针对白细胞介素-8介导的细胞间相互作用，可逆转努南综合征患者的高血压性心肌病和心脏纤维化

《Circulation》：Targeting Interleukin-8–Mediated Cellular Crosstalk Reverses Hypertrophic Cardiomyopathy and Cardiac Fibrosis in Noonan Syndrome

　　摘要
背景：RAS-MAPK信号通路组件或调节因子中的基因变异是Noonan综合征（NS）患者出现严重和早发型肥厚性心肌病（HCM）的原因。尽管旁分泌通讯在心肌病的发病机制中起着关键作用，但关于导致NS患者心肌肥厚和心肌纤维化的潜在病理机制的知识仍然十分有限。
方法：为了研究非心肌细胞在NS发病中的作用，我们使用LZTR1缺陷的二维和三维人类诱导多能干细胞模型，以及来自携带关键RAS-MAPK基因致病性变异的NS患者的诱导多能干细胞，从分子、细胞和功能层面分析了这些细胞和组织。
结果：我们的研究发现，主要在疾病状态下激活的细胞因子介导的心肌纤维母细胞与心肌细胞之间的相互作用是疾病的主要驱动因素。心肌纤维母细胞特异性IL-8（白细胞介素-8）的分泌导致了与纤维化相关的特征、组织硬度增加、心肌肥厚和闰搏动增强，表明IL-8是一种独立于炎症和免疫细胞参与的心脏自主信号分子。通过抑制IL-8–CXCR1信号通路，reparixin逆转了心肌纤维母细胞和心肌细胞的病理效应。
结论：这些数据表明，针对异常的IL-8–CXCR1信号通路可能是治疗NS相关肥厚性心肌病的有效方法。

临床视角
• 本研究确定心肌纤维母细胞产生的IL-8是Noonan综合征相关肥厚性心肌病中心肌肥厚和纤维化的自主驱动因素。
• 它证明IL-8–CXCR1信号通路介导的病理性的纤维母细胞-心肌细胞相互作用与免疫细胞或系统性炎症无关。
• 使用reparixin进行药物性CXCR1抑制可以在基于人类二维和三维诱导多能干细胞的心脏模型中逆转疾病的分子和功能表型。

临床意义：
• IL-8–CXCR1信号通路是一个可药物化的、能够改变疾病进程的治疗靶点，有望减少心肌纤维化和肥厚。
• 使用临床先进的化合物如reparixin或ladarixin进行药物性CXCR1抑制可以迅速转化为基因型指导的早期临床试验。

患有早发型肥厚性心肌病（HCM）的婴儿作为Noonan综合征（NS）的严重症状，比非综合征HCM患者或无心脏功能障碍的NS患者更容易发生心力衰竭，生存率显著较低。NS影响每1000到2500名新生儿中的1人，与其他表现为RASopathies的综合征一起，被认为是与先天性心脏缺陷最相关的单基因疾病。这种多系统障碍由编码RAS-MAPK信号通路组件或调节因子的基因的种系突变引起，这些突变导致信号转导过度活跃。不同疾病的具体症状表明受影响基因的分子效应可能重叠但有所不同。NS中HCM的发病率和严重程度似乎与特定基因型相关；虽然并非所有RASopathy患者都会出现心脏症状，但在患者群体中，RAF1、HRAS和RIT1的功能获得性变异以及LZTR1的功能丧失性变异特别与严重的早发型HCM相关。LZTR1通过选择性靶向RAS GTPase进行cullin 3泛素连接酶介导的降解，从而成为RAS-MAPK信号级联的关键负调控因子；而LZTR1缺陷会导致RAS蛋白积累和信号通路过度活跃。目前，NS相关的HCM主要采用对症治疗或手术治疗。由于HCM可能在生命过程中迅速恶化，因此迫切需要额外的治疗方法。虽然心肌细胞（CMs）主要决定心脏功能，但其他心脏细胞类型（如心肌纤维母细胞（CFs）和内皮细胞（ECs）通过紧密调控的旁分泌和自分泌信号通路对心脏发育、性能和重塑有重要影响。细胞间的相互作用，尤其是通过细胞因子，在NS病理中起作用。例如，CFs中的RAS-MAPK过度活跃会引发病理性的心肌肥厚和心肌纤维化。携带RAF1和RIT1功能获得性突变的小鼠模型会发展出心肌肥厚和纤维化，NS患者中也经常观察到心室纤维化。然而，NS中心肌肥厚和心肌纤维化的复杂病理机制尚不清楚。我们的分子和功能理解可能会影响NS患者的治疗选择。

心脏疾病建模受到原始材料可用性和体外分离成人CMs有限存活及增殖能力的严重限制。基于先天性心脏病患者（包括心肌肌节心肌病和RASopathies）的诱导多能干细胞（iPSCs）的细胞和组织模型已成为体外重现人类疾病、研究潜在病理机制和测试新型治疗方法的强大平台。在本研究中，我们使用了LZTR1缺陷的二维和三维iPSC模型，以及来自携带LZTR1、RAF1和RIT1致病性变异的NS患者的iPSCs，以研究非心肌细胞在NS HCM发病中的作用，并发现主要在疾病状态下激活的细胞因子介导的细胞间相互作用是心肌肥厚和纤维化的主要驱动因素。特别是，我们发现CFs特异性分泌的IL-8引发了与纤维化相关的特征并增强了心肌细胞的肥厚。这些发现建立了RAS-MAPK过度激活与IL-8–CXCR1驱动的重塑之间的直接旁分泌联系，揭示了NS中纤维化和肥厚表型的心脏自主机制。重要的是，抑制IL-8–CXCR1信号通路逆转了CFs和心肌细胞的病理效应，因此可能成为治疗NS HCM的新方法。

数据和方法
所有方法的详细描述见补充材料。
本研究中使用的人类iPSC系均已存放在哥廷根大学医学中心的生物库中，可供研究使用。蛋白质组学数据可通过ProteomeXchange Consortium的PRIDE仓库（https://www.proteomexchange.org/）获取（访问号：PXD053691）。RNA测序数据可在国家生物技术信息中心基因表达组学数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取（访问号：GSE271775）。所有支持本研究结果的数据均可根据要求提供。

伦理批准
本研究获得了哥廷根大学医学中心的伦理委员会批准（批准号：10/9/15），并按照批准的指南进行。所有参与者或其法定代表在参与研究前均已签署书面知情同意书。

