综述：用于生物系统内葡萄糖检测和成像的探针的设计与开发

《Chemical Society Reviews》：The design and development of glucose probes for sensing and imaging within biological systems

　　葡萄糖和葡萄糖稳态对于调节生物过程至关重要，而开发用于生物系统中葡萄糖感知和成像的探针长期以来一直是生物学和化学科学界的高度关注点。因此，相关的文献非常丰富。本综述旨在概述这些探针的工作机制的主要贡献和方法，以促进新型葡萄糖感知系统的发展。本综述总结了用于生物感知的葡萄糖探针设计方面的进展，并讨论了开创性和较新的葡萄糖探针的设计原理，涵盖了基于葡萄糖类似物的示踪剂、基于酶的探针、基于荧光蛋白的探针、基于凝集素的探针以及基于硼酸的葡萄糖探针。在整个过程中，将强调设计原理，并讨论现有探针的局限性和挑战，同时指出未来的机会和潜在的研究方向。

1. 引言

开发用于生物系统中葡萄糖感知和成像的探针具有重大的科学意义，因为葡萄糖在自然界中扮演着关键角色，是许多生命系统的主要能量来源。它通常通过氧化和分解代谢释放能量来维持生物体的生理功能。这些代谢过程在空间和时间分布上可能有所不同，且葡萄糖的功能在不同生理和病理条件下也会有所变化（图1），因此需要更好的感知、追踪和成像工具。为了更好地理解基于葡萄糖的过程，需要在复杂的生物环境中进行高分辨率的动态监测，同时还需要在存在活性干扰分子的条件下区分葡萄糖与其他多种糖类。

葡萄糖作为能量来源、蛋白质修饰、生物合成、能量储存和氧化还原稳态等方面的主要生物功能，在生命科学中占据核心地位。葡萄糖稳态的失调是生命科学研究的重点。葡萄糖稳态平衡对于生物体抵御内部和外部环境变化至关重要。人类主要通过小肠吸收葡萄糖（图2a），一旦进入血液，葡萄糖就会通过葡萄糖转运蛋白（GLUTs）被细胞摄取，并参与细胞内的葡萄糖代谢循环。能量和碳通过无氧代谢（糖酵解）、有氧分解代谢以及戊糖磷酸途径共同提供，以维持细胞的正常生长和繁殖。葡萄糖稳态的失衡和异常代谢在恶性病变、糖尿病和神经退行性疾病等病理过程中起着关键作用。线粒体基质中葡萄糖的氧化代谢会驱动胰岛素的释放，胰岛素由胰腺β细胞分泌，以响应血糖水平的升高，从而降低血糖并维持血糖稳态。具体来说，β细胞中葡萄糖的氧化会增加细胞质中的ATP（三磷酸腺苷）与ADP（二磷酸腺苷）的比例，导致ATP敏感的K+通道（KATP）关闭，进而诱导细胞外Ca2+的内流，最终触发胰岛素的分泌（图2）。

葡萄糖作为能量和碳的来源，越来越被认为是一种关键的“信使”分子，通过参与信号转导来调节与代谢相关的蛋白质。目前，这些调控机制及其生物学影响仍不甚明确，这减缓了相关疾病的治疗和研究的进展，表明需要开发出能够检测微小葡萄糖变化的稳健探针。葡萄糖探针的发展是一个长期且活跃的研究领域，已有大量关于该领域特定领域的优秀和全面综述，例如James和Sun在2015年对超分子葡萄糖感知的综述，重点关注人工合成的超分子系统（如环糊精、杯芳烃、金属-有机框架）。2020年和2023年，Pemble和Guo的研究团队分别报道了电化学葡萄糖生物传感器和微创电化学连续葡萄糖监测（CGM）传感器。本综述全面概述了截至2025年开发各种类型葡萄糖探针所采用的一般和独特设计原理，并介绍了化学、生物学和荧光机制。这些方面通过涉及葡萄糖类似物示踪剂、基于酶的探针、基于荧光蛋白的探针、基于凝集素的探针、基于硼酸的葡萄糖探针等的研究实例进行了说明。

2. 用于生物成像的葡萄糖类似物示踪剂

葡萄糖示踪探针通常由三部分组成：（i）决定葡萄糖类似物细胞摄取模式的葡萄糖部分；（ii）用于正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、荧光或磁共振成像（MRI）的生物成像信号传导组；（iii）连接这两个功能组的分链剂。最著名的例子是PET成像示踪剂2-[18F]-氟脱氧葡萄糖（2-[18F]-FDG，被称为“20世纪的分子”），现在它是肿瘤学、心脏病学和神经学中常见的葡萄糖成像探针。虽然这些示踪剂是基于葡萄糖的结构，但它们用于评估利用葡萄糖的过程，而不是直接检测或定量葡萄糖本身。

2.1. 放射性标记的葡萄糖衍生物

尽管本综述主要关注光学成像，但首先应简要介绍一些核成像的例子，因为核成像也是葡萄糖衍生物示踪剂（如PET和SPECT）的常见应用。在核成像中，将放射性标记的探针引入患者体内，让其分布，然后在外部检测由核衰变产生的放射性辐射（X射线CT、PET、SPECT等），从而可视化葡萄糖的分布。这些技术已在临床医学诊断和其他研究领域得到广泛应用。

图4显示了d-葡萄糖和1（2-[18F]-FDG的代谢过程。PET成像过程如下：将1静脉注射到患者体内后，1会在细胞中积累。随后发生β+放射性衰变（产生18O），释放出一个正电子（p+）。正电子与电子碰撞产生以180°角度发射的γ射线，这些γ射线被圆形3D PET扫描仪检测到并重建图像。葡萄糖的一个关键特性是其易于功能化，可以生成多种葡萄糖类似物探针，包括加入放射性核素。如前所述，肿瘤细胞常常具有异常的葡萄糖代谢（Warburg效应），因此放射性标记的葡萄糖类似物在肿瘤评估和诊断中得到应用。这些探针的非侵入性使得它们在临床中广泛用于体内成像，通常会引入放射性同位素，如碳-11（11C）、氟-18（18F）和锝-99m（99mTc）。由于碳的普遍性，11C同位素形式很常见。这种取代仅引起微小变化（与稳定的13C相比），因此这些类似物保持相同的化学和生理特性，几乎与未标记的葡萄糖无法区分。11C葡萄糖常被用作示踪剂，用于成像各种器官的代谢活动，不仅可以研究葡萄糖的分布，还可以通过量和表征产生的11C标记代谢物来研究其代谢过程。11C放射性标记类似物的主要限制是11C的半衰期较短（t1/2 = 20分钟），需要快速标记和立即成像，这限制了可进行的测量类型和研究范围，也降低了其临床应用性。相比之下，18F（半衰期约为110分钟）更为常见。18F还有一个优点，可以通过18O的质子轰击方便生成，这可以在新形成的18F掺入目标化合物之前在现场完成。这些特点部分解释了18F标记的FDG之所以取得巨大成功的原因，它占据了PET示踪剂使用量的90%以上。18F标记的FDG只是将葡萄糖中的2-羟基替换为18F，生成了质量与葡萄糖几乎相同的化合物。它通过GLUTs正常进入细胞，随后被己糖激酶磷酸化为2-[18F]-FDG-6P。这种氟化中间体不是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性底物，从而防止进一步代谢，称为代谢捕获。磷酸化的18F-FDG被隔离，导致其在细胞内积累，可以成像（图4b）。此外，18F同位素最终会在短时间内衰变为18O，产生天然的（即使位素富集的）d-葡萄糖，从而允许糖酵解途径继续进行，且毒性极小。18FDG出色的定位能力和对肿瘤检测的高灵敏度使其在解决各种临床挑战中不可或缺。图5展示了使用18F-FDG PET/CT成像来可视化肺癌的例子。

图5显示了肺癌患者的FDG PET/CT融合图像（a）和轴向图像（b），FDG-PET和融合PET/CT扫描显示右肺中一个4 × 5厘米的肿瘤（由箭头指示）的FDG摄取增加，以及中心坏死的证据。该图经参考文献20许可改编，由英国皇家化学会发布。由于葡萄糖易于功能化，可以生成多种葡萄糖类似物探针，包括加入放射性核素，这使得这些探针在临床中广泛应用。特别是它们的非侵入性使得它们只需给药和成像即可使用，因此已经广泛用于体内成像。相比之下，全球SPECT设备的数量显著超过了PET扫描仪的数量，这赋予了SPECT成像更广泛的临床应用潜力和可能性。使用99mTc的原因在于其较长的半衰期（6.02小时）、能够发射140 keV的伽马射线、可通过99Mo-99mTc发生器获得，以及其从-1到+7的广泛氧化态，允许进行丰富的配位化学研究。这些特性有助于设计和合成性能优异的各种99mTc标记的放射性药物。鉴于这些理想的性质，开发99mTc标记的葡萄糖衍生物（8-11）用于肿瘤成像已成为基于99mTc的肿瘤放射性药物领域的主要研究方向。

图6

18F葡萄糖示踪剂（2-7）和99mTc葡萄糖示踪剂（8-11）的代表性例子。

2.2. 荧光标记的葡萄糖衍生物

类似的方法也被用来开发荧光葡萄糖类似物，尽管功能修改/添加要复杂得多，因为它们需要添加整个荧光基团。1985年，Kutchai和Speizer等人合成了荧光葡萄糖类似物12（6-脱氧-N-(7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑-4-基)-氨基葡萄糖，6-NBDG，图7），在6-羟甲基位置含有荧光氨基硝基苯并二唑。这种探针通过470纳米和538纳米的激发和发射信号来研究人体红血球内的己糖转运系统，并且在水环境中具有50纳摩的有望的检测限。基于细胞的实验显示，在d-葡萄糖浓度接近其Km值（约2 mM）时，12的摄取受到抑制，观察到立体特异性抑制效应（l-葡萄糖则没有抑制作用）。这表明尽管结构发生了显著改变，12的行为仍类似于d-葡萄糖，通过通常的机制进入红血球，因此这些探针可能是研究葡萄糖代谢的可靠方法。

在这项工作之后，1996年Matsuoka和Yoshioka等人开发了13（2-NBDG，图7），这种荧光葡萄糖衍生物在C-2位置含有硝基苯并二唑，并用它来监测细胞内的代谢活动。这种化合物可以通过d-葡糖胺（GlcN）和4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑（NBD-Cl）的反应轻松合成，如图7中展示的许多系统一样，通常只需要将葡萄糖与适当的荧光基团偶联即可快速合成并广泛使用。摄取抑制实验显示，d-葡萄糖以0.5微摩的Ki值竞争性抑制13的摄取，而l-葡萄糖则没有显著的抑制效应。使用荧光显微镜进行的亚细胞定位分析表明，13主要位于大肠杆菌（Escherichia coli）的细胞质中，这表明这些探针在定量评估葡萄糖摄取活性和研究转运机制方面具有价值。

双光子显微镜（TPM）相比传统的单光子荧光具有多个优势，包括更大的穿透深度、局域激发和更长的观察时间。这些特性使其适合开发用于可视化葡萄糖摄取的双光子示踪剂。2009年，Cho及其同事引入了含有C-1连接的萘衍生物的双光子探针14a（AG1）和14b（AG2），用于活细胞和组织的葡萄糖代谢监测。用14b处理的细胞显示出更高的摄取率，并且产生的TPM图像比用14a处理的细胞更明亮。细胞摄取实验确认，与正常细胞（如HEK293和NIH/3T3细胞）相比，癌细胞（如A549和HeLa细胞）更有效地内化了14b。此外，14b在结肠癌组织中的摄取速率比在正常组织中更快，用紫杉醇预处理后摄取率显著降低（如图8所示），这符合其作为强效抗癌治疗剂的预期。在组织成像研究中，14b可以在75-150微米的深度下被监测超过3000秒。此外，14b表现出高光稳定性和低毒性，使其成为结肠癌诊断的有希望的候选者。

（a）正常组织（a）-（c）、癌组织（d）-（f）以及用紫杉醇处理的癌组织（g）-（i）中的14b的TPM图像。（b）在给予紫杉醇后，双光子激发荧光变化随时间的变化。经参考文献48许可改编。版权归Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim所有。近红外（NIR）染料因其在癌症检测和光动力疗法（PDT）中的潜力而受到广泛关注。肿瘤的一个关键特征是它们增强的糖酵解活性，这促进了它们的恶性行为。基于这一点，研究人员提出可以利用葡萄糖转运系统将诊断和治疗剂直接输送到肿瘤细胞。2003年，Zheng和Zhang等人开发了新型光敏剂15（Pyro-2DG，图7），它既可作为肿瘤靶向的NIR-葡萄糖荧光探针，也可作为PDT剂。静脉注射后，15选择性地在肿瘤组织中积累，导致肿瘤边缘的荧光增强（图9，顶部行），与周围的正常组织（如肌肉，中间行）相比。经过PDT治疗后，照射区域的线粒体受到特异性损伤。这项工作为开发能够通过代谢差异区分肿瘤和正常组织并实现靶向治疗的葡萄糖类似物混合诊断/治疗剂奠定了坚实的基础。

为了创建利用互补相互作用的多功能系统，2004年Achilefu和Ye等人使用含有二羧酸结构的碳菁染料作为核心，将其与未保护的d-(+)-葡糖胺反应，生成了一系列基于支架16（GlcN-Cypate，图7）的葡糖胺树状阵列。初步的体内研究表明，这些探针在增殖的肿瘤细胞中具有增强的摄取能力，可能是通过GLUTs介导的。2006年，Gambhir和Cheng等人将NIR荧光团Cy5.5（菁5.5）与d-葡糖胺结合，生成了Cy5.5-d-葡糖胺 conjugate 17（Cy5.5-2DG，图7），适用于临床前肿瘤异种移植模型中的肿瘤NIR荧光成像。体内实验表明，17和Cy5.5-NHS（图10a）在U87MG肿瘤模型中迅速积累，在注射后30分钟达到峰值，随后逐渐减少。在U87MG胶质瘤模型中，Cy5.5-NHS在注射后4小时和24小时的肿瘤与正常组织（T/N）荧光强度比率分别为3.34（±0.23）和2.81（±0.10）（图10b和c）。作者没有直接提供 Cy5.5-NHS比17具有更高T/N比率的明确机制解释，这可能与分子结构、摄取/保留机制和正常组织中的清除动力学差异有关。此外，这项研究强调近红外染料的尺寸至关重要，因为过于大的荧光团（如17中的Cy5.5）可能会干扰与GLUTs和己糖激酶的相互作用，从而突出了选择适当尺寸的近红外染剂的必要性。

（a）Cy5.5-NHS。（b）在给予17（■，实线）和Cy5.5-NHS（?，虚线）后，肿瘤对比度（肿瘤/正常组织比率）随时间的变化。（c）在静脉注射17（顶部）或Cy5.5-NHS（底部）后，对荷瘤裸鼠皮下U87MG胶质母细胞瘤的体内荧光检测。经参考文献51许可改编。版权归美国化学学会所有。2007年，Park团队设计并合成了荧光标记的d-葡萄糖类似物的两种异构体（α和β）：18a（Cy3（菁3）标记的α-葡糖，图7）和18b（Cy3标记的β-葡糖，图7）。然后这些立体异构体探针被用于细胞实验，基于C-1立体化学在A549细胞中显示出显著的摄取差异，α-异构体18a的摄取率比β-异构体18b高出40%。值得注意的是，18a的葡萄糖摄取追踪效率也显著高于先前报道的2-NBDG，且仅需要十分之一的浓度即可产生相当的荧光强度。利用这种高效的探针18a，Park等人开发了一种高通量筛选系统，通过定量监测癌细胞中的代谢活动和葡萄糖摄取变化来评估抗癌剂。

（a）Confocal荧光图像显示A549细胞在用紫杉醇处理后的18a摄取情况：（a）0小时，（b）3小时，（c）6小时，（d）12小时，（e）24小时，以及（f）6小时孵育后的相衬图像。（b）A549细胞在用紫杉醇处理后0小时、3小时、6小时、12小时和24小时的荧光强度。经参考文献52许可改编。版权归Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim所有。2009年，Olive和Kovar等人开发了一种NIR葡萄糖示踪剂19（IRDye 800CW 2-DG，图7），通过用近红外（NIR）染料IRDye 800CW（发射最大值：794纳米）标记2-DG来进行小鼠肿瘤成像。19的积累在体外使用多种肿瘤细胞系和体内小鼠模型中进行了系统评估。体内实验表明，与未标记的荧光团相比，19在检测和监测多种肿瘤类型方面表现出超过四倍的敏感性，并且它优先定位于肿瘤的存活但血供相对不足的区域（图12a和b）。19的特异性积累在体外显微镜和体内荷瘤小鼠中观察到，突出了其在临床前癌症研究和早期临床调查中的转化潜力。IRDye 800CW 2-DG后来被开发成商业葡萄糖示踪剂。IRDye 800CW具有高水溶性、高盐耐受性、低非特异性结合和高信噪比等明显优势，由此衍生出了多种商业产品，广泛应用于蛋白质标记、抗体标记、核酸应用和体内成像等领域。

