表面现象：通过皮肤和水溶性糖皮质激素采样揭示幼年小海妖（Siren intermedia）中皮质醇的主导作用 梅根·弗拉纳根（Megan Flanagan）、 托马斯·卢林（Thomas Luhring） 凯特琳·R·加博尔（Caitlin R. Gabor）

《Conservation》：Skin Deep: Cortisol Dominance in Juvenile Lesser Sirens (Siren intermedia) Revealed by Dermal and Water-Borne Glucocorticoid Sampling Megan Flanagan, Thomas Luhring and Caitlin R. Gabor

　　摘要：在脊椎动物中，皮质酮和皮质醇是糖皮质激素（GC）类固醇激素，对脊椎动物的应激反应至关重要，但它们的相对作用取决于环境和生活史。我们利用水传播的激素采样技术对Siren intermedia这种小型水螈进行研究，以探讨在应激反应中皮质酮或皮质醇哪个占主导地位，并评估皮肤分泌物是否能可靠地反映皮质酮的急性变化。首先，我们在手部束缚这种应激处理后的2小时内通过皮肤拭子法测量皮质酮水平。在2小时的采样期间，皮肤中的皮质酮水平没有相对于应激前的基线水平升高，这表明皮肤测量可能无法反映循环中的急性GC变化。随后，我们使用水传播采样技术在幼体中测量了皮质醇和皮质酮的水平（包括基线期、应激期和恢复期）。结果发现，皮质醇的释放率显著高于皮质酮，并且在恢复期相对于基线有所升高（p = 0.08），而应激期间的样本与基线没有差异。此外，皮质醇的释放率与温度呈正相关，而温度对皮质酮没有影响。尽管皮质醇和皮质酮之间存在强相关性，但皮质醇会对环境温度作出反应并且具有重复性，而皮质酮则不具备这一特点。最后，我们验证了水传播采样技术在S. intermedia中测量皮质醇和皮质醇的有效性。结果表明，在幼体中皮质醇更为敏感于环境变化。综合这些发现，皮质醇是更受环境影响的GC类固醇激素，而水传播采样方法对于评估该物种的急性应激生理状态更为可靠。

1. 引言
糖皮质激素（GCs），特别是皮质酮和皮质醇，是脊椎动物应激反应中的核心激素。在脊椎动物体内，它们通过下丘脑-垂体-肾上腺/肾（HPA/I）轴释放，并与糖皮质激素和盐皮质激素受体结合来调节下游过程[1,2]。在急性应激期间，GCs会动员能量并抑制非必需功能（如生长和繁殖），而HPA/I轴的长期激活则与免疫抑制、繁殖能力下降及长期健康成本相关[3,4,5,6]。在两栖动物中，糖皮质激素还参与关键的发育过程，包括变态的时间调控。由于其广泛的生理作用，GCs被广泛用作健康和环境压力的生物标志物[7,8]。然而，仅凭基线GC释放率无法完全反映生物对外部压力的反应。了解生物的应对能力有助于将这些生理反应置于具体情境中考虑。应对能力指的是生物在环境压力下维持稳态并支持生存和繁殖的生理和行为灵活性[9]。具有强大应对能力的个体能够启动应激反应，并在威胁过去后有效调节负面反馈反应，从而避免慢性压力的有害影响[10]。根据应激的反应范围模型，较短的急性应激反应可以降低反复或长期压力因素导致表型损伤的可能性。有效的负面反馈有助于增强应激反应的能力，同时限制病理后果。相反，如果没有适当的恢复，反复暴露于压力下会导致长期累积性的损伤[11]。通过测量GC谱（如基线期、应激期和恢复期），我们可以了解生物的韧性，并评估其应激反应何时从适应性转变为适应不良。此外，对同一个体进行多次GC测量可以评估其应激反应的可重复性。GC可重复性有助于了解动物对变化环境的响应能力，并提供某一性状的遗传上限估计[12,13]。在两栖动物中，确定哪种激素最能反映应激反应和恢复情况对于评估其应对能力至关重要。传统上认为皮质酮是两栖动物中的主要应激激素，因为许多物种中的皮质酮浓度高于皮质醇[12,14,15]。