人类iPSC的生成与培养
本研究中使用的人类iPSC系包括：1个来自健康捐赠者的系（UMGi014-C克隆14，称为WT）；携带LZTR1致病性变异的患者来源和CRISPR-Cas9校正的iPSC系（UMGi030-A克隆14，称为LZTR1biallelic；UMGi030-A-1克隆34，称为LZTR1biallelic-corr）；RIT1（UMGi177-A克隆1，称为RIT1F99L；UMGi177-A-1克隆8，称为RIT1F99L-corr）和RAF1（UMGi034-A克隆4，称为RAF1S257L；UMGi034-A-1克隆D8，称为RAF1S257L-corr）；4个携带LZTR1第1外显子和第17外显子截断变异的CRISPR-Cas9编辑的杂合子和纯合子LZTR1敲除（KO）系（UMGi014-C-15克隆3，称为LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO；UMGi014-C-15克隆41，称为LZTR1Ex1-KO/WT；UMGi014-C-16克隆1，称为LZTR1Ex17-KO/WT；UMGi014-C-16克隆7，称为LZTR1Ex17-KO/Ex17-KO）；一个携带MRAS变异的CRISPR-Cas9编辑的iPSC系（UMGi014-C-17克隆G2，称为MRASG23V）；以及一个胶原报告基因系（RUCDRi002-A-36克隆2）。生成的iPSC在用于分化前进行了多能性和分子核型分析。

人类iPSC向CMs和非CMs的分化
根据先前的方法，通过WNT信号调节和随后的代谢选择将人类iPSC系分化为功能性心室iPSC-CMs。iPSC-CMs在无饲养剂和无血清条件下培养至分化后60天，然后用于分子和细胞实验。人类iPSC向iPSC-CFs的分化按照Zhang等人的方法进行改良。人类iPSC向iPSC-ECs的分化按照Natividad-Diaz等人的方法进行改良。工程化结缔组织和生物人工心脏组织的生成方法也是基于先前的描述。

统计分析
除非另有说明，数据以平均值±SEM表示。统计比较采用D’Agostino-Pearson正态性检验。随后使用单侧t检验或非参数Mann-Whitney检验比较两组，对于三个或更多组则使用Ordinary ANOVA结合Holm-?ídák多重比较检验或非参数Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验（使用GraphPad Prism 10）。当P≤0.05时，结果认为具有统计学意义。

结果
• LZTR1在CMs和非CMs中的双等位基因缺失会导致RAS GTP酶积累
NS患者，尤其是LZTR1缺陷患者，常出现心肌肥厚和纤维化，这从一名50岁女性患者的右心室活检中观察到的高度局灶性间质纤维化可见（图1A和1B）。为了研究LZTR1缺失对CMs和非CMs心脏病理的影响，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑在已建立的WT iPSC系中生成了单等位基因和双等位基因LZTR1缺失的iPSC系（图1C）。通过靶向LZTR1第1外显子和第17外显子引入了移码变异，模拟患者变异。编辑后验证了这些iPSC的多能性和基因组稳定性（图S1）。随后，所有5个克隆直接分化为均匀的iPSC-CMs、iPSC-CFs和iPSC-ECs群体，通过细胞类型特异性标志物的强烈表达得到确认（图1D和1E；图S2A至S2D）。

LZTR1双等位基因缺失在CMs和非CMs中诱导RAS GTP酶积累
NS患者，特别是LZTR1缺陷患者，常出现HCM，表现为心肌增厚和纤维化，如图1A和1B所示。为了探究LZTR1缺失对CMs和非CMs心脏病理的影响，我们使用CRISPR-Cas9在已建立的WT iPSC系中生成了单等位基因和双等位基因LZTR1缺失的iPSC系（图1C）。通过靶向LZTR1第1外显子和第17外显子分别引入了移码变异。编辑后的iPSCs的多能性和基因组稳定性得到了验证（图S1）。随后，所有5个克隆直接分化为均匀的iPSC-CMs、iPSC-CFs和iPSC-ECs群体（图1D和1E；图S2A至S2D）。

LZTR1缺陷的CFs促进CMs的细胞肥厚
为了确定LZTR1缺失对CMs蛋白质组的影响，我们对整个iPSC谱系的iPSC-CMs进行了无偏蛋白质组分析（图2A）。比较LZTR1缺陷（LZTR1KO/KO）和功能正常的LZTR1培养（LZTR1WT/WT和LZTR1KO/WT）发现了377个差异表达的蛋白质（图2B）。RAS GTP酶，特别是RIT1和MRAS，在LZTR1KO/KO培养物中是最丰富的蛋白质，这证实了这些蛋白质是LZTR1降解的主要靶标。Reactome通路富集分析揭示了失调的生物过程，如与细胞外基质组织、肌肉收缩和ERK信号传导相关的过程（图2C）。此外，LZTR1KO/KO iPSC-CMs表现出NPPA和NPPB的基础表达水平升高，表明肥大信号的激活（图2D）。与对照组（siNEG）相比，siRIT1处理使LZTR1KO/KO iPSC-CFs中的失调RAS-MAPK信号通路恢复正常（图3K）。同时，评估了LZTR1缺陷iPSC-CFs在28天内的增殖率与RIT1表达的关系（图3L和3M）。虽然RIT1敲低显著减少了增殖，但一旦RIT1表达恢复，增殖能力完全得以恢复。我们的观察结果表明，LZTR1缺陷细胞中的信号活性和增殖能力强烈依赖于RIT1蛋白水平，这为LZTR1缺陷相关的疾病表型提供了理论依据。

由于心肌组织硬度增加是心肌病患者中常见的心脏纤维化的特征，我们从LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs生成了工程化结缔组织（ECTs），并在更生理的环境中研究了其生物力学特性。22 分化的iPSC-CFs被注入胶原基质中并围绕柔性杆形成ECTs，培养2周后进行生物力学检查和转录组学分析（图4A）。所有基因型的ECTs都压实形成了三维组织；然而，LZTR1KO/KO组织在宏观上有所不同，并且与LZTR1WT/WT和LZTR1KO/WT ECTs相比，其收缩能力显著更强（图4B和4C）。各组的横截面积相似，表明LZTR1缺陷并未影响组织压实（图4D）。拉伸测量显示，LZTR1缺陷ECTs的硬度显著高于WT和杂合KO ECTs（图4E和4F），表明LZTR1KO/KO组织中肌成纤维细胞活性高且纤维化重塑明显。