（a）在尾静脉注射19后24小时，携带22Rv1（A）或A431（B）肿瘤的无胸腺裸鼠的图像。在Odyssey成像系统中固定、切除、嵌入和切片后，对切除的肿瘤进行额外的荧光成像。（b）在体内成像过程中，不同组织和器官中磷酸盐缓冲盐水（PBS）、IRDye 800CW羧酸盐或19的特异性分布。经参考文献53许可改编。版权归Elsevier Inc.所有。2010年，Chang等人开发了一种胺-乙酰化的三碳菁染料（CyNA）支架，该支架具有稳健的光物理性质、在水溶液中最小的聚集性和NIR荧光。后来，在2011年，Chang团队利用这一支架合成了新型NIR荧光葡萄糖衍生物20（CyNE 2-DG，图7）。与市售的19相比，探针20在癌细胞染色方面表现出显著改进，并显示出增强的细胞渗透性，使其成为基于NIR的癌细胞成像的有希望的候选者。跨细胞系实验表明，20优先被癌细胞摄取，并且有效地与未标记的d-葡糖竞争。此外，细胞成像实验确认20与市售的NIR示踪剂19相比具有更好的细胞渗透性，进一步验证了其适合NIR癌细胞成像的适用性。

（a）用20（a）和19（b）和（d）染色的MCF7细胞的荧光成像。经参考文献54许可改编。版权归英国皇家化学学会所有。除了有机多环芳烃荧光团外，也可以使用其他作为报告分子，例如Lo和Louie在2011年利用的发光锇（i）多吡啶复合物。他们合成了三种锇（i）多吡啶葡萄糖复合物，Re(N^N)(CO)3(py-3-glu)（复合物21a–c，图7）。结果表明，这些发光锇（i）多吡啶葡萄糖复合物的细胞摄取是通过GLUTs（葡萄糖转运酶）进行的。荧光显微镜显示21c主要定位于HeLa细胞的细胞质中，并在线粒体区域有显著积累。此外，复合物21c的光稳定性明显优于2-NBDG基准，突出了其长期成像应用的潜力。

（a）用MitoTracker Deep Red FM和复合物21b（λex = 633纳米和405纳米）在无葡萄糖培养基中染色的HeLa细胞的Confocal荧光成像。经参考文献60许可改编。版权归Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim所有。2011年，Park和Lee等人通过将Cy3荧光团连接到d-葡萄糖的α-异头位置，并使用多种接头，合成了多种荧光的葡萄糖类似物。通过流式细胞术和共聚焦成像的系统性定量评估，确定了22（GB2-Cy3，图7）是最优的探针，其灵敏度比标准的荧光葡萄糖示踪剂2-NBDG提高了十倍。使用wortmannin（一种特定的PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）抑制剂）预处理C2C12肌细胞后，22能够利用荧光共聚焦显微镜监测细胞血糖吸收的变化。这项研究确立了22作为实时定量监测活细胞中葡萄糖吸收的高性能荧光生物探针的地位。2014年，Park等人研究了电荷对GLUT介导的细胞葡萄糖吸收的影响，合成了另外两种基于22的探针：23a（整体呈两性离子中性）和23b（整体呈单阴离子）（图7）。在细胞成像实验中，发现22的细胞吸收优于23a和23b，类似地，用葡萄糖吸收增强剂处理的斑马鱼幼体也表现出22的吸收增强（图15a–c）。这项研究表明，葡萄糖示踪剂的分子电荷在其细胞吸收行为中起着关键作用。带正电的22表现出对GLUT的特异性细胞吸收，为新型示踪剂的设计提供了宝贵的见解。此外，22作为斑马鱼体内的葡萄糖示踪剂的应用也得到了验证，其性能优于2-NBDG，从而为代谢疾病研究和抗糖尿病药物的开发提供了另一种有前景的工具。图15。

(a) 和 (b) 斑马鱼对22（GB2-Cy3）的剂量依赖性吸收 (a) 及其荧光量化数据 (b)。(c) 用葡萄糖吸收增强剂（ampakine和罗格列酮）处理后，用22染色的斑马鱼的荧光成像。(d) 用板读取器处理ampakine和罗格列酮后，比较斑马鱼幼体中22吸收的荧光强度。(e) 用ampakine和罗格列酮处理后，比较斑马鱼幼体眼睛中22吸收的荧光强度。经参考文献62许可改编。版权歸 Royal Society of Chemistry (2014) 所有。

目前大多数可用的近红外（NIR）染料在其分子结构中都含有带电基团，正如我们刚才所见，这些基团可能会对其吸收和膜通透性产生不利影响。2016年，Lu和Chen等人利用基于二氰亚甲基-4H-吡喃（DCM）核心结构的电荷中性NIR染料DCPO，设计并合成了新的荧光标记葡萄糖类似物24a–e（DCPO-DGs，图7）。这些化合物表现出明显的GLUT-1介导的吸收，并且其吸收受到floretin（一种特定的GLUT-1抑制剂）和游离d-葡萄糖的竞争性抑制。该研究表明，含有二乙二醇作为染料和葡萄糖基团间连接物的24c显示出最佳的连接物长度（相当于两个乙二醇单位），在24a–e系列中具有最高的细胞吸收（图16a–c）。这些发现补充了Park关于带电系统的研究，突显了DCPO出色的光学特性和中性电荷特性，并建议将其进一步整合到其他此类系统中，用于体内外生物成像。图16。

使用24a–e的共聚焦显微镜成像。(a) 用不同化合物（25 μM）染色24小时的MCF-7、MKN-45和HeLa细胞的荧光成像。(b) 不同癌细胞系中GLUT-1表达水平的Western印迹。(c) MCF-7、MKN-45和HeLa细胞中24a–e吸收的荧光强度比较。经参考文献63许可改编。版权归Royal Society of Chemistry (2016) 所有。2018年，Park和Jo等人引入了一对新型NIR葡萄糖示踪剂25a（Glc-SiR-COOH，图7）和25b（Glc-SiR-Me，图7），其中加入了硅罗丹明（SiR）荧光团。为了进一步研究电荷对细胞吸收的影响，通过修改SiR取代基引入了不同的净电荷（0, +1）。光物理分析显示，25a和25b都表现出相似的近红外激发/发射波长，25a的λex/λem值为648/676 nm，25b的值为650/676 nm。细胞吸收实验表明，整体呈中性的25a在HeLa细胞中产生了明显的细胞质荧光信号，而带正电的25b则没有。这些结果表明，正净电荷会阻碍细胞吸收，鉴于NIR荧光团的共同结构特征，这一观察结果具有重要意义。此外，25a被d-葡萄糖抑制的程度比标准荧光示踪剂2-NBDG更严重（图17a）。细胞成像研究显示，25a能够有效区分癌细胞和正常细胞。乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF7）对25a的吸收是正常乳腺细胞（MCF12A）的7.8倍，这与前者GLUT-1和GLUT-4的表达上调相关（图17b）。进一步地，用combretastatin A4（微管聚合抑制剂）处理癌细胞显著降低了25a的细胞吸收（图17c），表明这种示踪剂可用于监测抗癌药物对细胞代谢的影响。这种示踪剂能够可视化活细胞中的GLUT介导的葡萄糖吸收，在基于成像的抗癌药物疗效评估中具有重大潜力。图17。

(a) 在不同浓度d-葡萄糖存在下，HeLa细胞中2-NBDG和25a（Glc-SiR-COOH）的荧光强度比较。(b) 乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF7细胞）和正常乳腺细胞（MCF12A细胞）中25a的共聚焦图像。(c) 用不同浓度combretastatin（0, 0.1和1.0 μM）处理后的MDA-MB-231细胞中25a的共聚焦图像。经参考文献64许可改编。版权归American Chemical Society所有。由于结构简单和合成易行，基于二氰异佛浪酮（DCI）的荧光团是很有吸引力的候选者。2020年，Li和Cheng等人通过在d-葡萄糖的C-1位置添加DCI，引入了一种新的深红色发光葡萄糖示踪剂26（Glu-1-O-DCSN，图7）。该分子具有供体–π–受体（D–π–A）结构，表现出良好的光物理特性，乙醇中的激发最大波长为530 nm，斯托克斯位移大至140 nm，荧光量子产率适中。荧光成像显示26可以用于实时成像细胞内葡萄糖吸收（图18a和b）。在异种移植小鼠模型中，经静脉注射后26在肿瘤部位有效积累，注射后6小时开始出现信号增强，注射后约23小时达到最大值（图18c和d）。这种探针能够实现体外实时监测葡萄糖吸收，以及体内葡萄糖代谢动态的可视化。由于其显著的肿瘤积累能力，26在抗癌药物筛选、疗效评估和通过术中肿瘤可视化进行影像引导手术方面具有广阔的应用前景。图18。

实时荧光成像 (a) 以及在0 mM和5.6 mM d-葡萄糖条件下，活体HeLa细胞中26的吸收动态的定量分析 (b)。(c) 和 (d) 经静脉注射26后，无肿瘤小鼠（N）和携带肿瘤小鼠（T）的体内生物成像。使用Living Imaging软件量化了肿瘤的相对荧光强度 (d)。经参考文献65许可改编。版权归Royal Society of Chemistry (2020) 所有。

2.3. 其他类型的葡萄糖衍生物

尽管放射性和荧光标记系统目前最为常见且在临床应用中占据主导地位，但其他类型的报告分子和成像技术也可以与标记的葡萄糖衍生物探针结合使用。例如，Shulman和Cline在1998年展示了核磁共振（NMR）的应用。他们开发了一种新的方法，使用示踪探针[1-13C]-葡萄糖，在活体大鼠的骨骼肌中测量细胞内葡萄糖水平。与第2.1节讨论的先前放射性标记探针不同，这种葡萄糖同位素是NMR自旋活性的，而不是放射性的，因此可以通过13C NMR光谱检测到。这项研究表明，使用非侵入性的13C NMR技术可以量化活体生物体内的细胞内葡萄糖浓度。与传统的基于活检的生化测定和葡萄糖吸收动力学方法相比，NMR技术具有多个优势，包括能够进行体内测量和随时间重复测量的能力。相关技术磁共振光谱（MRS，类似于MRI）也可以使用13C同位素并识别代谢物，尽管有限的灵敏度仍然是一个重大限制。动态核极化（DNP）技术可以提高13C信号的灵敏度，从而实现超极化13C示踪剂的实时成像。在2014年的研究中，Brindle和Rodrigues等人使用超极化[U-2H, U-13C]葡萄糖28来追踪小鼠肿瘤模型中的糖酵解活性，并通过13C MRS和光谱成像进行疗效评估（图19）。这项研究表明，使用28可以实时成像小鼠肿瘤内的糖酵解过程，并能敏感地检测到化疗后的代谢变化。图19。

(a) 注射0.35 mL, 100 mM 28后，皮下EL4和LL2肿瘤、大脑、心脏、肝脏和肾脏组织的代表性13C MR光谱。(b) IV注射0.4 mL, 200 mM 28后，EL4肿瘤携带小鼠的代表性化学位移选择性图像。经参考文献67许可改编。版权归Springer Nature America, Inc. 所有。另一种应用于此领域的特殊光谱技术是受激拉曼散射（SRS）成像，这是一种无标记的振动光谱方法，能够通过检测特征的化学键振动（如C–D（碳-氘）伸缩振动，在2120 cm?1处）来实现活细胞中代谢过程的高时空分辨率成像。2014年，Cheng和Li等人使用氘标记的葡萄糖29（葡萄糖-d7，图20a）作为示踪剂来观察单个活细胞中的代谢重编程。在这种探针中，葡萄糖的氢原子被氘替代，这比荧光类似物或FDG（氟脱氧葡萄糖）具有明显优势，因为氘替代不会显著改变结构或物理和生理特性。29在水溶液中的拉曼光谱在2120 cm?1处呈现出一个独特的峰，对应于C–D键的振动。这个峰位于拉曼光谱的静默区域，该区域不受内源性分子的干扰，为SRS成像目标物质提供了独特的机会。利用SRS显微镜的高空间和时间分辨率，作者成功监测了单个活癌细胞中葡萄糖的动态代谢过程（图20b–f）。图20。

(a) 29（葡萄糖-d7）的结构及其拉曼光谱，显示来自C–D的宽独特峰，约2120 cm?1。(b) SRS信号与29浓度的线性关系。(c) 和 (d) 在无葡萄糖的DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）中，分别与(c) 25 mM 29或(d) 25 mM葡萄糖共培养后的PANC1细胞的SRS成像。(e) 通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物）测定，比较了29与常规葡萄糖的细胞存活性。经Springer Nature出版物引用许可改编。2015年，Min和Hu等人开发了一种新型葡萄糖类似物30（3-O-丙炔基-d-葡萄糖，3-OPG，图21a），其中包含炔基振动标签，也可以通过SRS观察到。他们成功地可视化了活细胞和组织中的葡萄糖吸收活性。与C–D伸缩振动类似，炔基在细胞静默光谱区域内表现出特征性的伸缩振动，此处约为2129 cm?1（图21b）。细胞成像实验确认，30可以通过SRS成像以高灵敏度和速度高效地可视化。在鼠皮下肿瘤异种移植模型中，30优先在肿瘤的增殖区域积累，在坏死区域的积累较少（图21d和e）。这项研究进一步突显了SRS显微镜的潜力，使得使用结构几乎与天然葡萄糖相同的简单葡萄糖类似物进行葡萄糖吸收和代谢的振动成像成为可能。图21。

(a) 30（3-OPG）的结构。(b) PBS中30溶液的自发拉曼光谱（黑色）和与30共培养的HeLa细胞（红色）。(c) 在2000 cm?1（非共振）和1655 cm?1（蛋白质酰胺I）下获得的活体HeLa细胞中30的SRS成像，显示了同一细胞区域。(d) 和 (e) 在U-87 MG肿瘤异种移植组织中30的SRS成像。肿瘤增殖区域（d）出现强烈的30信号。两个肿瘤区域交界处的30信号对比度高（e）。经参考文献69许可改编。版权所有（2015）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim。2018年，受到振动光谱学中同位素编辑策略的启发，Min团队合成了13C标记的3-O-丙炔基-d-葡萄糖31（3-OPG-13C3，图22a）。引入13C后，振动频率从2129 cm?1显著下降到2053 cm?1（下降了76 cm?1，图22b）。这一变化使得同时使用29（图20）和31（2060 cm?1和2250 cm?1）成为可能，并且可以以全光谱分辨率映射单个活细胞中的葡萄糖摄取和整合过程（图22c）。

(a) 31（3-OPG-13C3）。(b) 在PBS中葡萄糖-d7的自发拉曼光谱（深青色），与葡萄糖-d7孵育的PC-3细胞（绿色），在PBS中3-OPG（橙色），在PBS中31（黑色），与31孵育后再次与31孵育的PC-3细胞（蓝色）。(c) 与29孵育后与31孵育的PC-3细胞进行的双色SRS成像，突出显示了葡萄糖的整合（2133 cm?1，青色高亮）、葡萄糖的摄取（2053 cm?1，红色高亮）和共振非吸收（2000 cm?1）。经参考文献70许可改编。版权所有（2018）Royal Society of Chemistry。2019年，Min和Zhang等人开发了一种基于氘谱迹的显微技术（STRIDE），重新利用了氘标记的葡萄糖29（葡萄糖-d7）来进行高分辨率的葡萄糖代谢成像（图23a和b）。成像研究证实，29可以作为有效的代谢探针，通过SRS显微镜监测大分子的合成，因为C–D键的累积在细胞和小鼠组织中都能被成功定量检测到（图23c）。这项研究展示了STRIDE技术能够实现对从葡萄糖合成的大分子的高分辨率代谢成像，为了解代谢异质性和动态代谢过程提供了重要见解。

(a) 拉曼光谱已标准化为C–D峰的强度，分别显示了29溶液（红色）、未标记的PC3细胞（黑色）和用29标记的PC3细胞（蓝色）。下图中的框选区域对应于细胞沉默区。（b）29标记的SRS成像实验步骤。（c）在P30小鼠摄入10% 29溶液或水10天后，进行2,150 cm?1的SRS成像，以观察C–D标记在各种组织中的整合情况。经参考文献71许可改编。版权所有（2019）Springer Nature Limited。生物发光成像是一种强大的检测技术，其中荧光酶催化荧光素底物的氧化，从而产生光。该技术具有极高的灵敏度、出色的信噪比，非常适合非侵入性体内成像。2019年，Goun和Maric等人引入了生物发光葡萄糖示踪剂BiGluc（CLP + 32（GAz4）），用于体外和体内的实时、非侵入性、连续监测葡萄糖摄取。BiGluc由笼状的荧光素三芳基膦酯（CLP）和叠氮化物修饰的葡萄糖衍生物32组成。一旦进入细胞，这两种成分会发生生物正交反应（Staudinger连接），释放出荧光素，在荧光酶存在下产生可量化的光信号（图24a和b）。这种策略使得BiGluc能够在不进行侵入性操作的情况下，长时间有效地成像并量化活体小鼠中的葡萄糖代谢流。研究表明，BiGluc在评估疾病模型（如癌症）中的葡萄糖摄取方面表现可靠，其性能与广泛使用的示踪剂18F-FDG相当（图24c–f）。

