《Analytica Chimica Acta》：Highly Sensitive m6A Electrochemical Biosensor Based on Laser-Induced Graphene Electrodes Functionalized with DNA Tetrahedron/Gold-antibody Nanoparticle
编辑推荐：
本工作开发了一种基于激光诱导石墨烯电极和DNA四面体修饰的金纳米颗粒-抗体复合物的电化学生物传感器，用于高灵敏检测m6A修饰的RNA。该传感器通过优化电极表面结构和生物探针固定，实现了0.105 pM的检测限，在复杂样本中表现出优异的稳定性和特异性，为便携式临床检测设备提供了新方案。
曹慧燕|程曦|黄莉|张浩天|刘子怡|杨文军|刘松梅|王芳
武汉大学药学院，组合生物合成与药物发现重点实验室（教育部），中国武汉，430071
摘要
背景
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最丰富的内部修饰类型，它在转录后水平上调节基因表达，其失调与肿瘤发生和多种人类疾病密切相关。然而，现有的检测方法（包括高效液相色谱法HPLC）存在明显的缺点，如位点特异性限制、成本高昂、依赖复杂仪器以及操作繁琐，这些因素使得它们不适合用于快速现场检测。因此，开发一种新型的、快速的、现场适用的且成本效益高的m6A检测策略具有重要意义且需求迫切。
结果
本研究开发了一种基于DNA四面体（TDN）和金抗体纳米颗粒（AuNPs-ab）的电化学生物传感器，用于高灵敏度检测m6A-RNA修饰。通过金纳米颗粒修饰提高导电性后，TDN通过Au-S键稳定地固定在电极表面。TDN的刚性结构有助于优化表面平整度和空间构型，从而实现抗体探针的精确锚定。被抗体捕获的目标m6A-RNA经过生物素-链霉亲和素介导的辣根过氧化物酶（HRP）偶联反应，催化过氧化氢–氢醌（H?O?–HQ）氧化还原循环，产生放大的电流信号。该传感器在0.001–100 nM范围内表现出优异的线性响应，检测限为0.105 pM，显示出高特异性和稳定性（15天后信号保留率>88%）。此外，该方法已成功应用于检测添加到人血清中的目标样本以及从肝细胞癌细胞中提取的总RNA。
意义
该传感平台结合了LIG电极的紧凑尺寸和可批量生产的优势，为精确检测肿瘤相关m6A修饰提供了一种新方法，并为一次性、便携式的即时检测（POCT）设备的设计提供了理论基础。它在快速筛选关键表观遗传生物标志物和实时监测多种临床及生物样本方面具有巨大潜力。
引言
广泛研究的表观遗传修饰形式包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA（ncRNA）调控[1]。N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（5mC）是在DNA和RNA中发现的最为广泛研究的表观遗传修饰类型。5mC及其衍生物5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和5-甲酰胞嘧啶（5fC）常见于DNA中；5mC是真核生物中最主要的DNA甲基化修饰类型，而m6A则是RNA中最常见且最丰富的修饰形式之一[2],[3],[4]。m6A通过调节ncRNA的表达和活性，在多种生物过程中发挥基础性作用，包括细胞凋亡、生物钟、免疫耐受、刺激响应和减数分裂，以及人类健康的多个方面[5],[6],[7]。越来越多的研究发现，m6A含基因表达的失调（由于m6A甲基转移酶、去甲基酶或读取蛋白的异常表达）与肿瘤致病性密切相关[8]，例如肝癌[9]、肺癌[10]、妇科恶性肿瘤[11]、急性髓系白血病（AML）[12]等。鉴于m6A修饰在基本生物过程和肿瘤发生中的关键作用，以及现有方法由于m6A丰度极低而难以实现现场、快速和低成本检测的现状，建立精确高效的检测方法对于表观遗传学研究和临床诊断具有重要意义。
近年来，电化学生物传感器因低成本、快速响应和高灵敏度而成为m6A检测领域的研究热点[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20]。通过结合聚合酶链反应（PCR）的等温扩增[14]、量子点光电化学[15]、金属复合材料[17]和CRISPR/Cas12a基因编辑[18]等创新策略，传感器的灵敏度得到了持续提升。在实际应用方面也取得了显著进展，如污染样本检测[19]和智能手机辅助检测[20]。尽管已有显著进展，但电化学m6A生物传感器仍有很大的改进空间。进一步优化电极材料有望显著提高电子转移和探针固定效率，而开发精确可控的识别界面则是实现更高效信号转换的有希望途径[21],[22],[23]。为此，我们介绍了两种先进组件——激光诱导石墨烯（LIG）电极和DNA四面体（TDN）纳米结构，旨在构建能够分析复杂样本的高灵敏度和稳定性的检测系统。