LZTR1缺陷工程化结缔组织表现出纤维化特征。由于心肌组织硬度增加是心肌病患者中常见的心脏纤维化的标志，我们从LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs生成了工程化结缔组织（ECTs），并在更生理的环境中研究了其生物力学特性。22 分化的iPSC-CFs被注入胶原基质中并围绕柔性杆形成ECTs，培养2周后进行生物力学检查和转录组学分析（图4A）。所有基因型的ECTs都压实形成了三维组织；然而，LZTR1KO/KO组织在宏观上有所不同，并且与LZTR1WT/WT和LZTR1KO/WT ECTs相比，其收缩能力显著更强（图4B和4C）。各组的横截面积相似，表明LZTR1缺陷并未影响组织压实（图4D）。拉伸测量显示，LZTR1缺陷ECTs的硬度显著高于WT和杂合KO ECTs（图4E和4F），表明LZTR1KO/KO组织中肌成纤维细胞活性高且纤维化重塑明显。

LZTR1缺陷工程化结缔组织表现出纤维化特征。A、LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO诱导的多能干细胞（iPSC）-心脏成纤维细胞（CFs）被注入胶原基质中并围绕杆形成工程化结缔组织（ECTs），随后分析组织的硬度和转录组特征。B、在13天的培养期间每天测量LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO ECTs的杆偏移。杆距离以组织培养的第0天为基准进行归一化。n=26至39个组织，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的2至3次独立分化。C、第13天后LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO ECTs的代表性宏观图像。比例尺：1毫米。D、基于成像顶部和侧视图的LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO ECTs的横截面积。n=28至36个组织，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的3次独立分化。E和F、通过应力-应变分析确定LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO ECTs的生物力学特性，展示了杨氏模量（E）和最大应力（F）。n=23至30个组织，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的3次独立分化。G、通过RT-qPCR评估LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO ECTs中与纤维化相关的基因COL1A1、POSTN、ACTA2和TCF21的相对（Rel）转录水平。数据以内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和WT进行归一化。n=6个组织，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的2次独立分化。H、基于RNA测序的火山图，比较LZTR1KO/KO和LZTR1WT/WT ECTs。纤维化基因被突出显示。差异表达基因的绝对log2倍数变化≥0.5且调整后的P≤0.05。n=6个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的2次独立分化。I、KEGG通路富集分析比较LZTR1KO/KO和LZTR1WT/WT ECTs中的通路富集。节点颜色表示每条通路中上调和下调的基因。节点大小反映了调整后的P值。J、LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs中细胞因子-细胞因子受体相互作用的弦图分析。K、LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs从第3天到第9天接受了16.6 nM Latrunculin A以抑制F-actin聚合，3 μM H1152P以阻断ROCK依赖的收缩，或车辆对照处理。L和M、在9天的培养期间每天测量LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs的杆偏移，处理从第3天开始（L），并在处理后第6天量化杆偏移（M）。杆距离以组织培养的第0天为基准进行归一化。n=5至6个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的条件。数据通过普通单因素ANOVA和Holm-?ídák事后校正（D）或非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn事后校正（E、F、G和M）进行分析，并以平均值±SEM表示。ECTs随后进行了RT-qPCR和RNA测序分析。与高收缩和组织硬度一致，LZTR1缺陷ECTs表现出纤维化/肌成纤维细胞基因特征，表现为COL1A1、POSTN和ACTA2上调，PDGFRA和TCF21下调（图4G和4H）。KEGG分析显示，在LZTR1KO/KO组织中上调的基因中，HCM、RAS-MAPK和PI3K-AKT通路显著富集，而下调的基因主要涉及细胞周期和DNA复制（图4I）。此外，在LZTR1缺陷纤维化ECT中检测到细胞因子-细胞因子受体相互作用的失调，这与旁分泌信号受损一致（图4J）。

为了确定组织硬度的增加和收缩是源于被动基质特性还是活跃的细胞收缩，我们使用Latrunculin A抑制F-actin聚合和H1152P阻断ROCK信号依赖的收缩来干扰LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs中的细胞骨架动态（图4K）。在收缩期间连续 treatment 6天消除了两种基因型的组织收缩，表明活跃的细胞骨架张力对于ECT的形成和力生成是必需的（图4L和4M）。在收缩发生后短期 treatment 2天，WT和LZTR1缺陷组织迅速放松，表明组织张力是由持续的细胞骨架张力维持的，而不是被动基质机制（图S8）。总之，LZTR1缺陷ECTs表现出组织硬度增加和纤维化重塑，反映了持续的肌成纤维细胞激活，加强了LZTR1缺陷与NS患者心脏纤维化之间的机制联系。

考虑到LZTR1缺陷CFs中细胞因子信号受损以及CF释放的旁分泌因子诱导的心肌肥大，我们接下来使用半定量多因子细胞因子测定法分析了条件培养基的组成（图5A）。我们发现LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs分泌多种因子，包括EGF、GDF-15、IGFBP2和Serpin E1，这些因子都未受到LZTR1缺陷的影响（图5B、5C和9A）。值得注意的是，在LZTR1缺陷iPSC-CFs的条件培养基中检测到显著更高水平的IL-8（CXCL8），它是分泌最多的因子之一，也是在LZTR1缺陷ECTs中上调最强的基因之一（图4H）。WT与KO iPSC-CMs或iPSC-ECs之间未发现分泌因子的差异，支持CF在疾病表现中的关键作用（图S10A至S10F）。我们进一步评估了CXCL8及其受体CXCR1和CXCR2在心脏细胞系中的表达。在所有基因型的iPSC-CMs和iPSC-ECs中，CXCL8的表达没有变化，但在LZTR1缺陷iPSC-CFs中显著升高，并在纤维化的LZTR1KO/KO ECTs中进一步升高，达到16倍（图5D；图S10G至S10I）。除了细胞因子外，这两种受体在LZTR1缺陷CFs和ECTs中也显著上调，表明CF区室中的IL-8信号整体受损（图5E和5F）。此外，CXCR1和CXCR2的表达在LZTR1KO/KO iPSC-CMs中也增加，这可能解释了LZTR1缺陷CM对细胞外刺激的更高敏感性。