(a) 基于生物发光的探针示意图，用于体外实时成像葡萄糖吸收。(b) BiGluc方法在体内的示意图。(c) 携带4T1-luc或4T1-luc-GLUT1?/? no. 1肿瘤的小鼠的生物发光成像。(d) 4T1-luc和4T1-luc-GLUT1?/? no. 1细胞形成的皮下肿瘤的葡萄糖摄取比较。与4T1-luc对照组相比，4T1-luc GLUT1缺陷肿瘤的信号强度降低了38%。(e) 携带4T1-luc或4T1-luc-GLUT1?/? no. 1肿瘤的小鼠的18F-FDG PET/CT扫描代表性照片。(f) 通过PET测量的4T1-luc和4T1-luc-GLUT1?/? no. 1肿瘤的葡萄糖摄取。4T1-luc-GLUT1?/? no. 1是通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术敲除GLUT1基因（Slc2a1）的4T1-luc细胞系衍生物。经参考文献55许可改编。版权所有（2019）Springer Nature America, Inc. 2022年，Chen和Liang等人引入了一种生物正交发光荧光探针（Glu-HT-Me + 33 (AzGlu2)），利用芳基膦诱导的光诱导电子转移（PeT）和Staudinger连接反应实现实时、无需洗涤的细胞葡萄糖摄取监测。该探针由两种成分组成：Glu-HT-Me和33。Glu-HT-Me包含一个激发态分子内质子转移（ESIPT）荧光团（HT-Me）和一个三苯基膦基团，两者通过酯键共价连接（图25a）。33是一种叠氮化物修饰的葡萄糖衍生物。这两种试剂发生Staudinger连接反应，从而可以检测葡萄糖的摄取。采用无需洗涤的方法，该探针能够实时有效地追踪活细胞中的葡萄糖摄取（图25b），并在癌细胞中观察到比正常细胞更高的荧光强度。

(a) 生物正交发光荧光探针Glu-HT-Me + 33的示意图，用于无需洗涤的实时动态监测和成像细胞葡萄糖摄取。(b) 使用探针（Glu-HT-Me + 33）在有无预冲洗的情况下进行共聚焦荧光成像，以实时监测葡萄糖摄取。经参考文献72许可改编。版权所有（2022）American Chemical Society。放射性标记探针（表1），如1（18F-FDG），具有高灵敏度，能够进行定量体内代谢成像，并作为肿瘤和其他疾病临床诊断的金标准。当与CT或MRI结合使用时，它们可以提供解剖-功能融合信息。荧光探针，包括13（2-NBDG）和SiR-葡萄糖类似物25a–b，可以实时追踪活细胞中的葡萄糖摄取；它们操作简便，适合在活细胞和小动物模型中进行成像。NMR/SRS探针，例如[1-13C]葡萄糖27、氘标记的葡萄糖29和31，对葡萄糖的化学结构和生理功能影响很小或几乎不产生影响，从而能够研究真实的内源性葡萄糖代谢，其高空间分辨率使其非常适合在单细胞和组织水平上研究代谢异质性。像BiGluc（CLP + 32 (GAz4)这样的生物发光探针具有高的信噪比和低背景干扰，适合长期非侵入性体内成像。表1

代表性葡萄糖类似物示踪剂的关键特性：

探针 标记类型 λex/λem 化学性质 生物应用
1–7 放射性同位素（18F标记） —/γ射线（511 keV） 18F标记（半衰期110分钟），放射化学纯度>95%，葡萄糖类似物，依赖GLUT/SGLT运输，通过磷酸化/肾重吸收保留 PET成像（肿瘤糖酵解、大脑代谢）、GLUT/SGLT功能区分、糖尿病/肿瘤研究、药物疗效监测
8–11 放射性同位素（99mTc标记） —/γ射线（140 keV） 99mTc标记（半衰期6.02小时），放射化学纯度≥90%，亲水（logP ≤ ?1.5），主要通过肾脏排泄，结合葡萄糖转运蛋白/蛋白以保留 SPECT成像（肺癌/肉瘤/黑色素瘤）、肿瘤炎症区分、肾重吸收评估、18F-FDG的低成本替代品
12 NBD（荧光团） 470/538 nm 可通过GLUT介导的运输进行代谢 不对称葡萄糖运输分析、GLUT抑制剂筛选
13 NBD（荧光团） 475/550 nm GLUT底物，通过C6磷酸化保留 活细胞葡萄糖摄取成像、癌症/正常细胞区分、GLUT抑制剂筛选
14a–b Acedan（双光子荧光团） 780 nm（双光子）/501 nm 双光子作用截面（δmax）：95 GM（14a）/155 GM（14b），pH不敏感（pH 4.0–10） 深部组织成像、结肠癌组织切片诊断、抗癌药物疗效监测
15 Pyropheophorbide a（荧光团） 667/679, 720 nm NIR发射、GLUT结合能力、线粒体靶向、线粒体损伤 共聚焦分析GLUT介导的摄取、胶质瘤的NIR成像、光动力疗法（线粒体损伤）
16 Cypate（荧光团） 780/810 nm 多价树枝状阵列，cypate作为内核，d-(+)-葡萄糖胺作为外围基团 肿瘤靶向、血流监测和血管成像、肿瘤摄取机制评估
17 Cy5.5（NIR荧光团） 675/694 nm 与d-葡萄糖胺结合，不依赖GLUT 肿瘤细胞成像、长期肿瘤保留，无需葡萄糖饥饿
18 Cy3（荧光团） 550/570 nm 光稳定性好，无需葡萄糖饥饿，与d-葡萄糖竞争性结合 实时癌细胞摄取成像、抗癌药物筛选、流式细胞术/共聚焦分析
19 IRDye 800CW（NIR荧光团） 785/794 nm GLUT1底物，高NIR组织穿透力 体内肿瘤成像、肿瘤活力监测，信噪比优于Cy5.5-2DG
20 CyNA（NIR荧光团） 740/815 nm 比IRDye 800CW 2-DG更好的细胞渗透性，与d-葡萄糖立体选择性结合；在血清中稳定 NIR成像癌细胞、评估癌症和成纤维细胞之间的摄取差异
21a–c 铼(i)多吡啶（荧光团） 405/500–600 nm（MLCT发射） α-d-葡萄糖悬挂物，发射寿命0.22–4.32 μs，结合Con A（Ka = 4.4 × 105–5.8 × 105 M?1） 荧光传感器用于Con A的检测、E. coli黏附素结合测定、HeLa细胞中的线粒体定位成像
22 Cy3（花青素染料） 488/564–606 nm GLUT底物，比2-NBDG敏感10倍 通过胰岛素/AMPK途径的肌细胞葡萄糖摄取成像、抗糖尿病药物筛选
23a–b Cy3（荧光团） 488/564–606 nm 23a：两性离子（净电荷=0），23b：阴离子（净电荷=?1），不依赖GLUT 体外细胞成像以区分GLUT介导的葡萄糖摄取、斑马鱼葡萄糖摄取监测、抗糖尿病药物筛选
24a–e DCPO（NIR荧光团） 580/670 nm 基于PEG的连接器，依赖GLUT1的摄取 体外癌细胞成像、GLUT1表达评估、潜在的体内肿瘤成像
25a-b 硅罗丹明（NIR荧光团） 25a: 648/676 nm; 25b: 650/676 nm 25a：净电荷=0，依赖GLUT的摄取；25b：净电荷=+1，无高效细胞摄取 活细胞葡萄糖摄取成像、癌症/正常细胞区分、抗癌药物疗效监测
26 DCI衍生物（深红色荧光团） 530/685 nm C1型d-葡萄糖结合物，依赖GLUT的摄取 线粒体定位、低细胞毒性
27 NMR示踪剂（13C标记） —/13C NMR（葡萄糖：93.2/97.1 ppm） 99% 13C富集，需要[1-13C]-甘露醇/Cr作为标准，体内检测限约0.07 mM 无侵入性地测量大鼠肌肉内的葡萄糖，区分葡萄糖运输/磷酸化障碍
28 NMR示踪剂（13C标记 + 氘化） —/13C NMR（葡萄糖：63–99 ppm） 99% 13C富集 + 完全氘代，T1极化约8.9 ± 0.6 s，检测6-磷酸葡萄糖酸（PPP中间体） 体内肿瘤糖酵解成像、戊糖磷酸途径活性评估、潜在的脑/前列腺肿瘤成像
29 RS探针（氘标记） —/SRS（C–D键振动：约2120 cm?1） 无毒，细胞沉默区域的C–D信号，追踪葡萄糖衍生的脂质/蛋白质/糖原 体外单个活细胞从头脂质生成的代谢成像，区分大分子特定的葡萄糖利用
30 SRS探针（炔基标记） —/SRS（CC伸缩振动：2129 cm?1） 依赖GLUT，无毒，检测限1.4 mM，无非特异性保留 体外活细胞葡萄糖摄取成像、体内肿瘤异质性成像、神经元/小鼠脑组织成像
31 SRS探针（13C标记炔基标记） —/SRS（13C13C伸缩振动：2053 cm?1） 依赖GLUT，无光谱干扰，比率定量（C–D/13C13C） 体外二元色成像单个活细胞中的葡萄糖摄取/整合 体外小鼠组织成像
32 生物发光探针（叠氮标记） //生物发光（荧光素-荧光酶反应） 依赖GLUT，无毒，与CLP高反应性，无巯基交叉反应 活细胞葡萄糖摄取成像、非侵入性连续成像，区分正常/癌细胞，灵敏度与18F-FDG PET相当
33 荧光探针（叠氮标记）葡萄糖类似物 437/560 nm 依赖GLUT，与Glu-HT-Me反应，无HNO干扰，检测限96 nM，无毒 无需洗涤的实时葡萄糖摄取成像，区分癌症/正常细胞，在高葡萄糖环境中优于2-NBDG

然而，这些探针也有明显的局限性。放射性标记探针依赖于加速器产生同位素（例如18F），导致成本高昂，且其较短的半衰期（例如11Ct1/2 = 20分钟）限制了成像时间窗口，同时它们的空间分辨率也有限。荧光探针通常具有较差的组织穿透性，特别是在可见光范围内，这阻碍了深层组织成像；有些探针具有光毒性，分子电荷和立体体积显著影响细胞摄取效率。对于NMR/SRS探针，NMR灵敏度低，需要高浓度加载，而SRS则依赖于复杂的先进显微设备，操作复杂，因此不太流行。此外，大多数探针都有共同缺陷，即它们通过代谢捕获起作用，干扰正常的糖酵解过程，因此无法实时追踪内源性葡萄糖的动态变化。本节讨论的探针能够研究葡萄糖依赖的过程，但正如所显示的，它们都仅仅是葡萄糖的衍生物，因此不能直接用于研究葡萄糖本身。本综述的剩余部分将主要关注那些能够与葡萄糖相互作用或在与葡萄糖相互作用时产生变化的探针。正如我们将看到的，这些探针所利用的许多过程都是在本节早期使用葡萄糖衍生系统时已经展示和描述的。

3. 基于酶的探针

正如我们在本综述中将看到的，已经开发出多种技术来检测葡萄糖。一个关键的例子是使用葡萄糖特异性酶进行传感。这些系统通常依赖于监测由葡萄糖氧化酶（GOx）产生的葡萄糖相关代谢物（例如过氧化氢或抗坏血酸）的形成或消耗。本节中的所有示例都将基于这一简单原理，采用多种方法来检测这些产物及其局部效应。GOx已被集成到电化学和荧光传感器中，主要是固态/固体支持的系统，还有一些较为小众的技术我们将在本节末尾简要介绍。从基于GOx的电化学葡萄糖探针开始，1992年Ewing和Abe等人构建了一种超小型葡萄糖探针34，使用了含有葡萄糖氧化酶的铂沉积碳环微电极（图26a）。这种探针的响应时间非常快，仅为270毫秒，并且与电极尖端的结构直径成线性关系。开发该探针的一个关键目标是在单个细胞的细胞质中动态测量葡萄糖水平。为了证明这一点，将探针植入到一个大型多巴胺细胞（Planorbis corneus）中，用于检测葡萄糖的瞬时浓度。在注入葡萄糖（2皮升，3摩尔浓度）后，植入的探针显示出了电信号的增强（图26b），这证实了其预期的应用。探针能够在超小环境中检测葡萄糖浓度的变化，为实时监测单个细胞的呼吸和代谢活动及其对刺激/化学事件（如神经细胞刺激或药物操作）的反应提供了可行的平台。

(a) 基于GOx的葡萄糖微探针34的示意图。A：超小型碳环电极（A1，石英毛细管；A2，薄碳膜；A3，环氧树脂；A4，汞）；B：铂涂层；C：嵌入的葡萄糖氧化酶；D：白蛋白膜涂层。 (b) 放置在Planorbis corneus大型多巴胺神经元中的电极观测到的电流。经参考文献73许可改编。版权归1992年美国化学学会所有。

2000年，Kennedy和Jung等人开发了一种微米级探针35，用于监测单个朗格汉斯岛（Langerhans岛）细胞外空间中的葡萄糖和氧气水平（图27a–c），这在与葡萄糖刺激的胰岛素分泌相关的研究中起着关键作用。这种探针基于表面固定了GOx的铂微电极制造而成。记录到的葡萄糖信号有显著的波动，这些波动似乎以2.4分钟的周期振荡并达到最大浓度。这些振荡在对照组中不存在，表明是葡萄糖水平的真正波动而非系统误差（图27d）。这些波动表明胰腺β细胞的代谢发生了实时振荡，这一点通过同时追踪氧气消耗和钙离子水平的波动得到了证实。

沿着类似的思路，Danielsson和Asif等人在2010年引入了一种基于ZnO纳米棒的电化学探针36，用于细胞内葡萄糖检测（图28a和b）。这种探针由生长在银涂层硼硅酸玻璃毛细管（直径0.7微米）尖端的六边形ZnO纳米棒组成，并涂有GOx酶。由于酶是通过强静电相互作用与ZnO结合的，而不是共价结合的，因此它保持了全部活性（图28c）。这种细胞内生物探针表现出快速响应（<1秒），并且具有从0.5微摩尔到1000微摩尔的宽线性检测范围（图28d）。Danielsson等人使用这种探针测量了人类脂肪细胞和非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵细胞中的细胞内葡萄糖浓度（图28e和f），证明了胰岛素在这两种细胞类型中显著激活了葡萄糖转运系统。这些结果突显了这种探针在活细胞中进行生物学相关葡萄糖测量的能力。与其他各种纳米探针系统相比，这种纳米结构的电化学探针提供了更高的灵敏度和实时检测能力。

(a) 和 (b) 通过低温生长在Ag涂层玻璃毛细管上生长的ZnO纳米棒的扫描电子显微镜图像，在固定酶之前捕获的。 (c) 基于ZnO纳米棒的用于细胞内葡萄糖测量的电化学探针36的示意图。 (d) 使用ZnO纳米棒涂层探针绘制的电化学电位差与葡萄糖浓度（0.5–1000微摩尔）之间的关系图。 (e) 和 (f) 在测量过程中单个青蛙（Xenopus laevis）卵细胞和单个人类脂肪细胞（脂肪细胞）的显微图像。 (g) 和 (h) 在酶涂层之前在铝涂层玻璃毛细管上生长的纳米片ZnO的扫描电子显微镜图像。图a–f：经参考文献75许可改编。版权归2010年Elsevier B.V.所有。图g和h：经参考文献76许可改编。版权归2010年Elsevier B.V.所有。酶的固定和稳定性是基于酶的电化学生物探针中最关键的因素，因此，识别出能够提供大表面积以增强酶负载同时还提供适合维持酶活性的微环境的支撑材料是至关重要的。基于上述示例，Danielsson和Fulati等人开发了一种基于纳米蜂窝ZnO的细胞内葡萄糖生物探针37（图28g和h），使用铝作为支撑材料而不是银来促进蜂窝结构。在相同条件下，纳米片ZnO材料的灵敏度比上述ZnO纳米棒高1.8倍。在广泛的葡萄糖浓度范围内（500纳摩尔–10毫摩尔），观察到了对数线性葡萄糖依赖的电化学电位差。这种看似微小的变化，仅通过改变ZnO的形态，就显著提高了性能，克服了之前只能在线性响应低于1毫摩尔时才会出现的微电极的局限性。与之前一样，这种探针成功用于在人类脂肪细胞和青蛙卵细胞中检测葡萄糖，展示了一种提高GOx固定可用表面积的简单方法。由于缺乏(i)非破坏性的、特定于代谢物的细胞内分析传感器和(ii)精确的细胞靶向技术，单细胞水平的细胞内研究面临重大挑战。为了克服这些限制，2016年Pourmand和Nascimento等人开发了GOx功能化的纳米毛细管38（图29a和b），能够直接测量单个细胞内的游离葡萄糖。这种纳米探针能够检测微摩尔级的葡萄糖，其线性检测范围为0.1–8毫摩尔，PBS和DMEM溶液中的灵敏度值分别为20.40毫伏每毫摩尔和13.89毫伏每毫摩尔。纳米毛细管通过在尖端共价固定GOx来实现功能化。在GOx催化的葡萄糖氧化过程中，会产生葡萄酸，导致pH值下降和可测量的阻抗变化。校准研究表明，阻抗变化与溶液中的葡萄糖浓度之间存在直接相关性。这种纳米探针被用来量化人类成纤维细胞和转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中的细胞内葡萄糖水平（图29c），证明癌细胞中的葡萄糖水平始终显著高于非癌细胞。这一创新平台作为诊断工具具有巨大潜力，可以区分不同组织样本中的癌细胞和非恶性细胞，以及监测原位癌症的进展，从而能够广泛开展关于癌细胞代谢异质性、与细胞转化相关的过程以及葡萄糖代谢与细胞增殖和转移之间相关性的机制研究。