因此，大多数两栖动物研究都集中在皮质酮上[16,17]。然而，新的证据对这一假设提出了挑战，在完全水生的Cryptobranchus alleganiensis中，皮质醇而非皮质酮是应激反应中的主要升高的激素[18]。同样，在几种毒蛙（Dendrobates spp.）的研究中，水传播样本中的皮质醇释放率也高于皮质酮。此外，在Dendrobates tinctorius中，蝌蚪阶段的皮质酮水平显著高于皮质醇。在成年个体中，皮质酮和皮质醇的数量几乎相等，这表明需要跨多个阶段进行的环境依赖性研究[19,20]。此外，在完全水生物种中，皮质醇可能更为丰富，类似于主要依赖皮质醇的鱼类[21,22,23]。然而，这些模式可能反映了比单一栖息地预测更复杂的调节机制，因为完全水生的Xenopus青蛙表现出皮质酮的优势[24]。这些发现使得跨分类群概括应激生理学变得复杂，强调了针对特定物种（皮质醇或皮质醇）进行评估的必要性。尽管代表性研究已记录了大多数蝾螈亚目的GCs情况，但Sirenoidea亚目却尚未得到充分研究。Siren intermedia属于Sirenidae科，该科是所有其他蝾螈科的姐妹群[25]。因此，它们独特的进化史使得Sirenidae成为探索不同两栖动物群体中GC谱的宝贵研究对象，有助于更好地理解两栖动物中GC调节的差异。

Siren intermedia是一种大型完全水生蝾螈，在美国东南部的湿地中种群密度很高[26,27]。尽管它们具有重要的生态意义，但对其应激生理学知之甚少。明确哪种GC在应激下更显著升高对于研究其应对环境变化的能力至关重要。此外，鉴于某些水生脊椎动物表现出不同的GC优势模式，这个问题尤为重要。非侵入性采样方法在研究两栖动物类固醇激素方面越来越重要，尤其是用于评估应激生理学，因为这种方法无需对个体实施安乐死（在某些情况下，由于体型原因必须进行血液采样）。水传播激素采样技术被广泛应用于水生和半水生物种，提供了GCs的全面测量[7]。这种方法已在许多成年和幼年两栖动物物种中得到充分验证（例如血浆和水传播激素之间的相关性[12,28]）。该方法特别有价值，因为它可以反复对体型过小而无法抽血的个体或受威胁/濒危物种进行测量。然而，水传播采样可能需要数小时才能完成，并且需要运输大量水和适当大小的容器，这在野外条件下对大型物种来说操作较为复杂，相比之下，非侵入性拭子法更为便捷。由于S. intermedia会产生大量黏液，并且体型变化很大（从40毫米的蝌蚪阶段到68.6厘米的成年个体[29]），水传播激素收集方法可能较为困难，因为需要较大的容器和更多的水来获取成年个体的激素样本。皮肤拭子法可能是一种更快且劳动强度更低的替代方法。然而，这种方法尚未得到充分验证，目前尚不清楚拭子样本反映的是整体激素释放还是皮肤表面的短暂分泌情况，因此其是否能有效评估应对能力尚不明确。结果不一：某些物种（如Pyxicephalus edulis、Ambystoma tigrinum和A. laterale）中，皮肤拭子法得到了生理和生物学上的验证，但在其他物种（包括Cryptobranchus alleganiensis和Notophthalmus viridescens）中则未通过验证[30,31,32]。重要的是，水传播激素采样反映了随时间累积的激素释放情况，而皮肤拭子法可能更多捕获皮肤表面的局部或短暂激素分泌。这种区别对于解释这两种方法之间的差异至关重要。总之，这些发现突显了直接比较这两种方法在两栖动物中的实用性。

