构建布鲁氏菌S19（Brucella abortus S19）的饱和Tn-Seq文库，用于转座子插入研究以及在多种压力条件下的有效密度分析

《Microbiology Resource Announcements》：Construction of saturated Tn-Seq libraries of Brucella abortus S19 for transposon insertion and effective density analysis across stress conditions

布鲁氏杆菌S19在酸性、氧化应激和抗微生物压力下的基因功能分析采用高密度转座测序技术（Tn-Seq），构建7个条件差异文库，通过比较插入频率和有效密度确定关键基因，揭示适应性进化机制。

　　

摘要

布鲁氏菌（Brucella abortus）是一种具有全球重要性的动物源性病原体。为了探讨其在酸性、氧化和抗菌压力条件下的基因功能相关性，我们在减毒的布鲁氏菌 S19菌株中构建了高密度转座子测序文库。本文介绍了转座子插入频率和有效密度的结果与分析。

公告

布鲁氏菌是一种兼性细胞内寄生动物源性病原体，必须具有高度适应性，以应对细胞内的压力环境，包括酸性、氧化应激和抗菌物质的作用（1–4）。本研究利用下一代测序技术（Tn-Seq [5, 6）对转座子插入突变体文库进行分析，以确定减毒布鲁氏菌 S19基因组中的关键和重要基因，并比较了在不同条件下获得的转座子插入的丰富度和数量（表1）。

表1

表1 布鲁氏菌 S19 TnSeq文库概要

	文库1	文库2	文库3	文库4	文库5	文库6	文库7
生长和压力条件
生长条件	2YT液体培养基，15小时	2YT液体培养基，14小时	2YT液体培养基，17小时	2YT平板培养基，48小时	2YT平板培养基，48小时	2YT平板培养基，48小时
压力条件	不适用	pH 4.5，2小时	1.25 mM H2O2，1小时	不适用	25 μg/mL 多粘菌素	0.3 μg/mL 氨苄西林	100 μg/mL 头孢舒林
文库测序指标
映射到布鲁氏菌 S19的Tn含读段数量	40,575,958	28,790,726	35,263,787	6,257,371	19,003,077	27,624,241	29,924,858
覆盖率	1,124.39	797.81	977.18	173.40	526.59	765.49	829.24
最大Tn读段/开放阅读框（ORF）数量	2,282,625	2,360,933	3,536,248	685,152	1,488,431	1,907,135	2,119,624
平均Tn读段/ORF数量	11,974.18	8,540.44	10,446.11	1,890.83	5,683.24	8,267.12	8,826.69
独特Tn插入/ORF总数	556,658	552,615	584,475	257,101	436,913	534,179	511,887
独特Tn插入/ORF的最大数量	2,181	2,317	2,633	1,179	1,618	1,925	1,816
平均独特Tn插入/ORF数量	175.16	173.89	183.91	80.90	137.48	168.09	161.07

^a

所有培养物均在37°C下生长。所有文库均来自在含有50 μg/mL卡那霉素（Kan50）的2YT培养基中培养2天后的样本。每个文库使用了7个150 mm平板的刮取物，重新悬浮在2YT培养基中，代表一个生物学重复实验。每个文库的突变体总数约为67,800–220,000个，来自包含至少122万个突变体的主文库。文库1–3在含有500 mL 2YT Kan50的培养基中稀释1:2,000，并培养过夜，直到OD₆₀₀值增加两到三倍。细胞通过离心（7000 rpm，15分钟）收集，并暴露于指定的压力条件下。文库4在初始在2YT Kan50培养48小时后立即进行DNA提取。文库5–7稀释1:100并接种在含有指定压力条件的150 mm 2YT平板上。所有平板培养2天后，刮取样本，按条件合并，并重新悬浮以进行DNA提取。

^b

2YT培养基用醋酸缓冲。

^c

所有材料均使用玻璃制品制备（移液管尖端和培养皿除外），以减少塑料的结合。

^d

读段经过转座子特异性引物序列的筛选，然后进一步修剪去除前26个碱基对，并映射到布鲁氏菌 S19染色体I（NC_010742.1）和II（NC_010740.1）的NCBI参考基因组上。

^e

覆盖率计算方法为：[[读段长度（91 bp（150 bp - Tn引物序列和前26 bp）] × 读段数量] / 3283936 bp（布鲁氏菌 S19基因组大小）。