2016年，Tong和Wang等人开发了一种基于毛细管电泳（CE）的生物传感器39，用于检测单个人类胃癌细胞（MGC80-3细胞）中的葡萄糖。这些生物传感器是通过将单壁碳纳米管（SWNTs）、葡萄糖氧化酶和戊二醛（GA）的生物复合材料固定在一个钯纳米粒子（PdNPs）改性的铂电极上来制造的（图30）。SWNTs通过其结合位点与GOx相互作用，增强了电子转移，增加了生物传感器的表面积，并在与PdNPs结合时提高了其催化活性。可以检测到从2.0微摩尔到1.0毫摩尔范围内的葡萄糖浓度，检测限为0.5微摩尔。在MGC80-3细胞提取物和单个细胞中分别发现了平均葡萄糖含量为20.0飞摩尔和20 ± 6飞摩尔（n = 10），计算出的质量检测限为1.0飞摩尔（注射体积为2.0纳升）。与其他基于CE的电化学葡萄糖探针相比，这种生物传感器39表现出更好的灵敏度、稳定性、无干扰特性和长期操作可靠性。值得注意的是，无需复杂的预处理即可确定单个MGC80-3细胞和细胞提取物中的葡萄糖浓度。这项技术在分析单个细胞中的其他化学物种方面具有广泛应用潜力，可以使用不同的酶或生物活性物质。

2019年，Huang和Liao等人专注于细胞内葡萄糖监测，开发了一种单纳米线葡萄糖探针40，通过将铂纳米粒子（PtNPs）沉积在SiC@C纳米线上并固定葡萄糖氧化酶来实现细胞内葡萄糖的电化学检测。GOx氧化葡萄糖产生的H2O2产物具有氧化还原活性，能够被PtNPs电催化还原产生电流（图31a）。使用人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为细胞模型，在正常和高血糖条件下评估细胞内葡萄糖水平（图31b）。当葡萄糖纳米线探针插入HUVEC时，观察到了明显的安培信号（图31c，曲线c），当细胞暴露于高血糖条件时电流显著增加（图31c，曲线d）。使用这些纳米线研究HUVECs和对照细胞对50毫克/毫升葡萄糖处理的反应显示，前者的细胞内葡萄糖浓度平均高出1.6–1.7倍（图31c和d，n = 5）。使用这种探针成功实现了细胞内葡萄糖水平的实时监测。

另一种常用的基于GOx的传感技术是基于荧光的传感。Kopelman和Xu等人在2002年开发的PEBBLE（Probes Encapsulated By Biologically Localized Embedding）酶基生物探针41是一个早期的例子，用于实时细胞内葡萄糖测量。这种探针同时固定了GOx和一种氧气敏感染料及一种参考染料。GOx催化葡萄糖氧化反应，导致局部氧气耗尽，而氧气敏感染料可以检测到这一点。测量O2敏感染料的荧光输出（相对于参考值）。该系统的较小尺寸（约45纳米直径）和惰性基质使其能够插入活细胞，对生物功能的物理或化学干扰最小。这些PEBBLE提供了一种稳健的方法来光学测量细胞内葡萄糖，避免了与自由酶和荧光染料系统相关的典型问题，为细胞内测量提供了更通用和可靠的工具。2005年，Strano和Barone等人报道了一种溶相近红外（NIR）探针42，该探针利用单壁碳纳米管来检测β-D-葡萄糖。他们采用非共价修饰方法，使用电活性的K3Fe(CN)63?物种来创建电子转移位点。通过葡萄糖氧化酶（GOx）产生的H2O2可逆还原铁氰化物，从而便于将其用于传感应用（图32a）。一个200 μm × 1 cm的微渗析毛细管（截留分子量13 kDa）被填充了碳纳米管溶液，使葡萄糖能够通过膜扩散到传感介质中。当这种探针放置在人体皮肤下时，产生的荧光可以清晰地在二维空间中被映射出来（图32b）。这种(6,5)-碳纳米管的荧光发射（λmax = 994 nm）对局部葡萄糖浓度的变化有80秒的响应延迟（图32c）。这种延迟是由于葡萄糖通过200 μm的渗析膜扩散，随后发生GOx催化的反应以及下游的电子转移，这些过程调节了纳米管的荧光。该探针的响应遵循I型吸附等温线，在糖尿病患者典型的血糖范围内（1至8 mM）具有合适的灵敏度，检测限为34.7 μM（图32d）。在这样一种毛细管设备中使用近红外信号具有优势，因为它可以植入厚组织或全血介质中，信号可以穿透几厘米。这种被动的光学响应基底可以通过外部的微型激发和检测系统实现持续的体内分析物检测。这种方法相比电化学和光电化学传感方法具有明显的优势。图32。

(a) 碳纳米管光学探针42的工作原理。(b) 手指上的微渗析毛细管（左图），示意图展示了促进葡萄糖扩散的多孔结构（中图），以及使用碳纳米管光学探针进行葡萄糖检测的过程（右图）。(c) 碳纳米管光学探针对葡萄糖添加的荧光响应。(d) 响应函数将碳纳米管光学探针的归一化强度与血糖检测范围内的局部葡萄糖浓度联系起来。改编自参考文献81。版权所有（2005）Springer Nature Limited。不幸的是，葡萄糖氧化产生的H2O2可能会与生物分子发生原位反应，从而引发氧化应激，可能导致细胞损伤，因此基于GOx的传感系统可能不适宜使用，导致损伤或调节紊乱，从而产生不可靠的结果。因此，开发完全生物相容的酶基系统非常有趣，例如Tang和李等人在2013年的工作。他们使用无活性形式的葡萄糖氧化酶（apo-GOx）修饰金纳米探针，开发出一种生物友好且高度敏感的纳米探针43，用于活细胞中葡萄糖消耗的定量分析和成像。82这种探针系统基于无活性葡萄糖氧化酶修饰的金纳米颗粒（AuNPs）与二聚糖-FITC（荧光素异硫氰酸盐，一种胺类荧光染料）之间的荧光/ F?rster共振能量转移（FRET）（图33a）。当检测到葡萄糖时，由于无活性葡萄糖氧化酶对葡萄糖的亲和力高于对二聚糖的亲和力，FITC的荧光会被恢复。该纳米探针对葡萄糖比其他单糖和其他生物分子具有极高的选择性，并且检测限低至5 nM。由于其低毒性和AuNPs可靠的细胞摄取能力，该系统成功实现了癌细胞内葡萄糖消耗的成像（图33b和c）。

(a) 使用AuNPs-apo-GOx-Dextran-FITC纳米探针43检测葡萄糖。(b) 和(c) 分别在无葡萄糖的RPMI 1640培养基中孵育0小时、4小时和12小时的HepG2细胞的共聚焦荧光图像(b)和归一化荧光强度(b)。改编自参考文献82。版权所有（2013）美国化学学会。2008年，Willner和Gill等人利用荧光而不是电化学方法构建了一种集成量子点（QD）比率荧光纳米探针44（图34），83通过H2O2的氧化来调节其光物理性质，从而调节输出。生物素化的GOx（B-GOx）与FITC-亲和素修饰的QDs结合，通过观察其对QD荧光的影响来追踪过氧化氢的酶促生成。随着生物催化氧化的进行，生成的H2O2会淬灭QD的发光，因此QD荧光淬灭的程度直接与葡萄糖浓度相关。Willner和Gill能够证明该探针具有高灵敏度（0.1 mM）和对结构相关的抗坏血酸的选择性，展示了有效的新葡萄糖检测QD-GOx平台。图34。

Willner和Gill的H2O2检测CdSe/ZnS QDs 44的示意结构和传感机制，用于葡萄糖浓度的比率分析。改编自参考文献83。版权所有（2008）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。继续利用H2O2检测葡萄糖的趋势，2015年Liu及其同事探索了DNA和CeO2纳米粒子（nanoceria）作为过氧化氢传感器45。84从CeO2纳米粒子出发，这些众所周知的纳米酶上吸附了荧光标记的DNA，H2O2会置换DNA，导致荧光强度增强20倍（图35a）。添加nanoceria后，荧光几乎完全熄灭，表明DNA被吸附；而H2O2迅速释放DNA，使荧光重新出现（图35b）。该系统显示出对H2O2的高灵敏度，检测限低至130 nM（图35c）。当与GOx结合使用时，可以在缓冲溶液中以低至8.9 μM的灵敏度检测到葡萄糖。血清中的葡萄糖也能被成功检测到，其结果与商用葡萄糖仪获得的结果相当，证明了基于DNA的生物传感器通过过氧化氢间接监测葡萄糖的潜力。图35。

(a) 通过置换从nanoceria上吸附的荧光DNA来检测H2O2。(b) 添加nanoceria后，以及添加H2O2后，自由FAM-A15 DNA的荧光照片。(c) 从(b)稀释后的溶液的荧光光谱。改编自美国化学学会发表的参考文献84。银纳米粒子（AgNPs）已被证明是对多种荧光基探针（包括有机染料和量子点）非常有效的淬灭剂。2015年，Yu和李等人报道了一种使用AgNPs和苝探针的新型AgNP-苝探针46用于葡萄糖检测（图36）。85苝探针非共价结合在AgNP表面，从而淬灭其荧光。添加葡萄糖后，外源性的GOx催化葡萄糖氧化，生成H2O2，从而蚀刻AgNPs，最终释放苝荧光团。由此产生的荧光激活使得葡萄糖定量成为可能，提供了一个简单、选择性强且灵敏的葡萄糖检测系统。该方法的适用性在人类血清样本中得到了验证。图36。

使用AgNP-苝探针46检测葡萄糖。改编自参考文献85。版权所有（2015）皇家化学学会。2019年，Lin和Jiang等人提出了一种信号放大策略，通过合成GOx结合的银纳米立方体（AgNC-GOx）47和超灵敏的Ag+荧光探针Ag+-FP（图37a）86来检测葡萄糖。86通常H2O2的生成会导致AgNC转化为Ag+，进而激活Ag+-FP探针的荧光。信号放大源于倍增效应，每个H2O2分子会产生2个Ag+离子。因此，AgNC-GOx/Ag+-FP系统显著放大了荧光信号，灵敏度高达50 μM。这种方法对葡萄糖和H2O2显示出极好的特异性和选择性（图37b），并在不同的细胞系中得到了验证（图37c和d）。图37。

(a) 通过AgNC-GOx/Ag+-FP介导的荧光放大实现葡萄糖检测。(b) AgNC-GOx/Ag+-FP对各种糖类的荧光响应（最终浓度2.5 mM）。(c) (d) 不同细胞类型中AgNC-GOx/Ag+-FP的归一化荧光变化及荧光图像。改编自参考文献86。版权所有（2019）美国化学学会。传统的荧光探针通常依赖于单一信号响应（“开/关”模型），这使它们容易受到分析物无关因素的干扰，如探针浓度的变化、样品内的光散射、激发光强度的波动以及发射收集效率的不稳定性。双发射技术可以克服许多这些问题，因此成为近期荧光传感研究的重点。2020年，Ni和Hu等人开发了一种高灵敏度的荧光微流控探针48，结合了碳量子点（CQDs）、碲化镉量子点（CdTeQDs）气凝胶和葡萄糖氧化酶，用于尿液中的葡萄糖检测（图38a）。87专门为此目的合成的CQDs在520 nm处发出绿色荧光，而CdTe QDs在620 nm（λem = 620 nm，λex = 365 nm）处发出红色荧光。通过H2O2选择性淬灭红色荧光，利用了比率荧光机制，而绿色荧光保持不变。荧光比率的变化使得探针的颜色在365 nm照射下肉眼可见地发生了明显变化。随着葡萄糖浓度的增加，微探针的荧光颜色从红色清晰地转变为绿色（图38b）。此外，可以通过红色与绿色荧光比率（R/G值）来量化葡萄糖浓度。在生物学相关的葡萄糖浓度范围0–13 mM内，R/G值显示出强烈的线性相关性，检测限达到0.223 mM，满足尿液葡萄糖检测的要求。这些发现突显了这种微流控探针在开发便携、成本效益高且实时的尿液葡萄糖检测设备方面的潜力。图38。

(a) 用于葡萄糖检测的C/CdTe-GOx气凝胶微传感器48。(b) 通过检测含有不同葡萄糖浓度的尿液获得的微探针荧光图像（从左(a)到右(g)，葡萄糖浓度从0 mM增加到26 mM）。改编自参考文献87。版权所有（2020）皇家化学学会。继续在双发射领域的研究，2021年Wang和Guo等人基于内过滤效应（IFE）设计了一种双发射比率荧光探针49，用于同时检测葡萄糖和胆固醇。88这种探针49是通过将银纳米粒子AgNPs/UiO-66-NH2和o-苯二胺（OPD）结合开发的（图39）。通过硼氢化钠还原AgNO3在UiO-66-NH2上原位合成AgNPs/UiO-66-NH2，OPD作为显色底物。在葡萄糖氧化酶和胆固醇氧化酶（ChOx）存在下，葡萄糖和胆固醇都被氧化成H2O2。生成的H2O2使AgNPs被蚀刻成银离子（Ag+），从而将OPD原位转化为荧光产物2,3-二氨基吩嗪（DAP）。由于Ag NPs/UiO-66-NH2的发射光谱与DAP的吸收/激发光谱的重叠，随着葡萄糖和胆固醇浓度的增加，荧光强度比（F555 nm/F425 nm）增加，伴随着从蓝色到黄绿色的明显颜色变化。这种荧光探针复合薄膜可以方便地集成到便携式智能颜色变化设备中，利用智能手机进行实时现场监测葡萄糖和胆固醇水平。该设备的分析性能与标准检测方法相当。图39。

智能手机光学装置用于检测葡萄糖（Glu）和胆固醇（Chol）的示意图，使用基于AgNPs/UiO-66-NH2的比率荧光探针49。改编自参考文献88。版权所有（2021）美国化学学会。荧光金属-有机框架（MOF）纳米材料相较于传统荧光传感器具有许多优势，包括丰富的活性位点、高孔隙率、大的比表面积和优异的化学稳定性。这些特性使MOF平台成为该领域的一个突出新玩家，有可能实现定制的现场荧光成像和检测方法。2022年，Jiang和Liang等人开发了一种基于铁的MOF纳米溶胶50，成功应用于葡萄糖检测。89这种材料在弱酸性条件下表现出类似于过氧化物酶的活性，能够通过过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB），生成荧光TMBox（图40）。这种纳米催化过程使溶液的颜色从无色变为蓝色。为了利用这一反应，在系统中引入了0.25 mg/mL的GOx和不同浓度的葡萄糖溶液。当葡萄糖浓度在0.2至20 μM之间时，荧光发射强度持续增加，检测限为0.1 μM，颜色从无色变为浅蓝色。图40。

纳米溶胶50通过基于MOF-Fe催化氧化TMB的机制检测葡萄糖，涉及H2O2。改编自参考文献89。版权所有（2022）Elsevier B.V。2016年，张和王等人开发了一种光学葡萄糖生物传感器51，该传感器使用对葡萄糖敏感的水凝胶膜作为葡萄糖感应材料和Fabry–Perot腔体。这种膜是通过逐层组装工艺制备的，材料包括部分氧化的右旋糖酐（PO-Dex）、壳聚糖和葡萄糖氧化酶（GOx）。该传感器通过GOx响应葡萄糖，葡萄糖的氧化会降低膜内的局部pH值，从而引起pH敏感水凝胶的膨胀。由于膜在其反射光谱中表现出Fabry–Perot干涉条纹，因此可以通过干涉条纹的变化来检测葡萄糖引起的膨胀。该传感器具有很高的抗干扰能力，因为它不会对常见的干扰物（如二醇类物质，参见第6节中的硼酸基探针）或电活性化合物产生响应，即使在高浓度下也是如此。此外，该传感器在宽广的葡萄糖浓度范围内表现出可逆的响应，在临床相关的范围内（0–20 mM）具有线性响应。薄膜设计使得传感器能够快速响应，适用于实时连续的葡萄糖监测。