在这项研究中，我们在Siren intermedia急性应激后采集皮肤拭子，以评估拭子法作为一种非侵入性方法测量皮质酮的有效性。我们还测量了个体的GC谱，并通过水传播技术检测了皮质酮和皮质醇，以探讨该物种中的主导应激激素。具体来说，实验1评估了皮肤拭子法是否能可靠地检测到急性皮质酮反应。实验2使用经过验证的水传播技术在幼体中比较了皮质醇和皮质酮的释放率，从而可以在特定的发育阶段评估激素的优势，并将其与其他分类群的观察结果进行比较。鉴于硬骨鱼类中皮质醇主导的应激反应[22]以及其他完全水生蝾螈的新证据[18]，我们假设Siren intermedia中的皮质醇参与度会比两栖动物通常的情况更高。在这种情况下，我们预测皮质醇的释放率会高于皮质酮。我们还预测，鉴于某些蝾螈中拭子法的局限性[32]以及水传播技术在多种水生分类群中的成功应用[7,23]，水传播方法将更可靠地测量GCs。通过测量GC谱和评估非侵入性采样方法，本研究为S. intermedia建立了特定物种的GC谱，并为开发可靠的、低侵扰性的两栖动物监测工具提供了依据。此外，对Sirenoidea亚目这种研究不足的亚目进行GC谱测量也有助于更全面地理解两栖动物中GC调节的差异。

2. 材料与方法
2.1 实验1：皮肤拭子法
为了探讨皮肤拭子法是否能有效测量水生蝾螈S. intermedia在应激下皮质酮的释放率，我们在2023年7月14日至2023年7月22日期间从德克萨斯州Davy Crockett国家森林的两个池塘中收集了14只Siren intermedia。我们使用鱼笼、小型渔具和改良的垃圾桶陷阱捕捉这些蝾螈，并每天早上7:00检查陷阱。由于使用了多种陷阱类型，因此捕获的蝾螈大小不一。Siren intermedia的平均体重为20.34 ± 7.56克（范围：9.5–39.7克），平均总长度为211 ± 21.57毫米（范围：178–267毫米）。对于每只蝾螈，我们记录了将它们从陷阱转移到首次采样之间的时间。温度数据由安装在池塘底部的HOBO数据记录器（Onset Computer Corporation，美国波恩）记录，每小时记录一次。我们使用捕获时的温度作为参考。皮肤拭子法的操作主要遵循Santymire等人的方法[31]；简而言之，我们在拭子前用蒸馏水冲洗了蝾螈。捕获后4分钟内，我们使用Puritan无菌棉签从蝾螈背部擦拭5次，覆盖50毫米的区域。我们将拭子样本放入含有1毫升70%乙醇的微离心管中，并将其冷藏在-4°C条件下备用。在整个激素采样过程中我们佩戴手套以防止人为污染，并为每个个体更换手套。在“预应激”样本之后，我们将蝾螈暴露于手动束缚的应激中5分钟。5分钟后，我们再次进行皮肤拭子采样，这被称为“0分钟”样本。我们在应激后0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟和120分钟时分别采集皮肤拭子样本。每只蝾螈总共进行了8次采样，然后记录其体重。从拭子中提取皮质酮的方法采用了Neely等人[34]的改良版本：我们将1毫升乙醇和拭子本身转移到13毫升的硼硅酸盐试管中，用750微升70%乙醇清洗微离心管四次，然后将剩余物质加入含有拭子的试管中。最后，我们再加入2毫升70%乙醇，使每个培养管的总体积达到6毫升。我们摇晃样本5分钟以释放拭子中的激素残留物，然后用预先用乙醇清洗的镊子取出拭子，并将其与20毫升蒸馏水混合在干净的烧杯中，最终体积达到26毫升。我们使用C18固相萃取柱（SepPak Vac3 cc/500 mg；Waters, Inc.，美国米尔福德）进行提取。在样品通过SPE之前，我们先用4毫升HPLC级甲醇和4毫升蒸馏水对固相萃取柱（SPEs）进行预处理。之后，我们将4毫升蒸馏水通过SPE（固相萃取柱）处理。我们在SPE下方放置了试管，并加入4毫升甲醇以将激素从SPE中洗脱到试管中。洗脱完成后，我们将样本放入设置为37°C的水浴中并通入轻微的氮气流进行干燥。干燥后，我们将样本储存在-20°C直到用于接种实验。我们使用25微升95%乙醇和475微升酶免疫测定（EIA）缓冲液将样本重新悬浮至500微升。重新悬浮后，我们摇晃样本90分钟，然后使用Corticosterone EIA试剂盒（Cayman Chemicals Inc. #500360，美国密歇根州安娜堡）将样本接种成两份。我们使用设置为405纳米的BioTek ELX800 plate reader（Biotek Instruments Inc.，美国佛蒙特州维努斯基）分析样本。在4个平板上，板间变异率为12.66%，板内变异率在6.29%到15.73%之间。