^f

ORF包括tRNA、rRNA和核糖开关。

有关Tn-seq文库构建的完整方法，请参见https://doi.org/10.17504/protocols.io.n92ldr478g5b/v1。简要来说，通过将大肠杆菌二氨基庚二酸（DAP）缺陷型菌株MFD pir（7, 8）（含有pXMCS-2-miniTn5-Km (9)与布鲁氏菌 S19（10）的过夜培养物混合，在含有0.3 mM DAP的2× Yeast-Tryptone（2YT）平板上的0.22 μm聚乙砜过滤器上进行杂交。杂交产物收集在含有50 μg/mL卡那霉素（Kan50）的2YT培养基中并计数。主TnSeq文库含有1.22–2.35 × 10⁶个Tn突变体/mL，在2YT Kan50平板上培养2天后收集，然后将悬液分成7个突变体文库（文库1–7），并按照表1中的描述进行处理，随后按照推荐的协议进行酚-氯仿DNA提取（11）。

Illumina文库是使用适用于Illumina DNA Prep试剂盒的改编方案从文库1–7制备的（https://doi.org/10.17504/protocols.io.5qpvo9ewdv4o/v1）。DNA使用Thermo Scientific Nanodrop 2000c进行定量，并稀释至500 ng的核酸酶-free H₂O中。文库用珠连Tn5转座酶标记，以分离基因组DNA并连接Illumina接头。标记后的文库经过三轮嵌套PCR扩增含转座子的片段（图1A）。最终的Illumina文库使用Qubit荧光计（Invitrogen）和Qubit HS dsDNA检测试剂盒进行定量，并通过Fragment Analyzer自动化电泳检查完整性（Agilent Technologies）。每个文库加载到Illumina NovaSeq X Plus S4 Flow Cell – PE 150上，生成150 bp的双端读段。有关生物信息学分析的方法，请参见https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgbrjwnlpk/v1。

图1

图1 布鲁氏菌 S19 Tn-Seq文库构建和分析流程的概述，识别了条件性必需、有益和有影响力的基因。（A）转座子（Tn）突变体文库构建示意图。布鲁氏菌 S19 Tn5（圆基因组中的红色条形）插入突变体经过选择、合并后分成七个不同生长条件的转座子突变体文库。每种生长条件后的细菌DNA被提取并用珠连转座体（BLTs）标记，并同时连接接头。DNA上的红色框表示Tn5转座子序列。使用Illumina DNA Prep试剂盒和定制引物进行三轮嵌套PCR反应：（i）使用Tn5和Adaptor 1特异性引物富集Tn序列及相关基因组DNA（gDNA）；（ii）使用Adaptor 1和2特异性引物恢复完整的接头序列；（iii）添加独特的索引对和标准的Illumina测序引物。完整的实验方法可在protocols.io上的数据可用性部分找到。（B）箱线图显示了布鲁氏菌 S19基因组中每个基因的总独特Tn插入次数。平均插入密度因条件而异，平板条件下的密度最低。（C）散点图显示了所有七个文库中每个基因的计算Tn有效密度，按基因组碱基对位置显示。处理颜色如B面板所示。较低的有效密度值反映了每个基因内Tn插入的较少。（D）代表性散点图比较了酸处理和未处理布鲁氏菌 S19 TnSeq文库中每个基因的有效密度对数2倍差异。有效密度标记为红色的基因在酸条件下具有适应性优势（log2倍值 > 1）或必需性（log2倍值 < ?1）。（E）代表性线性回归图显示了酸处理和未处理布鲁氏菌 S19 TnSeq文库中每个基因的Tn有效密度。虚线表示理想模型，即条件之间没有差异；蓝线表示拟合有效密度数据的模型。使用Cook’s距离异常值分析识别出不符合拟合线的基因。异常值（截止值 > 总基因数）对回归有影响，并用红色标记。在B–E面板中扩展的数据可在Data Availability中找到。

表1和图1A和B总结了用于生成TnSeq文库的条件和测序结果。TnDivA (6)用于确定转座子插入的有效密度，从而可以在不同条件下对高度饱和的Tn文库中的Tn丰富度进行多重统计比较（图1C）。例如，有效密度比率的对数2倍变化揭示了条件性必需基因（图1D）。每个基因的有效密度使用线性回归模型绘制，然后通过Cook’s距离异常值分析来确定影响回归的基因（图1E）。这组丰富的数据可用于探索病原体布鲁氏菌在多种条件下的遗传适应性。

致谢

我们感谢Jerod Skyberg博士提供的布鲁氏菌 S19菌株、实验室使用权限，以及允许Emily Knebel博士在其批准的生物安全等级2协议下参与这项工作。我们感谢Xavier de Bolle博士提供的大肠杆菌 MFD ?dap缺陷型供体菌株和pXMCS-2-miniTn5-Km载体。密苏里大学基因组技术核心和印第安纳大学基因组与生物信息学核心支持了这项项目。

E.K.得到了NIH T32 OD011126项目的资助。密苏里大学研究办公室、研究生院和经济发展办公室提供的DNA Core Tier 1 NovSeq拨款支持了与这项工作相关的测序费用。