自2014年LIG电极问世以来，作为一种新的传感平台受到了广泛关注[24]。LIG的三维多孔结构不仅为生物分子提供了更多的结合位点，还具有良好的生物相容性，同时增加了电极的有效面积和电子传导效率，从而提高了生物传感器的灵敏度[24],[25]。其最大的优势在于制造过程简单便捷且成本低廉，大大降低了实际应用中的电极成本。
TDN作为一种新型纳米材料，在生物医学领域展现出广阔的应用前景[26],[27]。DNA四面体是通过高温变性下特定序列单链的自组装形成的，具有刚性三维结构、高稳定性和可编程性[28]。其刚性空间结构确保了稳定性，对相应功能分子的精确修饰可实现m6A的特异性捕获[29],[30]。同时，DNA四面体固有的纳米限制效应增强了界面质量传输动力学，减轻了电子转移的立体障碍，为多功能生物分子探针的位点特异性锚定提供了坚实的支架[31]。
本文介绍了一种创新的生物传感器，该传感器采用LIG电极表面镀金以增强导电性，并引入TDN以进一步改善LIG电极的表面平整度。合成的金纳米颗粒-抗体复合物通过抗体与m6A-RNA的特异性结合将目标链固定在电极上，向目标链引入生物素基团，然后通过生物素与链霉亲和素的识别和结合将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP）引入电极表面，从而催化氢醌/过氧化氢（HQ-H?O?）氧化还原系统并产生放大的电化学响应信号。最终，通过从含有m6A目标的响应电流中减去背景电流（无甲基化时的电流）来确定电流差值，该值用于实验结果的定量表示。这种电化学免疫传感平台不仅依赖于镀金纳米颗粒后的LIG基底的高导电性，还依赖于DNA四面体和金纳米颗粒-抗体复合物的定向识别能力，实现了对目标m6A-RNA修饰的高特异性和高灵敏度检测，性能优异。这项工作构建了一种成本低廉、易于操作的一次性检测方案，为未来开发低成本、即用型POCT智能传感技术提供了新的思路。
材料与试剂
聚酰亚胺胶带（PI，55 μm）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）片材从在线商店（淘宝，中国）购买。参比电极用的Ag/AgCl浆料由上海久龙电子科技有限公司（上海，中国）提供。四氯化金三水合物（HAuCl?·3H?O）、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（TCEP）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）、过氧化氢（H?O?）、氢醌（HQ）和牛血清白蛋白（BSA）均从相应供应商处购买。
TDN/AuNPs/LIG的表征
使用扫描电子显微镜（SEM）观察表面形态，结果如图1A-F所示。图1C显示了AuNP沉积后的明显簇结构，证实了它们成功沉积并附着在LIG电极表面（图1A-B）。进一步放大后可见结构细节（图1D），聚集的簇呈柱状，单个树枝状颗粒的直径约为200 nm（测量了50个独立的AuNP簇）（图S2）。
结论
总之，本研究开发了一种基于DNA四面体和金纳米颗粒-抗体结合物的电化学生物传感器，用于检测表观遗传修饰中的m6A。利用LIG多孔三维结构的优异生物相容性，并通过表面镀金修饰提高了其导电性。同时，引入DNA四面体进一步改善了LIG电极的表面平滑度。
CRediT作者贡献声明
程曦：可视化、软件处理、数据分析。黄莉：可视化、软件处理、数据分析。曹慧燕：撰写初稿、可视化、软件处理、方法学设计、实验研究、数据分析。王芳：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。杨文军：资源支持。刘松梅：撰写、审稿与编辑、资源支持、资金获取。张浩天：数据分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了非传染性疾病-国家科学技术重大专项（2023ZD0507700）和国家自然科学基金（项目编号22277094）以及武汉大学中南医院的转化医学与跨学科研究联合基金（ZNJC202302）的财政支持。我们感谢武汉大学的核心设施提供了场发射扫描电子显微镜、X射线光电子能谱仪和拉曼光谱仪的测量支持。