为了了解皮质酮在受到处理压力后2小时内的变化情况，我们使用R语言中的lme4包拟合了线性混合效应模型（LMMs）。该模型包括一个随机截距，表示个体（ID），该个体嵌套在池塘中，以解释个体的重复测量结果以及来自同一池塘的个体之间的非独立性。我们将“处理前”样本编码为-1，以反映其时间零点（即束缚后立即）的状态，从而将时间（8个水平：-1、0、15、30、45、60、90和120分钟）视为以压力暴露为中心的连续预测因子，以保持统计功效，因为如果将时间视为分类变量会导致功效降低。我们没有发现体重或从捕获到采样的时间对结果有显著影响，因此将这些变量从最终模型中排除。我们还使用了AICc比较了包含体重和时间交互作用的模型与仅包含时间的模型，并保留了拟合效果最好的时间模型。我们通过将拭子中的皮质酮浓度（pg/mL）乘以重新悬浮量（0.5 mL）来计算皮质酮的最终浓度单位（pg/样本）。为了满足正态性和同方差性的假设，我们对皮质酮值进行了自然对数（ln）转换。由于我们擦拭了皮肤的背面5次，覆盖了50毫米的面积，不论个体大小如何，因此没有根据体重进行校正。我们使用emmeans包进行了时间点之间的事后配对比较，并应用了假发现率（FDR）校正来控制多重比较。所有分析都是在R版本（4.4.2）中进行的，统计显著性在0.05水平上评估。模型假设通过检查残差图和Q-Q图来评估。

2.2. 实验2：通过水样采样比较皮质醇和皮质酮
为了比较幼年西雷尔蛙（Sirens）中的皮质醇和皮质酮这两种激素应激指标，我们在2023年5月27日至7月30日期间从德维·克罗克特国家森林（Davy Crockett National Forest，德克萨斯州）的三个地点收集了18个个体。其中一个地点在实验1中也被使用过，但没有个体在两个实验之间重复使用。我们测试的西雷尔蛙都是幼体，平均总长度为77.32 ± 30.21毫米（范围：40–200毫米）。我们选择研究幼体是因为主要的糖皮质激素在生命阶段的水平会发生变化，将采样限制在单一阶段可以让我们获得足够的样本量来稳健地表征幼体的激素特征。我们使用抄网捕获幼年西雷尔蛙，并立即将它们带到激素测定区域。我们记录了西雷尔蛙被从抄网中取出以及直到我们将它们转移到激素采样区之间的时间。对于每个西雷尔蛙，我们测量了三次水中的激素水平，以获得它们的基线、应激和恢复期的激素谱。

为了收集激素，我们遵循了Gabor等人[7,12,35]和Forsburg等人[7,12,35]建立的方法。我们将每个西雷尔蛙放入一个有孔的小容器（141.75克）中，然后将这个容器放入另一个相同大小的容器中。我们使用150毫升的泉水完全淹没西雷尔蛙以进行所有样本的测量。对于基线水样中的激素，西雷尔蛙在水中保持1小时。一小时后，我们移除了有孔的插片，这样就可以轻松地将动物从样本中取出而不需要接触样本或个体本身。基线样本之后，西雷尔蛙被转移到第二个相同大小的容器中。在整个采样小时内，我们每3分钟摇晃一次装有动物的容器，以获得应激样本。这种协议模拟了水流和湍流的物理扰动，就像在风暴事件中一样。最后，我们取出个体并将它们放入第三个容器中，按照Bókony[36]的方法进行1小时的恢复期采样。我们在06:30到10:30之间测量水中的激素水平。在整个过程中我们戴着手套，以防止皮肤上的激素污染样本。样本随后被放在冰上并运回实验室。样本在-20°C下储存，直到后续处理。激素采样后，我们测量了个体的总长度（毫米）。处理完成后，西雷尔蛙被释放到它们被捕获的地方附近。

