群居幼虫的介壳表面出现了更多多边形颗粒，并且比dsGFP/SPc处理的独居幼虫表现出更强的抗B. bassiana能力。Grizanova等人也报道过，黑色型G. mellonella幼虫的介壳表面有更多的黑色素斑点，而且黑色型幼虫对昆虫病原真菌的抵抗力更强[50]。群居幼虫介壳表面的密集多边形颗粒可能通过减少孢子附着的表面积或改变表面自由能及润湿性来降低孢子的附着效率。这一推测得到了之前研究的支持，即那些对真菌病原体具有抗性的昆虫介壳上吸附和萌发的孢子数量较少[50,51,52]。换句话说，群居幼虫的增强抵抗力主要依赖于介壳表面的物理“屏障效应”，而不仅仅是免疫激活。本研究发现，针对群居幼虫中MsCP1的SPc介导的RNAi处理会使介壳边缘变得模糊，而针对MsCP2的SPc介导的RNAi处理则会在介壳表面形成向上排列的多边形颗粒。这两种改变都可能破坏了原本光滑或紧密的介壳表面结构，为孢子提供了更多的附着点。与此一致的是，暴露于B. bassiana的dsMsCP1/SPc和dsMsCP2/SPc处理过的群居幼虫的死亡率显著高于dsGFP/SPc处理过的群居个体。这些结果支持了特定介壳超微结构通过影响孢子附着效率来调节抗真菌能力的机制。

我们的研究与之前对Tribolium castaneum的研究相似[53]，在该研究中，联合敲低成虫特异性介壳蛋白基因会减弱抗真菌表型，促进附着在成虫体表的孢子萌发，并增加宿主对两种真菌生物杀虫剂的敏感性。综合来看，我们认为MsCP1和MsCP2参与了构建一种特定的介壳表面超微结构，这种结构间接调节了群居幼虫中孢子的附着和萌发。尽管没有直接观察到孢子在介壳上的感染过程，但上述推理表明介壳超微结构的变化至少部分解释了群居幼虫对B. bassiana的增强抵抗力。鉴于介壳主要由结构性介壳蛋白、几丁质和脂质组成[23]（其中后两者还具有重要的保护功能[54,55]），我们进一步推测，沉默这两种MsCPs可能会改变介壳成分的排列或交联状态，从而影响介壳成分的物理化学性质[55]，最终削弱群居幼虫的抗真菌防御能力。不过，还需要进一步的研究来验证这一推测。

另一个显著的表型是，dsGFP/SPc处理的群居幼虫的介壳比dsGFP/SPc处理的独居幼虫更厚。SPc介导的MsCP1和MsCP2沉默导致群居幼虫的介壳变薄，使得它们在暴露于B. bassiana后死亡率升高。这些数据表明，群居幼虫较厚的介壳起到了物理屏障的作用，防止了真菌菌丝的侵入。从机制上看，增厚的介壳延长了真菌菌丝需要穿越的距离，并增加了需要降解的介壳基质总量。由于昆虫病原真菌必须分泌蛋白酶和几丁质酶才能穿透介壳到达血淋巴，因此较厚的介壳需要更多时间和更多的酶活性才能成功侵入。在几种昆虫物种中，介壳增厚对化学杀虫剂的抗性已有充分记录，这通常与CP基因的过表达有关[28]。例如，当敲低编码SlMsCP26的基因时，Spodoptera litura的抗性品系对indoxacarb的敏感性增加[32]。在蚊子中，敲低多个CP基因会导致腿部变薄，并在接触杀虫剂后死亡率升高[29,30,31,32]。RNAi介导的BgCPLCP1基因沉默导致蟑螂的介壳变薄，对β-氰戊菊酯的敏感性增加[56]。虽然这些研究集中在化学杀虫剂上，但物理屏障的原理同样适用：化学杀虫剂主要通过介壳渗透，而真菌则需要物理破坏介壳。因此，我们推测群居幼虫通过MsCPs介导的介壳增厚，增加了真菌菌丝穿透介壳所需的时间和能量成本，从而延迟或降低了真菌成功进入血淋巴的概率。由于昆虫的死亡率取决于真菌进入血淋巴[57]，这种基于介壳厚度的“穿透延迟机制”合理解释了群居幼虫与独居幼虫对B. bassiana的不同敏感性。此外，这种延迟机制可能为体液免疫反应（如酚氧化酶系统和抗菌肽合成）的激活提供了更长的时间窗口，从而产生物理屏障和免疫防御之间的协同效应，从而增强了抗性。

已经证明，通过注射dsRNA/SPc复合物可以有效地敲低MsCP1和MsCP2。虽然注射方法能够精确控制dsRNA剂量并快速实现系统分布，但这种方法劳动强度大，不适合大规模害虫管理。从实际应用的角度来看，口服给药（即将dsRNA/SPc喂给幼虫）更为可行。值得注意的是，最近的一项研究表明，壳聚糖复合的dsRNA可以通过喂食有效地传递给家蚕幼虫，导致显著的基因沉默和死亡率降低[58]。这项开创性工作表明，口服纳米粒形式的dsRNA确实是控制鳞翅目昆虫害虫的一种可行策略。因此，进一步利用口服给药dsMsCPs/SPc来干扰DDP的研究代表了一种针对M. separata的新颖管理策略。

**结论**：本研究确定了两种在群居型M. separata幼虫中高表达的CP编码基因。RNAi介导的敲低实验提供了有力证据，表明这两种MsCPs的上调改变了介壳的超微结构和厚度，这与群居型M. separata对B. bassiana的抗性有关。这些新发现扩展了我们对昆虫DDP的理解，并在成功生物控制M. separata方面具有重要的实际意义。