除了基于荧光的系统外，电化学发光（ECL）也可以作为传感手段。作为电化学和光谱方法的结合，ECL具有几个显著的优点，例如对施加的电位和光发射的更好控制与分离。与荧光不同，ECL不需要光激发，这减少了干扰并可以提高灵敏度。2016年，陈和徐等人开发了一种电化学发光成像设备52，用于分析单个细胞内的葡萄糖。如图41所示，单个细胞被限制在镀金氧化铟锡（ITO）载玻片上的细胞大小的微孔中，然后同时用鲁米诺、Triton X-100和葡萄糖氧化酶处理。Triton X-100的存在破坏了细胞膜，使细胞内的葡萄糖释放到微孔中，与GOx反应生成过氧化氢。过氧化氢在正向电位下引发鲁米诺的发光。使用电荷耦合设备可以在60秒内捕获单个ITO载玻片上64个细胞的发光。添加Triton X-100和葡萄糖氧化酶后，所有微孔中的发光增强，表明成功检测到了单个细胞水平的葡萄糖。当细胞被饥饿以降低细胞内葡萄糖水平时，发光强度减小，证实了葡萄糖与发光之间的相关性。观察到的单个细胞间葡萄糖水平的变化突显了细胞内葡萄糖的高异质性。

图41展示了电化学发光成像设备52和用于快速分析单个细胞内葡萄糖的检测方法的示意图。经美国化学学会（Copyright (2016)）许可改编。

脑葡萄糖被广泛认为是阿尔茨海默病（AD）的关键生物标志物，尤其在AD早期阶段具有很高的特异性。可激活的MRI对比剂是各种疾病的强大诊断工具。2022年，赵和刘等人开发了一种特异性针对葡萄糖的MRI对比剂53，称为ZIF-8/GOx@MnO2@PEG（ZGMP）。这种对比剂由多孔沸石咪唑框架-8（ZIF-8）构建，通过GOx功能化，并进一步用MnO2和PEG（聚乙二醇）修饰。在这个系统中，葡萄糖的检测是通过GOx催化葡萄糖氧化产生的H2O2将Mn(i)还原为Mn(ii)来间接进行的。新生成的Mn(ii)会影响水中的相邻氢原子，缩短它们的弛豫时间，从而增强MRI信号（图42a）。实验表明，这些由葡萄糖驱动的级联反应增强了T1和T2 MRI信号，其中T1加权成像（T1WI）在AD模型中显示出更好的脑葡萄糖可视化性能。为了进一步验证这一点，通过将Aβ42寡聚体注射到脑实质中建立了早期AD小鼠模型（图42b–f）。基于53的MRI显示，这些早期AD小鼠的葡萄糖摄取量显著高于对照组小鼠，这通过感兴趣区域（ROI）的明显T1WI信号增强得到了证实。值得注意的是，这项研究消除了对专用扫描序列的依赖，为早期AD诊断提供了一种潜在的简化方法。然而，尽管这种方法很有前景，但它仍然存在局限性，部分原因是这种成像过程不可逆，难以准确进行葡萄糖浓度的线性分析，以及相对较慢的动力学响应。

(a) 用于诊断AD的葡萄糖激活MRI对比剂53。(b) 和 (c) 分别在注射53后的15分钟、30分钟和45分钟对AD小鼠和正常小鼠进行脑部MRI扫描。(d)–(f) 比较正常小鼠和AD小鼠的(d)信噪比（SNR）、(e)目标组织与噪声比（TNR）和(f) 1/T1。经美国化学学会（Copyright (2022)）许可改编。

除了AD之外，异常的脑葡萄糖代谢还与许多脑部疾病密切相关，特别是肿瘤。2022年，吴和刘等人介绍了一种近红外光学传感器54，用于实时体内监测脑脊液中的葡萄糖波动。该传感器利用Nile Red和Pt复合物作为FRET对，嵌入聚合物基质中，创建了一个比率敏感的氧传感器。GOx也被整合到聚合物纳米粒子中，实现了高灵敏度的葡萄糖依赖性NIR荧光。研究团队展示了他们的NIR传感器在长时间内的连续葡萄糖监测中的实用性，证明了在皮下植入后多周内对血糖波动的一致跟踪。通过颅骨直接注射到侧脑室中，能够在ND2:SmoA1转基因小鼠中观察到升高的脑葡萄糖摄取率，与野生型对照组相比，突出了肿瘤携带小鼠的独特葡萄糖摄取特征。

(a) 纳米粒子传感器54的结构和制备。(b) 在正常大脑和肿瘤性大脑中纳米粒子传感器的葡萄糖感应机制。(c) 和 (d) 在大脑和背部植入纳米粒子传感器的野生型小鼠和ND2:SmoA1小鼠的光学图像。(e) 通过双侧Student's t检验评估两个位置的标准化发光强度比率（*p < 0.001）。经美国化学学会（Copyright (2022)）许可改编。

基于GOx的酶类探针具有几个显著的优势：它们具有高特异性，这归功于GOx的特定催化活性，能够选择性地靶向葡萄糖并有效区分结构相似的干扰物，如抗坏血酸。这些探针能够实现高灵敏度，许多探针可以实现低浓度检测。例如，DNA-铈纳米粒子系统的葡萄糖检测限为8.9 μM（图35），MOF-Fe基荧光探针的检测限为0.1 μM（图40），满足了生物样本中微量葡萄糖分析的要求。它们还显示出强大的实时和动态监测能力。像PEBBLES（45 nm）这样的探针允许实时检测细胞内葡萄糖，而ZnO纳米棒电化学探针的响应时间小于1秒，非常适合研究快速代谢过程。这些探针还与多种检测平台兼容，包括电化学、荧光、电化学发光和磁共振成像，适用于各种场景，如细胞内检测、血清分析和脑成像。此外，它们具有广泛的样本适用性，已成功应用于多种样本类型，包括单细胞、血清和脑脊液，从而为阿尔茨海默病和癌症等疾病的诊断提供了关键的代谢信息。

表2展示了代表性基于酶的探针的关键特性。例如，经过apo-GOx修饰的金纳米探针可以通过避免H2O2引起的氧化损伤来实现生物友好型的检测。通过使用纳米载体（如ZnO纳米片和MOFs），可以提高酶的固定效率，从而提高稳定性。一个显著的例子是纳米蜂窝状ZnO，由于其较高的酶负载能力，其灵敏度比纳米棒高出1.8倍，这突显了优化固定对稳定酶功能的有效性。通过调节载体的形态可以扩大这些探针的响应范围。例如，ZnO纳米片作为载体，可以将线性检测范围扩展到500 nM–10 mM，覆盖生理和病理状态下的葡萄糖浓度，使得这些探针在各种生物学和临床应用中更加多用途。为了最小化检测干扰，开发比率荧光或电化学发光系统已被证明是有价值的。例如，CQDs/CdTe量子点比率探针通过信号比率校正消除了环境干扰，确保了更可靠的检测结果。此外，特定的纳米材料（如碳纳米管）可以用来屏蔽电活性干扰物，进一步减少电化学检测中的不必要的信号干扰。优化探针的大小和穿透性对于扩大其应用范围至关重要。设计超小探针（如45纳米的PEBBLEs）可以通过促进其高效进入细胞来便于细胞内检测。对于深层组织成像，采用NIR荧光探针或MRI探针（例如5392）可以增强对组织的穿透力，克服传统探针在访问深层生物结构时的限制。基于荧光蛋白的探针作为一个补充方案出现，利用基因编码的荧光团和葡萄糖结合蛋白实现非酶促的、可逆的葡萄糖传感。基于FRET的荧光蛋白系统用于葡萄糖传感具有诸如低细胞毒性、遗传易操作性和亚细胞定位能力等优点——即使是通过抗转基因沉默的设计也能在植物模型中实现。然而，它们也面临一些权衡：长时间成像下的光漂白、早期FRET探针的荧光动态范围有限，以及依赖于复杂的显微设置。本综述的下一部分将展示这些探针的实例，探讨设计创新、机制多样性及其在生物医学中的应用，说明它们如何可以解决迄今为止讨论的酶促系统的一些局限性。

4. 基于荧光蛋白的探针

非酶促蛋白也被用于葡萄糖传感系统中，例如利用某些蛋白的FRET特性。本部分将概述这类探针的发展，大致展示该领域的进步方向以及可以使用的各种荧光机制。

4.1 第一代基于FRET的荧光蛋白探针

通常，基于FRET的荧光蛋白系统结合了不同类型的荧光蛋白和葡萄糖结合蛋白（GBP），以及一种对葡萄糖具有高选择性的周质结合蛋白（PBP）。它由两个球状结构域通过一个灵活的铰链区域连接而成。当葡萄糖底物结合时，底物诱导的铰链扭曲发生，导致适当位置的荧光团分开，从而产生浓度依赖的FRET介导的荧光信号。正如我们将看到的，这些系统主要基于Frommer及其团队开发的系统。2003年，Frommer和Fehr等人通过将成熟的大肠杆菌周质葡萄糖/半乳糖结合蛋白（GGBP）分别连接到其N端和C端的蓝色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）上，开发出了荧光蛋白探针55（FLIPglu-170n）。这使得能够在活细胞中直接测量葡萄糖水平（图44a），并且葡萄糖结合时附着的荧光团之间的FRET会减小。测量到的结合亲和力为170 nM，FRET比率的最大变化为0.23（图44b）。然而，葡萄糖传感范围仅限于0.02–1.5 μM，远低于生理浓度。通过将Phe-16突变为丙氨酸，亲和力成功降低到0.59 mM，生成了葡萄糖传感范围得到改善的探针56（FLIPglu-600μ）（图44c）。使用探针56，作者能够在COS-7细胞中监测生理范围内的可逆葡萄糖动态，并观察到从细胞外介质中去除葡萄糖会导致细胞内葡萄糖水平预期地减少，证实了这些首批FRET蛋白葡萄糖传感器的可逆性（图44d–f）。这项开创性工作为类似FRET蛋白探针的进一步发展奠定了基础，其中一些探针的选择将在文中详细讨论。

(a) 基于FRET的荧光蛋白探针的工作原理。(b) 55（红色）和56（蓝色）的葡萄糖滴定曲线。(c) 55对各种糖类的选择性。(d)–(f) 在COS-7细胞中对55的体内表征。(d) 平均YFP-CFP发射图像显示55位于细胞质中，被排除在细胞核（N）和溶酶体（▲）之外。(e) 细胞发射图像被整合以生成每个细胞随时间的单一比率值，箭头标记葡萄糖的添加。(f) 添加并检测到葡萄糖后，通过灌注无葡萄糖溶液去除外部葡萄糖。改编自Elsevier出版的参考文献94。在此基础上，2008年，Ribalet和John等人在四种哺乳动物细胞系（COS-7、CHO、HEK293和C2C12）中表达了探针56，以研究细胞内葡萄糖的稳态。当添加细胞外葡萄糖时，细胞内FRET比率随着细胞内葡萄糖水平的增加而迅速降低。相反，当去除细胞外葡萄糖时，FRET比率以相似的速度（τ = 15至40秒）恢复到初始值，正如Frommer之前所展示的。例如，在图中，未分化的C2C12细胞在高葡萄糖环境中培养，并反复暴露于10 mM细胞外葡萄糖时，未加葡萄糖时的基线YFP/CFP发射比为2.0。10 mM细胞外葡萄糖将其降低到1.75，反映了葡萄糖进入细胞，并在去除葡萄糖后恢复到基线2.0，表明细胞内葡萄糖被清除。

(a) 转染了葡萄糖探针56的细胞内的FRET比率。红色表示高比率或低葡萄糖水平，而绿色表示低比率或高葡萄糖水平。(b) 整个细胞中的平均FRET比率（YFP/CFP；上方轨迹），YFP发射（中间轨迹）和CFP发射（下方轨迹）。经许可改编自参考文献95。版权归Springer Nature所有（2008年）。探针56也被证明对于在COS-7细胞中成像葡萄糖波动非常有价值，尽管观察到的动态范围相对有限，使其不适合用于专门的用途，如高通量筛选小干扰RNA（siRNA）文库以鉴定调节葡萄糖的蛋白质。2005年，Frommer和Deuschle等人发现，通过截短连接器或靶向插入荧光团，可以实现PBP和荧光团之间更紧密的别构耦合。后来Frommer和Takanaga等人在2008年利用这一点开发了探针57（FLIPglu-600μΔ13-M），他们去除了复合连接器区域，并用黄色荧光蛋白citrine替换了对pH和氯化物敏感的荧光蛋白eYFP，以提高鲁棒性。这使得葡萄糖添加时的比率变化增加了4倍，对于相关探针58（FLII12Pglu-600μ），通过将荧光团插入一个暴露在表面的环中，比率变化增加了10倍。通过定点突变进一步优化了这些蛋白质的氨基酸长度以及连接器的长度。这产生了高度优化的探针59（FLII12Pglu-δ4）和60（FLII12Pglu-δ6）等（图46a）。没有观察到连接器长度与Δ比率之间的直接相关性，表明连接器的组成可能比其长度更有影响力，支持了荧光团的空间排列在优化FRET效率中起关键作用的前提。在转染了FLII12Pglu的HepG2细胞系中进行的葡萄糖灌注实验证实了这一点（图46b和c），其中探针61（FLII12Pglu-700μδ6）在灵敏度和动态范围上有了显著提高，使得在体内可靠地分析葡萄糖成为可能（图46d）。这些葡萄糖纳米探针的增强灵敏度不仅提高了体内葡萄糖波动测量的准确性，还为使用高含量筛选方法筛选siRNA文库和药物化合物提供了潜在平台。

(a) FLII12Pglu的域结构，包括N端His标签、MglB（细菌d-半乳糖结合周质蛋白）的N端12个氨基酸、eCFP（增强型蓝色荧光蛋白）、MglB的13-304个氨基酸、C端复合连接器以及Citrine-eYFP。(b) 随着外部葡萄糖浓度增加，表达FLII12Pglu的HepG2细胞中的比率变化随时间的变化。(c) FLII12Pglu系列纳米探针的体内葡萄糖表观通量滴定曲线。(d) (56, 蓝色)和(61, 粉红色)的体内检测范围。经许可改编自参考文献97。版权归Elsevier B.V.所有。葡萄糖是胰腺β细胞分泌胰岛素的主要生理刺激。它的摄取和磷酸化启动并调节许多下游途径，最终导致胰岛素分泌，这一过程仍然只有部分被理解。2012年，Baltrusch和Kaminski等人使用探针61来可视化小鼠胰腺β细胞内葡萄糖浓度对变化外部葡萄糖水平的响应。从时间依赖的葡萄糖浓度图中，他们计算了葡萄糖的流入、流出和代谢率。同时，使用探针61和fura-2乙酰甲基酯（一种荧光钙指示剂）进行了葡萄糖/钙动态的实时监测，结果发现需要4 mM的葡萄糖浓度才能触发β细胞内钙浓度([Ca2+]i的增加，而大的[Ca2+]i振荡需要7 mM的葡萄糖（图47）。在缺乏葡萄糖的情况下，KATP通道阻断剂glibenclamide无法诱导显著的[Ca2+]i振荡，这支持了葡萄糖通过非KATP通道机制触发[Ca2+]i动态的观点。这项研究揭示了葡萄糖必须达到一个临界浓度才能触发[Ca2+]i的增加并随之引发[Ca2+]i的振荡，展示了使用基于蛋白质的FRET基葡萄糖传感器（如探针61）的巧妙应用。

MIN6细胞中同时实时检测细胞内葡萄糖浓度（顶部）和钙动态（底部）。在灌注过程中，MIN6-FLIPglu细胞负载了fura-2乙酰甲基酯。如条形所示，灌注在有无葡萄糖（10 mM）或KCl（40 mM）的条件下进行。经许可改编自参考文献98。版权归Elsevier B.V.所有。探针61现在被广泛使用，因为它提供了一个出色的动态葡萄糖传感平台，特别是在存在其他传感基元和分析物的情况下。这包括关于海马体和突触活动之间的联系的研究，或者神经元兴奋毒性（过度释放兴奋性神经递质谷氨酸）以及其他基于FRET的探针，用于ATP和AMPK（AMP激活的蛋白激酶）的研究。最近，在2023年，Schmachtenberg和García等人在其对Müller细胞代谢的研究中使用了探针61，它与视网膜功能相关。他们使用探针61和基因编码的乳酸探针Laconic来研究视网膜Müller细胞中的代谢物通量。通过这种方法，在暴露于0 mM的细胞外乳酸时观察到了细胞内乳酸的减少，证实乳酸通量受浓度梯度控制（图48c）。当引入10 mM的葡萄糖时，荧光水平返回到基线，表明这些细胞在基础条件下处于饱和的细胞内葡萄糖浓度（图48d）。