为了从水样中提取皮质醇和皮质酮，我们先解冻样本，然后使用咖啡过滤器（类似于4级过滤器）过滤两次。我们使用C18固相萃取（SPEs）柱（SepPak Vac3 cc/500 mg；Waters, Inc., 密歇根州米尔福德）通过真空 manifold从水样中提取类固醇[35]。我们使用与擦拭样本相同的方法对SPEs进行清洁和干燥。我们使用50微升乙醇和950微升EIA缓冲液将样本重新悬浮至1000微升。重新悬浮后，我们摇晃样本90分钟，然后将样本分别接种在皮质醇和皮质酮EIA试剂盒（Cayman Chemicals Inc.，#500360用于皮质醇，#501320用于皮质酮，美国密歇根州安娜堡）上。我们使用设置为405纳米的BioTek ELX800 plate reader（Biotek Instruments Inc., 美国佛蒙特州维努斯基）分析样本。皮质醇的板间变异率为7.53%，板内范围在2.56–4.21%之间；皮质酮的板间变异率为9.34%，范围在0.21–8.57%之间。根据Cayman Chemicals的报告，皮质酮的检测灵敏度为30 pg/mL，皮质醇为35 pg/mL。我们分别使用LMMs分析皮质醇和皮质酮的释放率，以评估压力暴露对激素的影响。我们通过将1小时内测得的水中激素水平乘以重新悬浮量再除以个体的总长度（pg/mm/h）来计算释放率。我们对激素浓度（pg/mm/h）进行了ln转换，并包括了固定效应和样本类型作为分类变量，样本类型有三个水平：基线、应激和恢复期。我们还将温度作为连续固定效应包括在内。为了考虑潜在的个体间差异，我们在每个模型中加入了西雷尔蛙ID作为随机截距。我们使用R语言中的lme4包（版本4.4.2）的lmer函数拟合模型。我们使用AICc比较了包含温度和样本类型交互作用的模型和仅包含时间的模型，结果表明包含交互作用的模型并没有显著改善拟合效果；因此，我们保留了更简单的加性模型。当检测到样本类型的显著主效应时，我们使用emmeans包的emmeans函数进行了事后配对比较，并应用了假发现率（FDR）校正来控制多重测试。模型假设通过检查残差图和Q-Q图来评估。

3. 结果
3.1. 实验1：皮肤拭子采样
在急性手动束缚压力之前，皮肤拭子中的皮质酮浓度平均为5.56 ± 0.14 pg/样本（图1，表1）。时间自压力暴露以来的长度并未显著预测ln转换后的皮质酮浓度（t = ?0.12，p = 0.90），并且没有压力后时间点与压力前基线有所不同（图1，表1）。因此，在120分钟的采样窗口内，我们没有检测到皮质醇对手动束缚压力的显著急性反应。图1显示了西雷尔蛙在受到急性手动束缚压力前后的皮肤拭子中的皮质酮浓度（pg/样本）（n = 14）。小提琴图展示了每个采样时间点（压力前、0、15、30、45、60、90和120分钟）的皮质酮值分布。嵌入式箱形图显示了中位数和四分位数范围，黄色点代表模型估计的平均值。皮质酮浓度在不同时间点之间没有显著差异（p = 0.90），表明没有检测到对手动束缚挑战的显著急性内分泌反应。表1。在暴露于急性手部束缚应激源之前和之后，皮肤样本中皮质酮（pg/样本）对数值的线性混合效应模型的结果。3.2 实验2：通过水传播采样比较皮质醇和皮质酮我们发现，在个体内部，平均水传播皮质醇和对数皮质酮释放率之间存在强烈的正相关（r = 0.83，df = 16，t = 5.84，p < 0.0001，图2）。个体内的皮质醇释放率显著高于皮质酮（t17 = 6.17，p < 0.0001，图3）。皮质醇释放率在不同采样时间点具有重复性（r = 0.233 ± 0.100，95% CI: 0.024, 0.416；p = 0.0039），而皮质酮释放率则不具有重复性（r = 0.152 ± 0.142，95% CI: 0.0, 0.468；p = 0.215）。图2. 小型海牛（n = 18）中皮质醇和对数皮质酮（pg/mm/h）水传播释放率之间的关系。阴影区域代表95%置信区间。