LZTR1缺陷心脏成纤维细胞表现出RIT1依赖的IL-8信号受损。A、收集LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO诱导的多能干细胞（iPSC）-心脏成纤维细胞（CFs）的条件培养基，并使用细胞因子阵列检测100多种细胞因子、趋化因子和生长因子。B、用LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs的条件培养基孵育的代表性细胞因子阵列膜；高分泌因子被突出显示。C、对LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs的条件培养基中分泌的细胞因子进行定量分析；数据以检测的阳性对照进行归一化。n=2个独立分化，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系，技术重复测量2次。D至F、通过RT-qPCR在LZTR1WT/WT、LZTR1KO/WT和LZTR1KO/KO iPSC-心肌细胞（CMs）、iPSC-CFs和工程化结缔组织（ECTs）中评估CXCL8（D）及其受体CXCR1（E）和CXCR2（F）的相对转录水平。数据以内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和相应的WT进行归一化。对于CMs和CFs，n=6个独立分化，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT、LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO、LZTR1Ex17-KO/WT和LZTR1Ex17-KO/Ex1-KO的每条iPSC系；对于ECTs，n=6个组织，来自LZTR1WT/WT、LZTR1Ex1-KO/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的2次独立分化。G、LZTR1KO/KO iPSC-CFs被转染针对RIT1的短干扰RNA或阴性对照（siNEG），并在转染后第5天和第7天收集条件培养基，分析分泌的细胞因子。H、对用siNEG或siRIT1转染的LZTR1KO/KO iPSC-CFs的条件培养基中的分泌细胞因子进行定量分析；数据以检测的阳性对照进行归一化。n=2个样本，来自LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的2次独立分化，技术重复测量2次。I、通过RT-qPCR在转染后第7天的LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs中评估CXCL8、其受体CXCR1和CXCR2以及与纤维化相关的基因COL1A1、POSTN和ACTA2的相对（Rel）转录水平。数据以内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和siNEG转染的WT进行归一化。n=9个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的3次独立分化。J、基于RNA测序的火山图，比较LZTR1KO/KO和LZTR1WT/WT ECTs。纤维化基因被突出显示。差异表达基因的绝对log2倍数变化≥0.5且调整后的P≤0.05。n=6个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的2次独立分化。I、KEGG通路富集分析LZTR1KO/KO与LZTR1WT/WT ECTs中的通路富集。节点颜色表示每条通路中的上调和下调基因。节点大小反映了调整后的P值。J、LZTR1WT/WT与LZTR1KO/KO ECTs中细胞因子-细胞因子受体相互作用的弦图分析。K、LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs分别用16.6 nM Latrunculin A抑制F-actin聚合，3 μM H1152P阻断ROCK依赖的收缩，或车辆对照处理，从第3天到第9天。L和M、在9天的培养期间每天测量LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs的杆偏移，处理从第3天开始（L），并在处理后第6天量化杆偏移（M）。杆距离以组织培养的第0天为基准进行归一化。n=5至6个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的每条iPSC系的条件。数据通过普通单因素ANOVA和Holm-?ídák事后校正（D）或非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn事后校正（E、F、G和M）进行分析，并以平均值±SEM表示。ECM表示细胞外基质；KO表示敲除；kPa表示千帕；MAPK表示MAPK；ROCK表示ROCK；RT-qPCR表示RT-qPCR；WT表示WT。

后续对ECTs进行了RT-qPCR和RNA测序分析。与高收缩和组织硬度一致，LZTR1缺陷ECTs表现出纤维化/肌成纤维细胞基因特征，表现为COL1A1、POSTN和ACTA2上调，PDGFRA和TCF21下调（图4G和4H）。KEGG分析显示，在LZTR1KO/KO组织中上调的基因中，HCM、RAS-MAPK和PI3K-AKT通路显著富集，而下调的基因主要涉及细胞周期和DNA复制（图4I）。此外，在LZTR1缺陷纤维化ECT中检测到细胞因子-细胞因子相互作用的失调，这与旁分泌信号受损一致（图4J）。为了确定组织硬度的增加和收缩是源于被动基质特性还是活跃的细胞收缩，我们使用Latrunculin A抑制F-actin聚合和H1152P阻断ROCK信号依赖的收缩来干扰LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs中的细胞骨架动态（图4K）。在收缩阶段连续治疗6天消除了两种基因型的组织收缩，表明活跃的细胞骨架张力是ECT形成和力生成所必需的（图4L和4M）。在收缩发生后短期治疗2天，无论是WT还是LZTR1缺陷组织都迅速放松，表明组织张力是由持续的细胞骨架张力维持的，而不是被动基质机制（图S8）。

LZTR1缺陷CFs显示RIT1依赖的IL-8信号受损。考虑到LZTR1缺陷CFs中细胞因子信号受损以及CF释放的旁分泌因子诱导的心肌肥大，我们接下来使用半定量多因子细胞因子测定法分析了条件培养基的组成（图5A）。我们发现LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CFs分泌多种因子，包括EGF、GDF-15、IGFBP2和Serpin E1，这些因子均未受到LZTR1缺陷的影响（图5B、5C和9A）。值得注意的是，在LZTR1缺陷iPSC-CFs的条件培养基中检测到显著更高水平的IL-8（CXCL8），它是分泌最多的因子之一，也是LZTR1缺陷ECTs中上调最强的基因之一（图4H）。在WT与KO iPSC-CMs或与此一致的是，在用siRIT1转染的iPSC-CFs培养基处理的iPSC-CMs中，与siNEG培养基相比，与肥大相关的基因NPPA和NPPB的表达减少（图5N）。这些数据表明，LZTR1缺陷的CFs先前未被识别的病理IL-8分泌是心脏纤维化和肥大特征的关键介质。IL-8–CXCR1信号传导促进纤维化和肥大重塑。

为了验证IL-8是导致细胞间相互作用受损引起的心脏病理的关键因素，我们用重组IL-8处理iPSC-CFs、ECTs和iPSC-CMs，并评估了它们的增殖、组织硬度、胶原蛋白产生和心肌细胞肥大（图6A）。LZTR1WT/WT iPSC-CFs在IL-8处理后显示出显著的增殖增加，这与LZTR1缺陷的iPSC-CFs的增殖率相当（图6B和6C）。同样，WT ECTs在IL-8处理后的组织硬度也高于使用空白对照处理的样本（图6D）。通过使用CRISPR-Cas9工程化的胶原蛋白荧光报告基因iPSC系来实时监测细胞外基质的组装，我们发现IL-8处理显著增加了iPSC-CFs中的胶原蛋白生产和沉积，表明IL-8具有直接的纤维化促进作用（图6E至6G）。