(a) 和 (b) 乳酸探针（Laconic）和葡萄糖探针61的表达代表图像。(c) 和 (d) Müller细胞中乳酸和葡萄糖探针的动态范围。经许可改编自参考文献101。版权归Elsevier B.V.所有。2012年，Polizzi和Behjousiar等人在中国仓鼠卵巢细胞模型系统中表达了基于蛋白质的葡萄糖和谷氨酰胺生物探针进行原位监测。葡萄糖生物传感器FLIPglu600μΔ11Aphrodite（62）再次由Frommer等人提供，而谷氨酰胺探针是根据大肠杆菌谷氨酰胺PBP和citrine开发的。选择这些探针是因为它们的线性测量范围与研究中观察到的细胞内代谢物浓度非常匹配。这些探针协同工作，葡萄糖结合会破坏对齐并导致FRET减小，而谷氨酰胺结合则使荧光团聚集在一起增加FRET。因此，本研究构建的模型系统能够原位实时监测葡萄糖和谷氨酰胺，可能有助于优化生物制药过程。当然，葡萄糖的作用不仅限于哺乳动物系统，但不幸的是，Frommer等人开发的探针并不适合用于植物，因为它们存在转基因沉默现象，这导致FRET（荧光共振能量转移）的变化降低到了无法检测的水平。因此，Frommer和Deuschle等人开发了一套基于FRET的探针，这些探针在拟南芥RNA沉默突变体的表皮细胞和完整根部的葡萄糖检测中具有更高的灵敏度。103 这些探针的设计基于一种融合蛋白，该蛋白由eCFP翻译融合到一个葡萄糖结合蛋白MglB的亲和突变体以及eYFP组成。同样，通过去除连接器并进行定点诱变，他们生成了探针63（FLIPglu-600μΔ13-P）、64（FLIPglu-170nΔ13-P）、65（FLIPglu-2μΔ13-P）和66（FLIPglu-3.2mΔ13-P）。这些名称分别表示葡萄糖亲和力（“…μ”对应600 μM、170 nM、2 μM和3.2 mM）以及特定的连接器缺失（“Δ13”）（见图49a）。通过在sgs3和rdr6转基因沉默突变体中表达这些探针，克服了沉默问题，产生了强烈的荧光信号，并具有良好的可逆性（见图49b和c）。FRET评估显示，探针63（FLIPglu-600μΔ13-P）的最大比率变化为-0.26，显著优于原始探针56（FLIPglu-600μ），也优于最初在哺乳动物细胞系统中观察到的比率。图49







(a) 探针63-66的葡萄糖结合等温线。(b) 拟南芥野生型和沉默突变体中探针64的代表性荧光图像。(c) 探针63在叶表皮细胞细胞质中因葡萄糖诱导的FRET变化。改编自Oxford Plant Cell发表的参考文献103。

4.2
“开关型”蛋白质荧光蛋白探针

具有光学特性的蛋白质开关是设计型生物探针的一个典型例子，它们对环境刺激表现出不同的响应，表现为“开/关”信号。这些分子在生物探针的开发、变构酶的制造以及定制纳米生物材料的构建方面具有巨大的潜力。2008年，Daunert和Hamorsky等人通过将GBP插入到光蛋白aequorin（AEQ）中，开发了一种生物发光分子开关67。104 当加入葡萄糖时，GBP会发生构象变化，使AEQ的两个部分结合在一起，“开启”生物发光并实现葡萄糖检测（见图50a和b）。观察到了100 nM的惊人灵敏度（见图50c）。这项研究标志着首次将AEQ分割成片段，并且这些片段在分子识别时显示出“开”状态下的生物发光，为基因工程嵌合蛋白的应用提供了宝贵的见解，为设计和生产其他独特的设计型生物探针铺平了道路。图50







(a) 示意图展示了从“关闭”状态到“开启”状态转变的蛋白质开关的组成部分和触发机制。(b) 67在溶液中的结构。(c) 葡萄糖响应下的荧光强度I，以相对光单位（RLU）表示。经参考文献104许可改编。版权所有（2008）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。

4.3 基于单壁碳纳米管（SWNT）的荧光蛋白探针

尽管如前所述，PBPs已被用于构建电化学和FRET探针，但它们作为纳米级设备的直接驱动器的应用仍然相对有限。2011年，Strano和Yoon等人将GBP与单壁碳纳米管结合，开发了一种新型葡萄糖探针，利用SWNT的近红外特性实现了优异的组织穿透性和高灵敏度（见图51a）（参见第3节中早期的SWNT研究）。105 GBP首先在大肠杆菌中异源表达，然后通过酰胺键与羧基化的聚（乙烯基醇）包裹的SWNTs（cPVA/SWNTs）共价结合。这种探针68（GBP-PVA/SWNT）的发射强度随着不同葡萄糖浓度的变化而可逆地变化（见图51b和c），在低于10 mM的浓度范围内呈线性响应，但在高于10 mM的浓度范围内表现出非线性行为。计算出的平衡结合常数表明该复合物适用于检测生理浓度范围内的葡萄糖（2–30 mM）。这种新的葡萄糖探针68为新型探针的开发提供了一个创新平台，建立在之前的酶学研究基础上，具有在微流控阀和谐振器等领域的潜在应用前景，并预计将在生物医学领域的葡萄糖监测中得到广泛应用，以推动相关技术的发展。图51







(a) 用于葡萄糖识别的探针68的结构。(b) 在加入葡萄糖前后探针68的荧光光谱（λex = 785 nm）。(c) 在10 mM糖浓度下探针68的选择性示意图。经参考文献105许可改编。版权所有（2011）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。

4.4 基于频域FLIM的荧光蛋白探针

上述基于强度的FRET荧光蛋白探针非常适合实时监测细胞内葡萄糖的变化。然而，由于eCFP和eYFP在重复曝光过程中的光漂白或串扰问题，它们不适合用于持续监测活细胞中的葡萄糖动态。为了解决这个问题，Jin等人在2012年提出了一种使用时域或频域荧光寿命成像显微镜（TD-FLIM/FD-FLIM）的新方法。106 FD-FLIM通过测量供体荧光寿命来确定FRET系统的变化，而供体荧光寿命与探针浓度无关，反映了FRET中供体到受体能量传递的化学和物理特性。这种方法较少受到供体和受体荧光团之间串扰的影响。虽然TD-FLIM在短时间尺度上可视化细胞内分子动态时相对较慢，但FD-FLIM通过测量相位移动和荧光强度的减弱来改进这一点（见图52a）。为了最小化光漂白对探针寿命的影响，选择了具有增强光漂白抗性的荧光蛋白AcCFP1和mCherry，并与GBP结合设计出了荧光蛋白探针69（AcGFP1-GBPcys-mCherry）。Jin及其同事证明，FD-FLIM能够有效地监测C2C12细胞内的葡萄糖浓度，并以高空间和时间分辨率追踪葡萄糖动态的变化。他们发现高葡萄糖浓度出现在细胞膜附近，而低葡萄糖浓度则出现在细胞核附近（见图52b和c），这是FRET强度成像无法实现的（见图52d和e）。由于FRET-FLIM受光散射和探针蛋白局部浓度的影响较小，因此可以通过旋转盘共聚焦显微镜进行三维成像。这因此使得在动物模型中连续监测细胞内葡萄糖浓度成为可能，为研究糖尿病的病理生理学提供了新的工具。图52







(a) FD-FLIM成像的工作流程。(b)–(e) C2C12细胞质中葡萄糖浓度的FD-FLIM成像。(b) 假彩色寿命图;(d) 单色强度FRET图像。69在单个C2C12细胞两个感兴趣区域的寿命(c)和荧光强度(e)是通过参考文献106许可改编的。版权所有（2012）Sage Publications。

4.5 基于单个荧光蛋白的探针

尽管基于FRET的葡萄糖探针功能性强，但大多数探针的荧光变化幅度仅为10–70%，这限制了它们在高通量筛选和监测微妙代谢变化中的应用。因此，Yang和Hu等人在2018年开发了一系列基于单个荧光蛋白的比率计量型且反应灵敏度高的葡萄糖探针。107 为此，他们将循环排列的黄色荧光蛋白（cpYFP）与细菌的周质葡萄糖/半乳糖结合蛋白结合，并通过诱导突变来优化亲和力。最终得到了四种探针70（FGBP27μM，原始非突变体）、71（FGBP380μM）、72（FGBP1mM）和73（FGBP3.2mM），其Kd值分别为27 μM、380 μM、1.0 mM和3.2 mM。探针72显示出较大的动态范围，特别适用于实时追踪细胞代谢的微妙变化。该探针在体外显示出约700%的荧光变化，几乎是之前报道的基于FRET的探针的10倍，使其成为一种高度响应的基因编码探针。这些探针被用于监测活大肠杆菌细胞中的葡萄糖转运。107 他们发现细胞在10分钟内吸收葡萄糖以维持生理葡萄糖水平，并且野生型与mlc敲除细胞之间表现出不同的葡萄糖摄取模式和代谢特征。与上一代基于FRET的荧光蛋白探针相比，FGBP探针仅依赖于一个荧光蛋白，并且本质上是比率计量的，这允许不管指示蛋白浓度如何变化都能对荧光信号进行内置标准化。这些探针提供了一种特定的、简单的葡萄糖检测工具，可用于体外监测，并为体内葡萄糖代谢的实时监测提供了非侵入性方法。图53







(a) 基于单个荧光蛋白的葡萄糖探针的结构和传感机制。(b) GGBP的晶体结构，突出了葡萄糖结合口袋。标出了三个增强探针亲和力的位点（A213、L238和N256）。(c) 在25 mM葡萄糖孵育前后表达72或cpYFP的细胞的荧光图像。(d) 在添加葡萄糖20分钟后，72在大肠杆菌JM109（DE3）细胞中的动态变化。改编自英国皇家化学学会发表的参考文献107。2019年，Kitaguchi和Mita等人开发了一系列称为Green Glifon的葡萄糖探针，这些探针可以覆盖宽广的葡萄糖浓度范围，并将它们与Ca2+探针一起用于活细胞的多色成像，以研究葡萄糖代谢与Ca2+信号调节之间的层次关系和相互关系。108 Green Glifon探针围绕细菌的d-半乳糖结合周质蛋白（MglB，特异性葡萄糖/半乳糖结合剂）和Citrine GFP构建，后者在其发色团附近由两个亮氨酸拉锁肽连接。报道了三种探针（74 Green Glifon50、75 Green Glifon600和76 Green Glifon4000），其EC50值分别为50、600和4000 μM，对葡萄糖的响应导致荧光强度变化约7倍（见图54a和b）。这些探针的荧光强度变化与葡萄糖浓度相对应，能够检测8.1 μM到15 mM范围内的葡萄糖。从机制上讲，葡萄糖结合导致发色团的质子化/脱质子化，引起所需的光谱变化（在约400 nm处减少，在约500 nm处增加）。Green Glifon系列能够在各种细胞区室（包括细胞质、质膜和线粒体）中可视化葡萄糖动态，并被用于体内监测秀丽隐杆线虫咽部肌肉中的葡萄糖动态，以及测量小鼠的血糖水平。此外，在小鼠的MIN6 m9 β细胞中，76与Ca2+敏感染料Rhod2（Rhodamine 2）的双色成像使得能够监测葡萄糖代谢与Ca2+动态之间的关系，提供了一种高时空分辨率的工具。图54







(a) Citrine、MglB和Green Glifon系列74–76的结构域。(b) 74–76（Green Gilfon-50、600和4000）对葡萄糖的剂量-响应曲线。(c) Green Glifon系列对葡萄糖相关代谢物的特异性。(d) 表达76和加载Rhod2的MIN6 m9细胞的连续图像。(e) MIN6 m9细胞中76（绿色）和Rhod2（红色）的荧光强度随时间的变化过程。经参考文献108许可改编。版权所有（2019）美国化学学会。这些方法扩展了该领域，现已广泛使用荧光蛋白葡萄糖探针。2021年，Looger和Keller等人报道了一种单波长探针77（iGlucoSnFR），用于多种模型生物体内的葡萄糖成像，包括细胞、果蝇幼虫和斑马鱼幼虫。109 以T. thermophilus中的GBP为骨架，在残基326和327之间插入了循环排列的绿色荧光蛋白（cpGFP）。结合位点残基经过突变以降低葡萄糖亲和力，筛选后获得了探针77。该探针在PBS中的KD值为2.3 mM，荧光响应（ΔF/F）为1.95。还开发了一个与红色荧光蛋白mRuby2融合的版本，用于比率计量测量和细胞分型，以及一系列亲和力覆盖四个数量级的变体（1 μM–10 mM）。在对培养的大鼠星形胶质细胞和神经元进行荧光强度成像和时域快速傅里叶变换（FFT）成像时，展示了葡萄糖浓度的变化（见图55a和b）。在这个实验中，红色荧光强度与振荡幅度呈负相关，表明神经元对葡萄糖的相对不敏感，而星形胶质细胞则较为敏感（见图55c和d）。此外，这些探针还被用于多种应用，例如表征葡萄糖转运蛋白的功能和抑制剂的特性，在果蝇的中枢神经系统中发现了潜在的葡萄糖转运途径（图55e和f），以及追踪活体斑马鱼幼虫的肌肉、肝脏和大脑中的葡萄糖转运（图55g和h）。特别感兴趣的是胰岛素和肾上腺素对葡萄糖代谢的影响。表达77的斑马鱼为研究诸如运动介导的肌肉和肝脏中的葡萄糖摄取等机制提供了一种切实可行的方法，这对于解决肥胖和糖尿病等病症具有重要的医学意义。图55



使用77在多种模式生物中进行葡萄糖成像。(a)–(d) 细胞培养。(a) 每个通道的荧光图像。(b) 刺激频率下的像素级时间傅里叶变换（FFT）幅度，指示葡萄糖浓度的变化。(c) FFT幅度（x轴）与mRuby2信号（y轴）之间的相关图。(d) 来自星形胶质细胞和神经元的振荡刺激的平均荧光响应（ΔF/Favg）。(e) 和 (f) 完整的果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）外植体。(e) 响应的FFT幅度（顶部）。响应的FFT相位/延迟（底部）。(f) 来自腹侧神经索的ΔF/Favg迹线。(g) 和 (h) 活体斑马鱼的肌肉和大脑。(g) 77对肾上腺素添加的生物体级响应。(h) 肾上腺素诱导的荧光变化。经参考文献109许可改编。版权所有（2021）作者。2022年，随着Tsuboi和Mita等人开发了Red Glifons，可用的颜色范围得到了扩展。这些红色葡萄糖探针是通过将细菌d-半乳糖结合周质蛋白MglB中的d-葡萄糖/d-半乳糖结合域插入到红色荧光蛋白mApple的发色团附近设计的。与之前一样，两个由亮氨酸拉链序列衍生的连接肽被放置在mApple和MglB域之间，然后通过变体合成和筛选进行优化，得到了探针78（Red Glifon），在10 mM葡萄糖存在下能够产生三倍的F/F0变化。随后在MglB的F39位点进行突变，产生了探针79（Red Glifon 300）和80（Red Glifon 3000），它们具有不同的EC50值。有趣的是，他们还发现了突变蛋白81（Red Glifon nega），它对葡萄糖没有反应，因此可以用作验证和确认延时成像过程中伪影的负对照（图56a）。所有三种Red Glifon变体都表现出562 nm的激发峰和591 nm的发射峰（图56b和c）。当与绿色荧光指示剂结合时，Red Glifons能够可视化葡萄糖与其他代谢物（如ATP、乳酸和丙酮酸）之间的相互作用（图56d–g）。因此，这些红色葡萄糖探针成为研究能量代谢中复杂相互作用的多色成像工具包。图56



(mApple、MglB以及衍生的Red Glifon系列79、80和81的结构域。(b) 和 (c) 79和80的激发和发射光谱。(d) 暴露于0–25 mM葡萄糖的79和MaLionG共表达HeLa细胞的连续图像。刻度尺代表20 μm。(e) 79和MaLionG共表达HeLa细胞的荧光强度（FI）的时间进程。(f) 79和Green Lindoblum共表达HeLa细胞的FI时间进程。(g) 79和Green Pegassos共表达HeLa细胞的FI时间进程。经参考文献110许可改编。版权所有（2022）Elsevier Ltd。基于GBP及其同源物（如MglB）的荧光蛋白探针具有几个显著的优势（表3）。首先，它们具有高特异性和靶向性，因为它们依赖于对葡萄糖的天然特异性识别，从而避免了结构类似物的干扰。它们的遗传编码和与活细胞的兼容性是值得注意的特点，因为它们可以通过基因工程引入细胞或生物体中进行长期稳定表达，消除了对外部标记的需求。这使它们适合于活细胞、组织和模式生物（包括小鼠、斑马鱼和拟南芥）的动态监测，正如我们所见。这些探针还具备强大的实时动态监测能力。它们的信号响应通常基于FRET和构象变化，是可逆的，能够追踪细胞内葡萄糖的快速波动。此外，它们提供了高时空分辨率；当与荧光寿命成像等技术结合使用时，它们可以分辨出细胞内的葡萄糖分布，例如细胞膜和核附近的浓度梯度，克服了传统强度成像的限制。它们的广泛应用是另一个关键优势，因为它们已经在动物细胞（例如肝细胞、神经元）、植物（例如拟南芥根细胞）和微生物（例如大肠杆菌）中成功使用，为跨物种的葡萄糖代谢研究提供了一个统一的工具。此外，它们还具有多分子共成像的潜力：像Green Glifons和Red Glifons这样的单荧光蛋白探针可以与其他荧光探针（例如钙指示剂、乳酸探针）结合，以揭示葡萄糖在相关过程中的作用。表3