每个点代表可用样本中个体平均皮质醇和对数皮质酮值。皮质醇和对数皮质酮之间存在强烈的正相关（p < 0.0001）。图3. 小型海牛（n = 18）中平均皮质醇和皮质酮（对数 pg/mm/h）水传播释放率之间的关系。每个点代表个体在基线、应激和恢复期样本中的平均激素释放率。线条连接同一个体内的配对激素测量值，展示了个体内的差异。个体内的皮质醇释放率高于皮质酮（p < 0.0001）。对于皮质醇，温度和样本类型影响了释放率（表2）。在考虑温度后，样本类型解释了有限的额外变化：恢复期的皮质醇水平相对于基线略有升高，如事后对比所示（成对比较：估计值 = –0.235 ± 0.101，t(30.2) = –2.32，p = 0.08，图4），而应激样本与基线没有显著差异（p = 0.24）。个体的随机截距解释了大部分个体间的变异（SD = 0.74）。对于皮质酮，样本类型和温度均未预测到释放率（表3）。个体间变异很小（SD = 0.13），固定效应对模型方差的解释作用很小。表2. 皮质醇（对数 pg/mm/h）释放率在样本类型（基线、应激和恢复期）和温度下的线性混合模型结果。截距代表基线样本中的个体。p < 0.05的效应用*表示。图4. 调整温度效应后，不同样本类型（基线、应激和恢复期样本；n = 51）中皮质醇（对数 pg/mm/h）释放率的结果。连接的字母代表成对比较的结果。发现的差异具有边际显著性（p = 0.08）。表3. 皮质酮（对数 pg/mm/h）水传播激素释放率在样本类型（基线、应激和恢复期）和温度下的线性混合模型结果。截距代表基线样本中的个体。温度对激素应激反应和负反馈有特定的影响。对于应激反应，温度与激素类型有显著交互作用（图5）。皮质醇样本的应激反应明显高于皮质酮样本（估计值 = 2.36 ± 0.15，p < 0.0001）。温度对皮质酮的应激反应没有显著影响（估计值 = ?0.07 ± 0.08，p = 0.35）。皮质醇的应激反应与温度呈正相关（估计值 = 0.16 ± 0.04，p < 0.0018，图5）。图5. 暴露于应激源和温度时皮质酮和皮质醇（对数 pg/mm/h）释放率之间的关系。皮质醇用黄色表示，皮质酮用蓝色表示（n = 16个个体的32个观测值）。阴影区域代表95%置信区间。温度与激素类型在预测应激反应方面有显著交互作用。皮质醇的应激反应高于皮质酮（p < 0.0001）。温度对皮质酮的应激反应没有显著影响（p = 0.35），而皮质醇的应激反应随温度升高而增加（p < 0.0018）。负反馈在皮质醇中表现出类似的温度依赖性模式。负反馈随温度增加而增加（Temp × Hormone: 估计值 = 2.57 ± 0.36，p < 0.0001，图6）。这导致在超过25°C的温度下皮质醇的负反馈估计值更高（估计值 = 0.27 ± 0.09，p = 0.01）。温度对皮质酮的负反馈没有显著影响（估计值 = 0.06 ± 0.07，p = 0.38）。图6. 皮质酮和皮质醇（对数 pg/mm/h）负反馈与温度之间的关系（n = 16个个体的32个观测值）。皮质醇用黄色表示，皮质酮用蓝色表示。阴影区域代表95%置信区间。温度与激素类型在预测负反馈方面有显著交互作用。皮质醇的负反馈随温度增加（p = 0.01），而皮质酮的负反馈随温度变化不大（p = 0.38）。4. 讨论收集皮质激素的方法和测量的具体激素对检测到的激素数量及其对压力的响应性有显著影响。使用皮肤拭子测量的皮质酮浓度未能检测到对手部束缚挑战的急性反应，而水传播采样则揭示了皮质醇和皮质酮动态之间的明显差异。在幼年海牛中，从水传播样本中测量到的皮质醇和皮质酮之间存在强烈的正相关，表明它们具有共同的生理调节机制。然而，皮质醇的释放率显著更高，并且是唯一随温度或采样类型（基线、应激或恢复期）变化的激素。水传播的皮质醇与温度呈正相关，随着温度的升高，应激反应的幅度和负反馈都会增加。