IL-8（白细胞介素-8）–CXCR1信号传导促进纤维化和肥大重塑。A. 诱导多能干细胞（iPSC）-心脏成纤维细胞（CFs）、工程化结缔组织（ECTs）和iPSC-心肌细胞（CMs）被重组IL-8刺激，随后分析其对增殖、组织硬度、胶原蛋白分泌和细胞肥大的影响。B和C，LZTR1WT/WT iPSC-CFs在100 ng/mL IL-8刺激下的增殖生长曲线（实线，平均值；阴影区域，平均值±标准误差平均值）（B）和定量分析（C）；增殖量通过曲线下面积（AUC）分析确定，并与空白对照样本进行标准化；每种条件下的n=16个样本，来自4个独立的LZTR1WT/WT分化。D，在100 ng/mL IL-8刺激下，LZTR1WT/WT ECTs的极点偏移在培养11天内每天测量一次；极点距离根据组织培养的第0天进行标准化。n=每种条件下的5到6个组织，来自LZTR1WT/WT。E，带有荧光标记的COL1A2的胶原蛋白报告基因iPSC-CFs的代表性荧光图像，显示IL-8刺激下胶原蛋白的沉积情况。比例尺：200 μm。F和G，IL-8刺激下第7天的胶原蛋白沉积量（实线，平均值；阴影区域，平均值±标准误差平均值）（F）和定量分析（G），针对100 ng/mL IL-8刺激下的LZTR1WT/WT iPSC-CFs。胶原蛋白沉积量基于荧光强度，并与空白对照样本进行标准化。n=每种条件下的12个样本，来自4个独立的胶原蛋白报告基因分化。H，对LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CMs悬浮液中的单个细胞进行定量细胞大小分析，这些细胞在100 ng/mL IL-8刺激下培养7天；n=每种条件下的7到10个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的3到4个独立分化。I，通过RT-qPCR评估LZTR1KO/KO iPSC-CMs在100 ng/mL IL-8刺激下7天后的肥大相关基因的相对转录水平。数据根据内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和空白对照样本进行标准化。n=每种条件下的3个样本，来自LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的3个独立分化。J，IL-8通过CXCR1和CXCR2的信号传导示意图，抑制剂的IC50值反映了受体的选择性。K至P，在存在reparixin（K）、ladarixin（L）、navarixin（M）或AZD5069（O）的情况下，LZTR1WT/WT iPSC-CMs在100 ng/mL IL-8刺激下的胶原蛋白沉积量随时间的变化（实线，平均值；阴影区域，平均值±标准误差平均值），每种抑制剂分别以1、10和100 μM的浓度应用，以及对第10天的胶原蛋白沉积量进行定量分析（P）。胶原蛋白沉积量基于荧光强度，并与空白对照样本进行标准化；n=每种条件下的7到10个样本，来自2到3个独立的胶原蛋白报告基因分化。数据通过非配对t检验（C和G）、Mann-Whitney检验（H）或Kruskal-Wallis检验及Dunn事后校正（P）进行分析，并以平均值±标准误差平均值表示。IC50表示xxx；KO表示敲除；RT-qPCR表示xxx；WT表示野生型。

接下来，我们研究了IL-8是否对iPSC-CMs中的ERK信号传导活性和细胞肥大有贡献（图6G）。与条件培养基相比，单独添加IL-8不足以急性激活iPSC-CMs中的ERK信号传导（图S11）。然而，将LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CMs暴露于IL-8 7天后显著诱导了心肌细胞肥大（图6H）。与先前的研究结果一致，LZTR1缺陷的iPSC-CMs似乎更容易发生心脏重塑，这得到了肥大标志物上调的支持（图6I）。

为了确定IL-8驱动的病理心脏重塑的受体特异性，我们使用我们的胶原蛋白报告基因系作为功能检测方法，应用了CXCR1和CXCR2的选择性抑制剂（图6J）。应用了具有明确选择性的小分子抑制剂，包括对CXCR1具有更高亲和力的化合物（reparixin，对CXCR1的亲和力约为CXCR2的100倍）和对CXCR2具有更高选择性的化合物（navarixin、danirixin、AZD5069；对CXCR2的选择性为CXCR1的15到150倍），或对两种受体具有相似效力的化合物（ladarixin）。CXCR1选择性抑制剂reparixin和双重CXCR1/2抑制剂ladarixin以浓度依赖的方式显著减少了IL-8诱导的胶原蛋白沉积，而CXCR2选择性抑制剂则没有可测量的效应，表明CFs中的纤维化重塑主要是通过CXCR1介导的（图6K至6P）。

这些实验确定IL-8–CXCR1信号传导轴是LZTR1缺陷心脏模型中纤维化和肥大表型的核心驱动因素。

由于LZTR1缺陷引起的病理性IL-8分泌显著促进了心脏病理，我们假设通过reparixin抑制IL-8–CXCR1信号传导将导致心脏纤维化和肥大的减少（图7A）。我们确定10 μM的reparixin是合适的浓度，可以抑制IL-8介导的信号传导而不影响细胞存活（图S12）。首先，我们分析了LZTR1KO/KO iPSC-CFs在reparixin处理下的增殖率，并观察到其增殖能力显著降低（图7B和7C）。重要的是，与RIT1敲低导致的强烈增殖抑制不同，reparixin将增殖恢复到WT水平。为了评估该化合物对组织硬度的影响，从培养第5天开始用reparixin或DMSO处理LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs，并进行纵向测量。值得注意的是，reparixin处理将LZTR1缺陷ECTs的组织收缩恢复正常水平，而不影响健康组织，表明在抑制IL-8信号传导后纤维化细胞外基质重塑得到了逆转（图7D；图S13A和S13B）。此外，reparixin还恢复了LZTR1缺陷iPSC-CFs和组织的分子表型。虽然用DMSO处理的组织显示出CXCL8及其受体的强烈上调，但reparixin处理显著降低了IL-8信号传导相关基因的表达（图7E）。值得注意的是，reparixin还逆转了LZTR1缺陷组织中的纤维化基因特征（图7F）。在二维培养实验中也观察到了类似的效应（图S13C和S13D）。