代表性的基于荧光蛋白的探针的关键特性


探针
荧光蛋白对/组分
葡萄糖解离常数（Kd）
λex/λem
生物应用



55
CFP/YFP-GGBP
0.17 μM
436/480, 535 nm
葡萄糖定量，COS-7细胞葡萄糖动力学



56
CFP/YFP-GGBP突变体
0.59 mM
436/480, 535 nm
多细胞葡萄糖成像，细胞内葡萄糖稳态监测



57
eCFP/Citrine-eYFP-MglB
600 μM
433/485, 528 nm
HepG2细胞葡萄糖通量分析，GLUT功能研究



58
eCFP/Citrine-eYFP-MglB
583 ± 8.0 μM
433/485, 528 nm
高通量siRNA筛选，葡萄糖稳态监测



59
eCFP/Citrine-eYFP-MglB
600 ± 64 μM
433/485, 528 nm
在多种生理缓冲液（例如Hanks平衡缓冲液）中的葡萄糖感应，HepG2细胞代谢检测



60
eCFP/Citrine-eYFP-MglB
660 ± 160 μM
433/485, 528 nm
高灵敏度葡萄糖检测，GLUT相关基因筛选



61
eCFP/Citrine-eYFP-MglB
600 μM（体内K0.5）
433/485, 528 nm
胰腺β细胞葡萄糖-Ca2+动态分析；糖尿病相关代谢研究



62
ECFP/EYFP-GGBP突变体
—
430/465, 520 nm
非侵入性监测CHO细胞培养物中的细胞内葡萄糖



63
eCFP/eYFP-MglB
600 μM
433/485, 528 nm
拟南芥叶片表皮/根部的葡萄糖通量分析



64
eCFP/eYFP-MglB
170 nM
433/485, 528 nm
检测拟南芥根部的低葡萄糖水平



65
eCFP/eYFP-MglB
2 μM
433/485, 528 nm
拟南芥根部的葡萄糖监测，叶片葡萄糖通量研究



66
eCFP/eYFP-MglB
3.2 mM
433/485, 528 nm
拟南芥叶片表皮中的高葡萄糖范围检测



67
GBP-AEQ生物发光开关
—
—/469 nm（生物发光）
敏感的葡萄糖检测，临床血糖监测



68
GBP-PVA/SWNT光学调制器
—
658, 785/973, 1001, 1041 nm
生理葡萄糖感应，近红外连续监测



69
AcGFP1-GBPcys-mCherry
0.13 mM
485/525, 610 nm
细胞内葡萄糖动态监测；葡萄糖摄取/清除速率的定量



70
cpYFP/GGBP融合，非突变体
27 μM
400, 485/528 nm
体外葡萄糖检测，微妙代谢变化的追踪



71
cpYFP/GGBP融合，N256S突变体
380 μM
400, 485/528 nm
生理葡萄糖范围感应



72
cpYFP/GGBP融合，L238S突变体
1.0 mM
400, 485/528 nm
大肠杆菌中的实时葡萄糖监测，野生型与mlc敲除细胞代谢比较



73
cpYFP/GGBP融合，A213R突变体
3.2 mM
400, 485/528 nm
宽范围的葡萄糖检测，生理葡萄糖感应



74
Citrine/MglB融合，F39Y突变体
44 μM
460, 495/510–550 nm
小鼠血糖测量，低葡萄糖范围感应



75
Citrine/MglB融合，F39Y N40Y突变体
590 μM
460, 495/510–550 nm
HeLa细胞器官特异性葡萄糖成像（细胞质/核/质膜)


76
Citrine/MglB融合，F39L突变体
3800 μM
460, 495/510–550 nm
秀丽隐杆线虫咽部肌肉葡萄糖成像，MIN6 m9细胞葡萄糖-Ca2+双色成像



77
cpGFP/TtGBP融合，L1-PA/L2-NP连接体变体
7.7 mM
485/515 nm
斑马鱼幼虫的肌肉、大脑和肝脏中的葡萄糖成像



78
mApple/MglB融合，野生型连接体
—
562/591 nm
活细胞中细胞内葡萄糖动态可视化，双色成像兼容性



79
mApple/MglB融合，F39F突变体
320 μM
562/591 nm
HeLa细胞葡萄糖通量监测，与ATP/乳酸/丙酮酸指示剂的双色成像



80
mApple/MglB融合，F39W突变体
3000 μM
562/591 nm
秀丽隐杆线虫咽部肌肉葡萄糖成像



81
Apple/MglB融合，F39T突变体
—
562/591 nm
葡萄糖成像实验中的伪影验证（温度/渗透压/细胞运动)


当然，这些探针也并非没有局限性，例如动态范围有限，或者早期FRET探针的荧光信号变化仅在10%–70%之间。亲和力不足也是一个问题：天然GBP（例如55的170 nM）的亲和力与生理葡萄糖浓度（在毫摩尔范围内）不匹配，需要复杂的基于突变的调整。光稳定性和干扰问题也很普遍。FRET探针依赖于双荧光蛋白（如CFP/YFP），它们容易受到光漂白和激发串扰的影响。另一方面，单荧光蛋白探针可能会受到环境pH的影响。还存在物种特异性限制；源自哺乳动物的探针在植物（如野生型拟南芥）中容易发生转基因沉默，需要在基因沉默突变体中表达。最后，它们的组织渗透性有限：可见光荧光（如绿色、黄色）在深层组织中严重散射，阻碍了体内深层器官（如大脑）的长期成像。一些解决这些缺点的方法已经被提出。为了增强基于GBP的探针的动态范围，开发单荧光蛋白探针（如FGBP系列）已被证明是有效的，信号增强幅度可达700%。例如，通过定向突变优化亲和力，在嗜热菌Thermus thermophilus的GBP中H66、L276、K312和H348位点进行突变也是有效的。这种方法使得能够生成探针库（如iGlucoSnFR变体），覆盖从1 μM到10 mM的浓度范围，使它们适用于不同的生理环境。通过使用抗光漂白的荧光蛋白（如AcCFP1和mCherry）并结合荧光寿命成像技术，可以提高光稳定性和抗干扰能力。通过荧光寿命而不是强度进行定量有助于减少探针浓度和光漂白的干扰。解决物种特异性限制的方法包括在植物RNA沉默突变体（如sgs3和rdr6）中表达探针，或者开发植物特异性的GBP同源物以避免转基因沉默。扩展组织渗透性涉及开发近红外荧光蛋白探针，例如基于mApple的Red Glifons，或结合探针与纳米材料（如单壁碳纳米管），利用它们的近红外发射特性进行深层组织成像。



5. 基于凝集素的探针

在基于酶和蛋白质的探针的基础上，本节将考虑围绕蛋白质凝集素构建的系统，其特定的生物学用途是结合碳水化合物。由于凝集素的非共价葡萄糖识别机制，基于凝集素的探针越来越受欢迎。一个典型的例子是从杰克豆中提取的Concanavalin A（ConA），它含有四个糖结合位点，以400 M?1的浓度结合葡萄糖。ConA的结合通常被用作凝集素研究的参考。由于ConA是非反应性的，仅结合葡萄糖，因此与GOx相比具有许多优势，因为它不产生副产品，也不需要O2，并且具有可逆性的固有特性。本节将首先概述基于ConA的探针，强调它们的局限性（例如低葡萄糖敏感性），然后讨论开发适用于生物系统成像的仿生凝集素类型探针的机会。



5.1. 基于Concanavalin A的探针

1998年，Ye开发了一种基于酶的葡萄糖生物传感器82，该传感器利用了ConA和葡萄糖氧化酶的复合体。这种基于GOx-ConA的系统被发现适合集成到酶电极系统中。Ye发现，使用GOx-ConA复合体制备的酶电极在室温下保持了长期稳定性，由于热稳定性优于简单的GOx系统，并且适用于葡萄糖感应，响应电流在12天期间几乎保持恒定。相比之下，现有的GOx电极稳定性较差，仅仅7天后响应电流就减少了10%，这清楚地展示了使用GOx-ConA复合体的进步。Schultz和Ballerstadt在2000年引入了一种新型的荧光亲和 hollow fiber传感器83，用于连续经皮葡萄糖监测（图57），该传感器利用了移动荧光团标记的ConA与固定在Sephadex珠子（多糖右旋糖酐支撑）内的葡萄糖残基之间的竞争性结合机制。珠子用Safranin O和Pararosanilin染色，其吸收光谱与Alexa488-ConA的激发波长（490 nm）重叠。在没有葡萄糖的情况下，这种吸收会通过阻止珠子内结合的ConA的激发而淬灭荧光。加入葡萄糖后，ConA结合位点的竞争发生，将其从珠子上置换出来，导致520 nm处的荧光增加。这种装置展示了宽范围的葡萄糖检测范围（0.15–100 mM），在0.2至30 mM葡萄糖之间（临床相关范围）表现出最高的动态响应。这进一步展示了基于荧光ConA的系统在原位葡萄糖测量中的巨大潜力，包括潜在的连续监测应用，这是一个日益重要的研究领域。图57

图57中展示了用于葡萄糖检测的荧光亲和性中空纤维传感器83的示意图。经参考文献112授权改编。版权所有（2000年）美国化学会。2001年，Birch和McCartney等人描述了一种基于NIR FRET的葡萄糖检测探针84，该探针使用标记有藻蓝蛋白（allophycocyanin）的ConA作为供体，以及标记有孔雀石绿的右旋糖酐（dextran）作为受体。在无葡萄糖的情况下，ConA和右旋糖酐保持结合状态。然而，当加入葡萄糖时，会发生竞争作用，导致FRET效率下降。这种FRET变化通过时间相关单光子计数来监测，该方法可以测量荧光寿命。研究发现，该方法对2.5至30 mM范围内的葡萄糖浓度有效，为临床相关范围的葡萄糖传感提供了另一种策略。2004年，Frye和Ballerstadt等人引入了一种基于ConA与荧光染料Alexa647TM结合的NIR荧光传感器85，这种传感器与功能化的Sephadex珠子结合（见上文），将其荧光发射转移到近红外范围（670 nm）。在没有葡萄糖的情况下，由于珠子对激发光的吸收，仅观察到微弱的荧光。在葡萄糖存在的情况下，ConA会发生竞争性结合，从而从珠子上释放ConA-染料复合物，显著增加荧光强度，实现葡萄糖的检测。对这种传感器在模拟体内条件下的长期稳定性的研究表明，该系统在37°C下连续循环葡萄糖环境中可运行超过三个月，清楚地展示了其临床应用和连续葡萄糖监测的潜力。2007年，McNichols和Ballerstadt等人引入了一种基于亲和性的浊度传感器86，用于葡萄糖监测，并结合了光学相干断层扫描（OCT）技术（图58），由此产生了一系列基于OCT的ConA探针。该传感器中的ConA通过葡萄糖残基与大孔水凝胶颗粒结合，整个系统被封装在允许葡萄糖通过的膜中，产生高散射系数。葡萄糖的引入会导致ConA的竞争性结合，从而释放ConA-染料复合物，显著增加荧光强度，实现葡萄糖的检测。研究表明，该传感器在模拟体内条件下可稳定运行超过三个月。2013年，Larin和Wang等人基于MchNicholls 2007年的工作，开发了一种用于连续葡萄糖监测的可植入探针87，同样结合了OCT技术（图59）。该方法利用竞争性结合机制，其中葡萄糖动态地从固定在金镜表面的ConA上置换右旋糖酐包覆的微粒，通过OCT跟踪表面微粒密度的变化。具体来说，ConA固定在金镜上，其与葡萄糖的可逆相互作用影响右旋糖酐标记微粒的密度，从而导致反射OCT信号的可检测变化。这项工作在检测单个微粒方面表现出异常高的灵敏度，信号变化为2.9% ± 0.5%，证实了其在透明介质和皮下组织中的适用性。使用OCT技术，该探针成功监测了小鼠耳朵皮肤下0.7–1.0毫米深度的皮下区域中微粒的动态。这项研究为开发高灵敏度、无酶的可植入葡萄糖传感器提供了一种有前景的方法，并强调了其在糖尿病管理中的临床应用潜力。图59

图59中展示了基于光学相干断层扫描的探针设计（左）及其植入部位（右）。经参考文献116授权改编。版权所有（2013年）IEEE。2014年，Ballerstadt等人基于2007年的工作，开发了一种无标记的光纤浊度亲和探针88，用于连续葡萄糖监测，这次利用了葡萄糖引起的光散射变化。该传感器使用半透性中空纤维封装右旋糖酐微粒和ConA，葡萄糖逐渐竞争性地结合ConA，改变悬浮液的浊度。与之前使用的OCT方法不同，这里利用了光强度与葡萄糖浓度成正比的关系。在50–400 mg dL?1（约3–22 mM）的范围内观察到了强烈的响应，响应时间约为4分钟，并且在37°C下可稳定运行长达8天。其准确性与市售设备相当，且设计简单、信号幅度大，不需要复杂的光学组件，使其成为微型化、可植入葡萄糖监测设备的有前景候选者。这类传感器最明显的应用之一当然是糖尿病管理，正如近期商业连续葡萄糖监测系统的增加所证明的那样。在2007年的体外研究基础上，McNichols和Ballerstadt开发了一种可植入的光纤耦合荧光亲和传感器（FAS）89，用于无毛大鼠和猪的葡萄糖检测（图60a–c）。FAS 89利用基于荧光的系统进行葡萄糖检测，ConA作为葡萄糖结合剂，葡萄糖与右旋糖酐竞争结合ConA以调节荧光强度。在体内实验中，FAS 89表现出出色的性能，植入后60分钟内达到平衡状态，响应时间少于5分钟。传感器输出与已知血糖变化之间的相关系数范围为0.88至0.94，表明其在跟踪血糖变化方面的高可靠性。在长期实验中，FAS 89表现出良好的稳定性，3天监测期间的相关系数处于可接受范围内。2012年，McNichols团队进一步探索了这种方法，并对12名糖尿病患者（2名1型糖尿病患者和10名2型糖尿病患者）进行了临床试验，将传感器90植入腹部（图60d和e）。传感器90通过光纤连接到荧光监测仪。FAS 90的测量值与血糖水平之间的相关系数为0.84，97%的数据点落在临床可接受范围内。传感器的平均预热时间为65分钟，响应延迟为4分钟，与之前在大鼠和猪中的FAS 89结果相当。光学信号在测量过程中保持稳定，不受外部光源的影响。据报道，传感器的插入和移除引起的不适感很小，仅有轻微出血，确保了良好的安全性。这项研究证实了FAS 90的准确性和安全性，强调了其在连续葡萄糖监测中的临床应用潜力。图60

图60中展示了光纤耦合荧光亲和传感器（FAS）89的葡萄糖荧光检测机制（a），以及其在皮肤组织中的检测示意图（b），以及植入3天后在猪体内的状况（c）。第二代凝集素基荧光亲和传感器90的示意图（d），以及植入腹部的FAS 90图像（e）。图a–c经参考文献118授权改编。版权所有（2007年）Sage Publications。图d和e经参考文献119授权改编。版权所有（2012年）Sage Publications。2008年，Yu和Tang等人开发了一种创新的基于量子点的纳米生物传感器91（QDs-AuNPs），基于FRET原理直接检测血清中的葡萄糖（图61）。这种传感器由与ConA结合的量子点和经过巯基化β-环糊精（β-CDs）修饰的金纳米颗粒组成。当ConA结合的量子点与巯基化β-CDs修饰的金纳米颗粒特异性结合时，量子点的荧光通过FRET被金纳米颗粒淬灭。当存在葡萄糖时，葡萄糖与β-CDs竞争结合ConA，导致金纳米颗粒-β-CDs复合物的置换，从而恢复荧光。荧光恢复与葡萄糖浓度成正比，检测范围为0.10–50 μM，检测限低至50 nM。值得注意的是，这种传感器91对葡萄糖具有高选择性，能够将其与其他糖类和血清生物分子区分开来。在优化的实验条件下，该生物传感器在检测人血清样本中的葡萄糖时表现出优异的恢复率和精确度。图61

图61中展示了纳米生物传感器91的结构和葡萄糖检测机制。经参考文献120授权改编。版权所有（2008年）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。2010年，Battaglini和Pallarola等人引入了一种新型的功能化氧化还原活性复合物92，由ConA和Os(ii)组成，通过碳水化合物-凝集素相互作用（通过甘露糖）固定在金电极上。然后GOx与这些复合物结合，使得GOx产生的电子电流通过Os(ii)复合物传递到电极，从而产生葡萄糖依赖的电流（图62）。这种有趣的设计结合了多种方法。与之前使用的OCT方法不同，这里利用了光强度与葡萄糖浓度成正比的关系。在50–400 mg dL?1（约3–22 mM）范围内观察到了强烈的响应，响应时间约为4分钟，并且在37°C下可稳定运行长达8天。其准确性与市售设备相当，具有直接的设计、大的信号幅度，不需要复杂的光学组件，使其成为微型化、可植入葡萄糖监测设备的有前景候选者。这类传感器最明显的应用之一当然是糖尿病管理，正如最近商业连续葡萄糖监测系统的兴起所证明的那样。在2007年的体外研究基础上，McNichols和Ballerstadt开发了一种可植入的光纤耦合荧光亲和传感器（FAS）89，用于检测无毛大鼠和猪的葡萄糖（图60a–c）。FAS 89利用基于荧光的系统进行葡萄糖检测，ConA作为葡萄糖结合剂，葡萄糖与右旋糖酐竞争结合ConA以调节荧光强度。在体内实验中，FAS 89表现出优异的性能，植入后60分钟内达到平衡状态，响应时间少于5分钟。传感器输出与已知血糖变化之间的相关系数范围为0.88至0.94，表明其在跟踪血糖变化方面的高可靠性。在长期实验中，FAS 89表现出良好的稳定性，3天监测期间的相关系数处于可接受范围内。2012年，McNichols团队进一步探索了这种方法，并对12名糖尿病患者（2名1型糖尿病患者和10名2型糖尿病患者）进行了临床试验，将传感器90植入腹部（图60d和e）。传感器90通过光纤连接到荧光监测仪。FAS 90的测量值与血糖水平之间的相关系数为0.84，97%的数据点落在临床可接受范围内。传感器的平均预热时间为65分钟，响应延迟为4分钟，与之前在大鼠和猪中的FAS 89结果相当，后者的平衡时间为60分钟，响应时间少于5分钟。光学信号在整个测量过程中保持稳定，不受外部光源的影响。据报道，传感器的插入和移除引起的不适感很小，仅有轻微出血，确保了良好的安全性。这项研究强调了FAS 90的准确性和安全性，强调了其在连续葡萄糖检测中的临床应用潜力。图60