皮质酮的应激反应和负反馈没有显示出可检测的温度依赖性。这些结果表明，在这种物种的幼体中，皮质醇可能比皮质酮更敏感于短期环境变化。众所周知，甲状腺激素对温度非常敏感，这反映了环境温度对外温动物代谢率、内分泌活动和下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的强烈影响[40]。我们还发现，只有皮质醇释放率在不同采样类型间具有重复性。这些发现共同支持了一个框架，即皮质醇和皮质酮以不同但重叠的方式参与应激调节，其中皮质醇介导了S. intermedia的快速、情境依赖的响应。我们未能通过针对皮质酮的皮肤拭子检测到急性应激的影响。尽管手部束缚方案可能没有在S. intermedia中引发强烈的皮质酮反应，但更广泛的证据表明，这种变化缺失也可能归因于皮肤拭子采样的局限性。值得注意的是，个体在束缚期间表现出频繁的扭动和逃避行为，表明该方案引起了行为应激反应，尽管没有检测到皮肤皮质醇释放率的变化。然而，本研究没有对行为反应进行量化，未来包含系统行为测量的工作将有助于确认与此方案相关的行为应激反应的程度。在北方豹蛙（Lithobates pipens）和东部红点蝾螈（N. viridescescens）中也报告了类似的急性应激反应缺失现象，即使注射了促肾上腺皮质激素，皮肤皮质酮也没有增加，尽管预期其体内循环水平会升高[32]。这种模式与已知的生物学机制一致：在人类和其他脊椎动物中，角质形成细胞通过独立于HPA/I轴的途径在局部合成皮质醇[32,41,42]，这意味着皮肤激素水平可以与循环浓度部分解耦。水生蝾螈的厚黏膜层可能会延缓或调节激素在表皮和周围水之间的扩散，从而降低皮肤拭子检测急性变化的能力。因此，皮肤拭子无法检测到急性反应可能是由于采样限制，可能包括局部皮肤合成和厚黏膜层的稀释作用，而不是皮质酮反应性的缺失。然而，我们没有从皮肤拭子中测量皮质醇，因此不能排除这种方法的有效性。总的来说，现有证据支持这样的观点：方法学限制而不是生理反应性的缺失导致了通过皮肤拭子无法检测到皮质酮反应的现象。水传播的皮质醇释放率显著高于皮质酮，并且在不同样本类型间存在差异。皮质醇也与温度呈正相关，而皮质酮则没有这种关联，表明皮质醇可能更受S. intermedia环境调节的影响。较高的皮质醇释放率与其他两栖动物（如C. alleganiensis和几种毒蛙物种）的结果一致，在这些物种中皮质醇也是主要的糖皮质激素[18,19]，这挑战了长期以来认为皮质酮是两栖动物主要应激激素的假设。值得注意的是，在Cryptobranchoidea和Sirenoidea亚目中也发现了皮质酮优势地位的例外。这种模式提出了皮质醇优势可能表征某些早期分支的蝾螈谱系的可能性，尽管验证这一假设需要更广泛的系统发育采样。这些发现共同表明，Siren intermedia的幼体表现出以皮质醇为主的糖皮质激素特征，强调了在解释激素功能时考虑物种特异性观点的重要性。这种模式可能反映了（1）与完全水生生活方式的关联，这与许多水生脊椎动物一致；（2）某些谱系内的进化保守性；或者（3）物种特定的生理或生态因素，这些因素不能仅通过栖息地或分类学来预测。需要进一步的研究来探索这些假设，因为我们没有对成年海牛进行测试。尽管皮质醇似乎是该物种幼体的主要反应物，但在未来研究中测量这两种激素（尽管成本较高）可能有助于阐明潜在的功能差异或情境依赖的角色。例如，在蝌蚪中，皮质醇通常在发育过程中增加，并在接近变态高峰时达到最高水平，在那里它与甲状腺激素相互作用以驱动组织重塑[43]。幼年两栖动物可以在发育早期抑制皮质酮升高，从而避免过早变态，从而减少潜在的不利发育成本[44]。小型海牛是幼态持续的，终生保留幼体特征，但它们仍然会经历部分变态，涉及皮肤重构和背鳍退化[45]。比较水传播研究中的所有个体都是幼体，因为它们相对较小（<200毫米）。这些个体的皮质醇反应性降低可能反映了较低的HPA轴活性和甲状腺敏感性，这些都是幼态持续物种的特征[46]。