IL-8（白细胞介素-8）–CXCR1信号传导的抑制逆转了与LZTR1相关的心脏重塑。A，LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO诱导多能干细胞（iPSC）-心脏成纤维细胞（CFs）、工程化结缔组织（ECTs）和iPSC-心肌细胞（CMs）被IL-8信号抑制剂reparixin处理，并评估其对增殖、组织硬度、纤维化特征、信号传导活性和细胞肥大的影响。B和C，LZTR1KO/KO iPSC-CFs在10 μM reparixin处理下的增殖生长曲线（实线，平均值；阴影区域，平均值±标准误差平均值）（B）和定量分析（C）；增殖量通过曲线下面积（AUC）分析确定，并与空白对照样本进行标准化。n=每种条件下的23到24个样本，来自LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的4个独立分化。D，在培养第5天开始处理后，每天测量LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs在10 μM reparixin或空白对照处理下的极点偏移，共培养11天。极点距离根据组织培养的第0天进行标准化。显示了LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO每种条件下6到9个组织的代表性处理轮次。E和F，在10 μM reparixin处理后第11天，通过RT-qPCR评估LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs中CXCL8、其受体CXCR1和CXCR2（E）以及纤维化相关基因COL1A1、POSTN和ACTA2（F）的相对转录水平，处理前已经进行了6天的处理。数据根据内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和空白对照WT进行标准化。n=每种条件下的6个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的2个独立分化。G，在LZTR1KO/KO iPSC-CMs在10 μM reparixin或空白对照培养条件下培养7天后，对悬浮液中的单个细胞进行定量细胞大小分析；n=每种条件下的7到19个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的3到4个独立分化。H，通过结合LZTR1WT/WT iPSC-CMs和LZTR1KO/KO iPSC-CMs并在胶原蛋白-Matrigel基质中嵌入，使用10 μM reparixin或空白对照处理第2周至第6周生成生物人工心脏组织（BCTs）。I，在组织压缩和处理的不同时间点，显示LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO BCTs的代表性宏观图像。比例尺：1 mm。J，在用10 μM reparixin处理4周后，通过RT-qPCR评估LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO BCTs在第6周的NPPA和NPPB的相对转录水平。数据根据内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和WT进行标准化。n=每种条件下的8到10个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的2个独立分化。K至N，在培养第2至6周使用10 μM reparixin处理的LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO BCTs的功能评估；n=每种条件下的7到10个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的3到4个独立分化。K，通过在培养第2至6周使用10 μM reparixin处理的LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO BCTs的收缩力时间序列分析和最终量化；n=7到10个样本，来自LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的2个独立分化。K，通过Mann-Whitney检验（C和G）、普通单因素ANOVA与Holm-?ídák事后校正（J）或非参数Kruskal-Wallis检验及Dunn事后校正（P）进行分析，并以平均值±标准误差平均值表示。KO表示敲除；RT-qPCR表示xxx；WT表示野生型。

我们还研究了IL-8抑制是否通过抑制ERK信号传导活性和细胞肥大来逆转LZTR1KO/KO iPSC-CMs中的细胞肥大（图6G）。与条件培养基相比，单独补充IL-8不足以急性激活LZTR1KO/KO iPSC-CMs中的ERK信号传导（图S11）。然而，将LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO iPSC-CMs暴露于IL-8 7天后显著诱导了心肌细胞肥大（图6H）。与先前的发现一致，LZTR1缺陷的iPSC-CMs似乎更容易发生心脏重塑，这得到了肥大标志物上调的支持（图6I）。

为了定义IL-8驱动的病理心脏重塑的受体特异性，我们应用了CXCR1和CXCR2的选择性抑制剂，使用我们的胶原蛋白报告基因系作为功能检测方法（图6J）。应用了具有明确选择性的小分子抑制剂，包括对CXCR1具有更高亲和力的化合物（reparixin，对CXCR1的亲和力约为对CXCR2的100倍）和对CXCR2具有更高选择性（navarixin、danirixin、AZD5069；对CXCR2的选择性为对CXCR1的15至150倍）或对两种受体具有相似效力的化合物（ladarixin）。使用CXCR1选择性抑制剂reparixin和双重CXCR1/2抑制剂ladarixin显著减少了IL-8诱导的胶原蛋白沉积，而CXCR2选择性抑制剂没有可测量的效应，表明CFs中的纤维化重塑主要是通过CXCR1介导的（图6K至6P）。

这些实验确定了IL-8–CXCR1信号传导轴是LZTR1缺陷心脏模型中纤维化和肥大表型的核心驱动因素。

由于LZTR1缺陷引起的病理性IL-8分泌显著促进了心脏病理，我们假设通过reparixin抑制IL-8–CXCR1信号传导将导致心脏纤维化和肥大的减少（图7A）。我们确定10 μM的reparixin是合适的浓度，可以抑制IL-8介导的信号传导而不影响细胞活力（图S12）。首先，我们分析了LZTR1KO/KO iPSC-CFs在reparixin处理下的增殖率，并观察到其增殖能力显著降低（图7B和7C）。重要的是，与RIT1敲低导致的强烈增殖抑制不同，reparixin将增殖恢复到WT水平。为了评估该化合物对组织硬度的影响，从培养第5天开始用reparixin或DMSO处理LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs，并进行纵向测量。显著的是，reparixin处理将LZTR1缺陷ECTs的组织收缩恢复正常水平，而不影响健康组织，表明在抑制IL-8信号传导后纤维化细胞外基质重塑得到了逆转（图7D；图S13A和S13B）。此外，reparixin还恢复了LZTR1缺陷iPSC-CFs和组织的分子表型。虽然用DMSO处理的组织显示出CXCL8及其受体的强烈上调，但reparixin处理显著降低了IL-8信号传导相关基因的表达（图7E）。值得注意的是，reparixin还逆转了LZTR1缺陷组织中的纤维化基因特征（图7F）。在二维培养实验中也观察到了类似的效果（图S13C和S13D）。

IL-8（白细胞介素-8）–CXCR1信号传导的抑制逆转了与LZTR1相关的心脏重塑。A，LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO诱导多能干细胞（iPSC）-心脏成纤维细胞（CFs）、工程化结缔组织（ECTs）和iPSC-心肌细胞（CMs）被IL-8信号抑制剂reparixin处理，并评估其对增殖、组织硬度、纤维化特征、信号传导活性和细胞肥大的影响。B和C，LZTR1KO/KO iPSC-CFs在10 μM reparixin处理下的增殖生长曲线（实线，平均值；阴影区域，平均值±标准误差平均值）（B）和定量分析（C）；增殖量通过曲线下面积（AUC）分析确定，并与空白对照样本进行标准化。n=每种条件下的23到24个样本，来自LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO的4个独立分化。D，在用10 μM reparixin处理后的培养第5天开始处理，每天测量LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs的极点偏移，共培养11天。极点距离根据组织培养的第0天进行标准化。显示了LZTR1WT/WT和LZTR1Ex1-KO/Ex1-KO每种条件下6到9个组织的代表性处理轮次。E和F，在用10 μM reparixin处理后的第11天，通过RT-qPCR评估LZTR1WT/WT和LZTR1KO/KO ECTs在10 μM reparixin处理第6天后的CXCL8、其受体CXCR1和CXCR2（E）以及纤维化相关基因COL1A1、POSTN和ACTA2（F）的相对转录水平。数据根据内参基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和空白对照WT进行标准化。n=每种条件下的6个组织，来自LZTR1WT/WT和LZTR1这些结果提供了证据，表明靶向异常的IL-8信号传导可以缓解与LZTR1缺乏相关的病理性心脏重构。异常的IL-8–CXCR1信号传导是驱动努南综合征（NS）心脏病理的共有致病机制。为了探究IL-8–CXCR1信号通路的失调以及修复辛（reparixin）的治疗反应是否代表了NS中更广泛的致病机制，我们将研究扩展到了携带LZTR1、RIT1和RAF1突变的患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）（图8A）。携带这些基因变异的个体大多数会发展成扩张型心肌病（HCM），而LZTR1、RIT1和RAF1共同占NS-HCM病例的80%以上。我们建立了经过CRISPR修正的LZTR1biallelic、RIT1F99L和RAF1S257L患者系iPSCs作为对照（图S14）。我们还包括了携带NS相关MRASG23V突变的iPSCs进行比较，考虑到CFs中MRAS表达较低，预计其影响较小。将患者来源的、经过修正的MRASG23V和WT iPSCs分化为iPSC-CFs，并在不同条件下以及经过修复辛处理后分析其细胞因子分泌、促纤维化基因表达和增殖情况。

图8. 异常的IL-8（白细胞介素-8）–CXCR1信号传导是驱动努南综合征心脏病理的共有致病机制。A. 从携带双等位LZTR1、RIT1F99L、RAF1S257L或MRASG23V变异的努南综合征患者中获得的诱导多能干细胞（iPSCs）分化为iPSC-心肌纤维细胞（CFs），并在不同条件下以及经过修复辛处理后分析其细胞因子分泌、促纤维化基因表达和增殖情况。B和C. 用LZTR1biallelic及其CRISPR修正对应物（LZTR1biallelic-corr）、RIT1F99L及其CRISPR修正对应物（RIT1F99L-corr）以及RITF99L及其CRISPR修正对应物（RITF99L-corr）iPSC-CFs的条件培养基孵育的代表性细胞因子阵列膜；图中显示了高分泌因子。D. 对LZTR1biallelic、RIT1F99L、RAF1S257L iPSC-CFs及其CRISPR修正对应物，以及MRASG23V和WT的条件培养基中分泌的IL-8进行定量分析。数据以检测的阳性对照值为标准进行了标准化。n=2，每个LZTR1biallelic、LZTR1biallelic-corr、RIT1F99L、RIT1F99L-corr、RAF1S257L、RAF1S257L-corr、MRASG23V和WT iPSC系各进行两次独立分化。E至G. 通过qPCR检测LZTR1biallelic、LZTR1biallelic-corr、RIT1F99L、RIT1F99L-corr、RAF1S257L、RAF1S257L-corr、MRASG23V和WT iPSC-CFs在10 μM修复辛处理或载体对照下的CXCL8（E）、POSTN（F）和ACTA2（G）的相对转录水平。数据以管家基因（GAPDH、TUBB5和RPL37A）和载体处理的WT为标准进行了标准化；n=3至6个样本，每个条件来自LZTR1biallelic、LZTR1biallelic-corr、RIT1F99L、RIT1F99L-corr、RAF1S257L、RAF1S257L-corr、MRASG23V和WT的每个iPSC系的三次独立分化。H. 对LZTR1biallelic、LZTR1biallelic-corr、RIT1F99L、RIT1F99L-corr、RAF1S257L、RAF1S257L-corr、MRASG23V和WT iPSC-CFs在10 μM修复辛处理或载体对照下的增殖情况进行定量分析。增殖量化通过曲线下面积（AUC）分析确定，并以载体处理样本为标准进行了标准化；n=6至12个样本，每个条件来自LZTR1biallelic、LZTR1biallelic-corr、RIT1F99L、RIT1F99L-corr、RAF1S257L、RAF1S257L-corr、MRASG23V和WT的两次独立分化。数据通过Mann-Whitney检验进行了分析，并以平均值±标准误（SEM）表示。EGF表示xxx，WT表示xxx。

细胞因子分析显示，来自LZTR1biallelic、RIT1F99L和RAF1S257L变异的iPSC-CFs的IL-8分泌显著增加，而其CRISPR修正的对应物在基线水平下释放IL-8（图8B至8D）。相比之下，MRASG23V的IL-8分泌没有增加。一致地，CXCL8转录分析证实了基因型依赖性的上调，并在修复辛处理后完全恢复正常（图8E）。载体处理的LZTR1-、RIT1-和RAF1-突变iPSC-CFs中升高的促纤维化标志物POSTN和ACTA2表达在修复辛处理后也降至对照水平（图8F和8G）。功能上，这三种基因型的iPSC-CFs显示出与促纤维化激活状态一致的增强增殖活性，这一活性被修复辛显著降低，而WT、MRASG23V和修正后的细胞系未受影响（图8H）。