皮质醇在幼体中的优势表明，这一生命阶段的应激反应可能更依赖于皮质醇介导的途径，尽管在没有直接测量甲状腺轴的情况下这种解释仍然是推测性的。高水平的皮质酮可以主动对抗幼态持续现象，如在兼性幼态持续的蝾螈Ambystoma talpoideum中，随着皮质酮暴露的增加，幼态持续的频率下降[47]。通过将应激反应转向皮质醇，海牛可能能够在不激活皮质醇相关途径的情况下启动和调节应激反应。这些途径可能受到其强制幼态持续生活史的限制。在这个框架内，重复性提供了生理特征一致性的见解，并经常被解释为遗传性的上限估计，反映了特征对选择的响应潜力[13]。在幼年海牛中，皮质醇释放率在不同采样事件间具有重复性，而皮质酮则没有。这种模式表明皮质醇在这个生命阶段代表了一个更稳定的、个体水平的特征，并进一步支持皮质醇是幼年海牛应激反应的主要调节者。相比之下，两栖动物幼体的研究表明了不同的模式：Rana berlandieri的蝌蚪阶段皮质酮具有重复性[12]，表明皮质酮在它们的早期发育中起更主导的作用。此外，在D. tinctorius中，蝌蚪阶段的皮质酮释放率超过皮质醇，而在成年期皮质酮和皮质酮的水平几乎相等[19,20]。在小鼠中，皮质酮是长期应激适应的主要糖皮质激素，而皮质醇是对严重急性应激更快的反应物[48]。来自其他脊椎动物的证据支持皮质醇和皮质酮在应激调节中可以发挥互补而非冗余作用的观点，它们在不同物种、发育和生态背景下的相对重要性有所不同。皮质醇和温度之间的正相关对小型海牛具有重要的生态和保护意义。因为外温动物的激素产生与代谢率紧密相关[49]，所以在更高温度下皮质醇的水平升高可能反映了能量需求的增加或生理压力的增加[11]。这种模式与越来越多的证据一致，即两栖动物的应激生理对温度变化敏感，这可以改变免疫功能、行为和疾病易感性[40]。对于像小海牛这样的水生物种来说，它们生活在浅水湿地中，温度的升高以及极端温度事件的频繁发生可能会导致皮质醇水平长期升高，从而可能降低其适应能力和抵抗力[11]。然而，需要开展纵向研究来评估这种可能性。尽管我们将温度作为关键的环境协变量，但其他因素如溶解氧和pH值也可能影响内分泌反应，在未来的研究中也应加以考虑。识别该物种的皮质醇（GC）动态变化为监测自然种群中的环境压力提供了有价值的工具，特别是在气候变化导致的供水期、温度模式和栖息地质量变化背景下。将皮质醇指标纳入保护评估中，可以帮助管理者在种群数量下降之前发现亚致死性压力，从而改善早期干预和栖息地保护策略。尽管我们的研究为S. intermedia的皮质醇谱型和采样方法提供了新的见解，但研究设计中存在一些局限性需要考虑。皮肤拭子实验的样本量有限，这可能会限制统计功效。此外，研究中的温度变化是观察性的而非实验性操纵的，因此无法分离温度对皮质醇动态的因果效应。我们的研究也没有包括从成年海牛体内采集的水源激素样本，这限制了我们评估不同生命周期阶段皮质醇谱型的能力，也无法确定成年海牛是否表现出皮质醇相对于皮质酮的主导地位。我们使用的急性压力源可能无法完全反映海牛在野外面临的各种生态相关挑战。不过，我们验证了EIA试剂盒的使用效果，并确认了系列稀释曲线与标准曲线的平行性，发现每种激素的回收情况均符合要求。这一验证结果支持了观察到的皮质醇与皮质酮之间的差异反映了真实的生物学变化，而非基质效应或检测偏差。未来的研究需要在不同的环境梯度和生命周期阶段重复采样多种皮质醇，以澄清皮质醇和皮质酮压力调节的情境依赖性差异。确定物种特异的皮质醇模式为进一步研究提供了重要的基础，这些研究将探讨环境压力如何影响两栖动物在各个生命周期阶段和不同生态环境下的生理机能。

补充材料：
以下支持信息可在以下链接下载：
https://www.mdpi.com/article/10.3390/conservation6020047/s1
数据集S1：实验1；
数据集S2：实验2。