这项研究揭示了异常的IL-8–CXCR1信号传导是NS-HCM共同的致病机制，并支持将其作为统一治疗策略的药物靶点。

**讨论**
HCM在NS患者中很常见，在携带RAF1、HRAS、RIT1和LZTR1致病基因变异的个体中发病率更高、严重程度更严重且发病年龄更早。NS HCM在组织学特征上表现为局部间质纤维化、纤维肥大和心肌细胞紊乱。患有NS HCM的儿童在诊断后第一年的死亡或移植风险显著增加。除了临床表型外，关于不同心脏细胞类型及其细胞间相互作用对心脏肥大和纤维化的影响知之甚少。在本研究中，通过结合使用LZTR1缺乏的iPSC-CMs和非CMs的体外疾病模型以及细胞和组织水平上的分子和功能表型分析，我们确定了失调的IL-8–CXCR1介导的旁分泌信号传导是NS中心脏纤维化和心肌细胞肥大的主要驱动因素。具体来说，我们发现：(1) LZTR1缺乏导致心肌细胞和非心肌细胞中RAS GTP酶的严重积累；(2) LZTR1缺乏的CFs表现出RIT1依赖的促纤维化特征，导致持续的肌纤维细胞活性、过度胶原沉积和组织硬度；(3) 主要由LZTR1缺乏的CFs释放的病理性升高的IL-8介导的旁分泌信号传导触发心肌细胞肥大；(4) 通过修复辛抑制IL-8–CXCR1信号传导可以恢复LZTR1缺乏的CFs、心肌细胞和三维心脏组织的疾病表型；(5) 异常的IL-8–CXCR1信号传导是不同遗传类型的NS HCM共有的致病机制。发现的失调IL-8–CXCR1信号通路可能是治疗NS HCM的有希望的治疗靶点。

心脏纤维化是心脏病的常见病理过程，也是心血管死亡的独立预测因素。在分子水平上，CFs中促炎细胞因子和促纤维化基因的上调促进了它们的增殖并转化成分泌胶原的肌纤维细胞，导致细胞外基质蛋白过度沉积、心室硬度增加、心肌细胞机械电耦合受损以及随后的收缩功能障碍和心律失常。携带RAF1、HRAS、RIT1和PTPN1相关基因突变的鼠模型表现出心脏肥大并发展为心脏纤维化。利用人类模型系统，我们的数据现在提供了证据，表明NS患者的CFs表现出心脏纤维化的多种特征，包括增殖增加、促纤维化和肌纤维细胞基因特征、高水平的胶原产生和分泌以及由肌纤维细胞激活引起的高组织硬度。我们的发现支持这样一种理论：NS中的心脏纤维化主要是（肌）纤维细胞过度活性的直接后果，而不是对肥大重构的次要反应。

心脏中的多种细胞类型，包括心肌细胞（CMs）、CFs、内皮细胞（ECs）和免疫细胞，通过直接的细胞-细胞相互作用、分泌因子和细胞外囊泡参与复杂的相互作用。失调的细胞间相互作用促进了心脏炎症、纤维化和不良重构，导致心肌细胞肥大和收缩功能障碍。例如，CF-CM之间的通信可以改变心肌细胞的电生理和动作电位，增加心律失常的风险。CFs与免疫细胞之间的相互作用参与调节心脏纤维化，而CFs也可能反过来改变免疫细胞的行为。此外，心脏分泌组的改变具有预后相关性，因为心力衰竭患者中的促炎细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的血浆水平升高与疾病严重程度相关。几项研究表明，旁分泌信号传导也是NS病理的核心。微RNA诱导的RAS-MAPK在CFs中的过度活性改变了它们的分泌组，导致间质纤维化和心肌细胞肥大。据报道，Raf1突变的内皮细胞（而非CFs）通过分泌TNF-α和IL-6驱动心肌细胞肥大。在携带激活BRAF突变的患者来源的iPSC-CMs和iPSC-CFs的研究中，发现CF分泌的TGF-β是心肌细胞肥强的强力调节因子，而BRAF突变的新生大鼠工程心脏组织仅表现出轻微的旁分泌作用，这表明可能存在物种差异，并强调了人类NS模型的重要性。我们现在进一步提供了证据，证明LZTR1缺乏的CFs中失调的旁分泌信号传导引发了心肌细胞肥大，并确定IL-8–CXCR1信号通路是驱动心脏病理的分泌途径。此外，我们的数据表明这种异常机制不仅限于LZTR1缺乏，而是携带RIT1、RAF1或LZTR1致病变异的NS基因型共有的致病机制。由于CFs中的促纤维化表型和旁分泌失调主要由RIT1水平驱动，我们预期我们的观察结果可以推广到其他NS基因型。此外，对RAS-MAPK过度活性持续高分泌的IL-8和其他促炎细胞因子表明，NS心脏中始终存在持续的炎症状态。

IL-8是一种促炎细胞因子，特异性结合CXCR1和CXCR2，IL-8–CXCR2信号传导是负责招募和激活单核细胞和中性粒细胞的经典途径。值得注意的是，小鼠没有人类IL-8的同源物，小鼠模型中的免疫细胞招募是由功能性同源物如CXCL1和CXCL2通过CXCR2介导的。在心脏中，IL-8与动脉粥样硬化、心脏纤维化和肥大有关，且多种心脏疾病中观察到IL-8水平升高，这与不良临床结果相关。传统上认为IL-8的作用主要是通过招募炎症细胞和次级释放纤维生成因子来实现的，而不是通过CMs、CFs或ECs之间的直接旁分泌通信。我们的数据确定NS相关CFs中RIT1依赖的IL-8分泌是心脏纤维化的主要驱动因素，其特征是CFs增殖增加、胶原沉积和组织硬度增加、心肌细胞肥大和过度收缩。这些发现表明，至少在疾病状态下，CMs和CFs通过一个以前未被认识的IL-8–CXCR1信号通路进行通信，这与经典的CXCR2介导的炎症反应不同，且独立于免疫细胞的参与，揭示了驱动NS HCM心脏重构的共有致病机制。

我们预计修复辛抑制IL-8–CXCR1信号传导可能有助于改善或逆转NS的心脏病理。修复辛是一种选择性的、非竞争性的CXCR1兼职变构拮抗剂，已在多个III期临床试验中评估用于炎症和肿瘤学适应症。尽管这些研究的主要终点并未一致达到，但修复辛显示出良好的安全性和耐受性。基于临床前数据，CXCR1/2抑制剂在各种心血管疾病动物模型中显示出有益的效果，可以限制炎症并发症和心脏重构。在我们的研究中，选择性抑制CXCR1的修复辛逆转了NS HCM模型中的促纤维化特征和组织硬化，并显著减轻了心肌细胞肥大和过度收缩。重要的是，与常用于受影响患者的MEK抑制不同，修复辛对RAS-MAPK信号的影响较轻，保持了细胞对RAS相关信号的反应性。

本研究确定了IL-8–CXCR1信号调节的失调是NS患者中与心脏纤维化、心肌细胞肥大和过度收缩相关的分子和细胞损伤的共有潜在机制。修复辛对该途径的抑制有效恢复了纤维化和肥大表型，代表了一种潜在的新治疗NS HCM的方案。