图60中展示了光纤耦合荧光亲和传感器（FAS）89的葡萄糖荧光检测机制（a），以及其在皮肤组织中的检测示意图（b），以及植入3天后在猪体内的情况（c）。第二代凝集素基荧光亲和传感器90的示意图（d），以及植入腹部的FAS 90图像（e）。图a–c经参考文献118授权改编。版权所有（2007年）Sage Publications。图d和e经参考文献119授权改编。版权所有（2012年）Sage Publications。2008年，Yu和Tang等人开发了一种创新的基于量子点的纳米生物传感器91（QDs-AuNPs），用于基于FRET原理直接检测血清中的葡萄糖（图61）。这种传感器由与ConA结合的量子点和经过巯基化β-环糊精修饰的金纳米颗粒组成。当ConA结合的量子点与巯基化β-CDs修饰的金纳米颗粒特异性结合时，量子点的荧光通过FRET被金纳米颗粒淬灭。当存在葡萄糖时，葡萄糖与β-CDs竞争结合ConA，导致金纳米颗粒-β-CDs复合物的置换和荧光的恢复。荧光恢复与葡萄糖浓度成正比，检测范围为0.10–50 μM，检测限低至50 nM。值得注意的是，这种传感器91对葡萄糖具有高选择性，能够轻松区分其他糖类和血清生物分子。在优化的实验条件下，该生物传感器在检测人血清样本中的葡萄糖时表现出优异的恢复率和精确度。图61

图61中展示了纳米生物传感器91的结构和葡萄糖检测机制。经参考文献120授权改编。版权所有（2008年）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。2010年，Battaglini和Pallarola等人引入了一种新型的功能化氧化还原活性复合物92，由ConA和Os(ii)组成，通过碳水化合物-凝集素相互作用（通过甘露糖）固定在金电极上。然后GOx与这些复合物结合，使GOx产生的电子电流通过Os(ii)复合物传递到电极，形成葡萄糖依赖的电流（图62）。这种设计结合了多种方法的特点。不同于使用ConA来检测葡萄糖，ConA在这里作为连接剂/修饰剂，其碳水化合物结合特性仅用于将传感系统固定在电极上以产生电流。图62

图62中展示了基于氧化还原活性ConA和GOx的葡萄糖响应性界面超分子生物偶联物92的示意图。经参考文献121授权改编。版权所有（2010年）美国化学会。2011年，Coté和Cummin等人开发了一种新型葡萄糖检测系统93，基于ConA和包封在微孔PEG微球中的糖枝状大分子（图63）。通过创新的微孔技术，在水凝胶内的微球孔中创建了含有检测测定的孔隙，允许葡萄糖扩散到内部空间，同时有效防止封装的传感组分的泄漏。系统中使用的交联PEG水凝胶确保了生物相容性和结构稳定性，使其适合潜在的皮下植入。与之前的例子一样，这里采用了竞争性结合机制，ConA和糖枝状大分子形成聚集体，加入葡萄糖后这些聚集体被破坏。该传感器在3–11 mM葡萄糖范围内表现出敏感的荧光响应，灵敏度为每10 mg dL?1（0.555 mM）葡萄糖荧光变化1.3%。图63

图63中展示了ConA/糖枝状大分子系统93在低（a）和高（b）葡萄糖浓度下的聚集特性。2011年，Chen和Tang等人开发了一种石英晶体微天平（QCM，用于测量微小质量变化）探针94，使用常规的葡萄糖/右旋糖酐置换方法进行敏感的葡萄糖检测。探针94由苯氧基衍生的右旋糖酐（DexP）和覆盖在石墨烯上的QCM组成，ConA与右旋糖酐结合。同样，利用竞争性结合原理，葡萄糖置换ConA，导致QCM频率的变化。在最佳条件下，频率变化相对于基本共振频率与葡萄糖浓度成正比，在0.01–7.5 mM范围内呈线性响应，检测限为5 μM。与其他基于酶和无酶的葡萄糖传感器相比，这种传感器94通过石墨烯的大表面积和ConA的大分子置换效应实现了信号放大和敏感检测，在极低的葡萄糖浓度下仍能获得可靠的测量结果。2021年，Johannessen和Hoang等人开发了另一种基于QCM（quantum cascade microresonance）的葡萄糖生物传感器95，该传感器通过ConA与右旋糖酐的竞争性结合来放大葡萄糖信号（图64）。这种传感器95利用固定在金涂层QCM电极上的硫醇化ConA来测量葡萄糖浓度，通过测量质量变化来实现这一目的。据报道，其检测范围为2-40 mM，最小分辨率为±0.4 mM，在低于10 mM的浓度下表现出特别高的灵敏度。图64展示了这一传感器的结构和工作原理。

2013年，Wu和Hsieh等人开发了另一种基于质量测量的葡萄糖探针96，这是一种无需标记的方法，使用悬臂式传感器技术，利用质量测量原理实现了高灵敏度和特异性的葡萄糖测量（图65）。悬臂臂经过氨基丙基硅氧烷的化学修饰，并用ConA功能化，因此在葡萄糖存在下，悬臂臂的共振频率会发生可测量的变化，从而可以量化葡萄糖的浓度。该传感器表现出高选择性，能够有效区分葡萄糖和半乳糖等结构异构体。这项研究强调了悬臂技术的潜力，作为一种高灵敏度的葡萄糖检测工具，为糖尿病管理中的血糖监测提供了一个稳定且无需酶的平台。图65展示了探针96的工作原理。

2011年，Ryser和Boss等人引入了一种基于质量测量原理的无标记葡萄糖传感探针96，用于生物流体中的连续葡萄糖监测（图66）。这种传感器依赖于ConA与右旋糖酐的竞争性结合机制。当葡萄糖干扰这种结合时，会破坏网络的稳定性，使ConA和右旋糖酐释放到溶液中，降低介质的粘度。研究人员证明，该传感器在生理葡萄糖浓度范围（2-20 mM）内表现出优异的灵敏度，尤其是在低血糖范围（2-4 mM）内，准确率为±1.7%。此外，该传感器具有良好的可逆性和稳定性，可持续使用长达3天。图66展示了这种传感器的原理图。

2012年，Herbrechtsmeier和Müller等人开发了一种可植入的结膜下葡萄糖监测探针98，由一个眼部微型植入物和一个手持式荧光光度计组成，用于数据收集。该探针利用了ConA的位移和FRET（fluorescence resonance energy transfer）机制，整合到了nelfilcon聚合物水凝胶盘中（与隐形眼镜相同的材料）。这项技术在五名患者的临床试验中进行了为期两周的评估，结果显示：与商用GOx传感器相比，它与血糖波动有很强的相关性（相关系数>0.88），性能稳定，延迟时间约为5-10分钟，98%的读数在临床可接受范围内。该探针易于植入，患者耐受性良好，并提供无创的血糖读数。由于其非酶依赖性和可逆的结合特性，它成为一种有前景的、微创且稳定的连续葡萄糖监测选项。图67展示了探针98的结构和工作原理。

2014年，Wang和Song等人开发了一种pH值可调的电化学探针99，基于壳聚糖还原氧化石墨烯（CS-rGO）和ConA，可用于同时测量葡萄糖和尿素。这种探针利用CS-rGO的大比表面积固定高浓度的ConA，ConA的表面净电荷随pH值变化，从而对Fe(CN)63-离子产生pH依赖性响应。在低pH值下，带正电的ConA与Fe(CN)63-结合；而在高pH值下，带负电的ConA不再结合。通过添加GOx或脲酶可以酶促调节溶液的pH值，从而实现葡萄糖和尿素的检测。实验结果显示，该探针对1.0-10.0 mM的葡萄糖浓度和1.0-7.0 mM的尿素浓度具有良好的线性响应，并在血清和尿液样本中验证了其准确性。与传统方法相比，该探针具有样品制备简单、选择性高和重复性好的优点，为设计针对电化学不活跃物质的探针提供了一种新的方法。图68展示了探针99的结构和工作原理。

2014年，Pachpinde和Peng报道了一种基于金纳米棒和ConA的纵向等离子共振传感器100。金纳米棒经过硫酸右旋糖酐修饰以调整折射率，然后用于结合ConA。ConA的结合促进了纳米棒聚集，导致纵向等离子共振波长从701 nm红移至718 nm。因此，当加入葡萄糖时，竞争性结合会使纳米棒分散，使UV-Vis（紫外-可见光谱）波长从718 nm蓝移回714 nm（虽然变化很小但可测量）。通过监测波长变化，可以准确检测1-30 mM范围内的葡萄糖浓度，这进一步展示了金纳米棒和纳米粒子的多种应用潜力。图69展示了传感器100的结构和工作原理。

2015年，Coté和Locke等人开发了一种基于ConA的竞争性结合探针101，用于长期葡萄糖检测。为了提高其在体内的热稳定性，ConA被聚乙二醇修饰，并使用荧光标记的甘露糖四酮糖作为竞争配体。通过荧光变化可以监测葡萄糖的浓度依赖性结合。该方法对0-400 mg dL-1（最高22 mM）范围内的葡萄糖浓度表现出强线性响应，并在37°C下保持了30天的稳定性，尽管平均绝对相对差异从6.13%略微增加到7.6%。该探针既具有高灵敏度，又具有长期稳定性（得益于PEG修饰），为开发用于体内连续葡萄糖检测的植入式探针提供了重要潜力。然而，由于缺乏商业化的甘露糖四酮糖，这可能会限制其广泛应用。2015年，Wei和Fan等人开发了一种新型的非酶电化学发光葡萄糖传感器102，基于葡萄糖和苯氧基右旋糖酐与ConA的竞争性结合。该传感器采用石墨碳氮化和3,4,9,10-苝四羧酸的混合物作为探针，固定在玻璃碳电极上。ConA通过与DexP的相互作用附着在电极上。暴露于葡萄糖时，竞争性结合会取代ConA，减少界面处的电子传输阻力，从而增强电化学发光信号。实验结果表明，该传感器对1.0 × 10-10 M至5.2 × 10-10 M（0.1–0.52 nM）范围内的葡萄糖浓度具有强线性响应，尽管在血清样本中相对误差较高。通过眼泪中的葡萄糖检测为非侵入性监测血糖水平提供了一种有前景的方法。

2017年，Zhang和Chen等人开发了一种基于FRET淬灭机制的纳米结构ConA传感器103，用于快速无创检测泪液中的葡萄糖浓度。该传感器使用量子点（CdSe/ZnS）作为供体，孔雀石绿标记的右旋糖酐（MG-dextran）作为受体。当葡萄糖与ConA结合时，荧光信号恢复。该传感器组装在沉积在硅胶水凝胶上的ZnO纳米棒阵列上，能够在0.03-3 mM的葡萄糖浓度范围内进行检测，涵盖了健康和糖尿病患者的典型泪液葡萄糖水平。实验验证表明，该传感器能在30秒内完成检测，结果与实际血糖浓度高度相关。此外，该传感器具有高灵敏度、良好选择性和优异的可靠性，为发展高非侵入性葡萄糖监测设备提供了新的途径。图70展示了传感器103的结构和工作原理。

随着3D打印技术的快速进步及其在生物医学中的应用，将其集成到葡萄糖传感中已成为一个有前景的研究方向。2023年，Thielemann和Krsti?等人开发了一种3D打印的荧光葡萄糖传感器104，专为细胞培养中的连续葡萄糖监测而设计。该传感器的架构以UV固化聚羟基乙烯醇（PVA）水凝胶为主基质，通过调整PVA的固体含量（最佳配方中为37.0 wt%）优化了其流变性能，实现了基于挤出的稳定、可定制的3D结构（如网格、柱子）的打印。在这个PVA基质中，海藻酸盐微球包裹了传感核心：荧光标记的ConA（受体荧光团）和右旋糖酐（供体荧光团），它们通过基于FRET的竞争性结合机制进行工作。在没有葡萄糖的情况下，ConA和右旋糖酐形成复合物，淬灭供体荧光；而葡萄糖取代右旋糖酐后，荧光团间距增加，荧光强度线性恢复（0–2 g L?1，11.1 mM）。在HEK细胞实验中，该传感器不仅跟踪了10天内由细胞代谢驱动的葡萄糖消耗，还保持了出色的生物相容性。这项工作满足了针对复杂3D细胞模型的微型化连续葡萄糖传感器的需求，为将其整合到组织工程平台和再生医学中奠定了基础。图71展示了该传感器的打印工作和原理图。

2023年，Huth和Pfützner等人开发了一种基于渗透压的葡萄糖传感器105，用于连续的腹腔和皮下葡萄糖监测。该传感器采用ConA/右旋糖酐系统作为核心葡萄糖传感化学机制。其密封腔室包含一种活性流体，由葡萄糖结合分子（如ConA）和类似葡萄糖的配体（如右旋糖酐）组成。在没有葡萄糖的环境中，ConA和右旋糖酐通过特定相互作用形成稳定复合物。当葡萄糖通过半透膜渗入腔室时，由于其更强的结合亲和力，葡萄糖会取代右旋糖酐，从而提高内部渗透压。相反，当外部葡萄糖浓度降低时，葡萄糖会从ConA上解离，使ConA和右旋糖酐重新结合，导致渗透压下降。传统的基于渗透压的葡萄糖传感器存在尺寸问题，无法满足临床植入要求。为了克服这一挑战，研究团队用纳米颗粒隧道电阻压力传感器（尺寸为4000 × 400 × 150 nm3）替换了传统的压阻式压力传感器，这些传感器是通过聚焦电子束诱导沉积技术制造的。利用这种纳米技术，实现了对传感器105的精确结构控制，将其核心腔室体积从70 μL减少到750 nL（减少了95%以上）。动态葡萄糖测试结果显示，在0-300 mg dL-1的葡萄糖浓度范围内，该微型传感器产生了稳定的渗透压变化（40–50 mBar）。此外，其输出信号与葡萄糖浓度呈线性关系，完全满足临床连续葡萄糖监测设备的性能要求。图72c和d展示了这一成果。图72

(a) 基于渗透压的葡萄糖传感器105的示意图，展示了在组织液中低血糖和高血糖水平下的检测状态。(b) 双腔传感器105的草图。(c) 双腔传感器与商用连续血糖监测（CGM）系统的单点校准测量结果对比。(d) 在动物研究设置中的双腔传感器草图。经MDPI AG授权改编自参考文献134。

5.2 合成凝集素仿生探针

上述工作清楚地突显了社区对开发基于凝集素（例如ConA）的葡萄糖检测探针的兴趣，这些探针利用了所有可用的传感技术，并经常将ConA与现有的FRET或GOx方法结合使用。与此同时，许多团队致力于通过仿生探针化学复制凝集素/ConA的活性，这一研究始于1988年Ogoshi和Aoyama等人的开创性工作（图73）。他们研究了功能化的间苯二酚寡聚体106与各种极性底物（包括甘油、d-葡萄糖、d-核糖、核黄素（维生素B2）、维生素B12和血红素）之间的主客体相互作用。他们发现106对不同底物的提取能力不同，例如比d-葡萄糖更有效地提取d-核糖。尽管他们的杯芳烃框架太小而无法完全包裹糖类分子，但它非常适合杯芳烃上缘的羟基与糖类分子之间的“面对面”氢键相互作用。然而，在水溶液中形成糖类-106复合物需要极高的糖类浓度（100 mM–1 M），这远不足以制成功能性传感器或凝集素模拟物，但该系统为未来的仿生研究奠定了基础。

第一代早期仿生糖类受体设计用于在有机溶剂和水中工作。1995年，Diederich的团队设计了一系列含有内部磷酸基团的宏环结构。其中，探针107（图73）对诸如辛基β-葡吡喃糖苷109等糖类表现出显著的选择性，这是因为磷酸基团之间的计算距离为7.2 ?，这一距离被有意设计为与单糖的大小相匹配。据报道，探针107与辛基β-葡吡喃糖苷109在98:2的氘代乙腈和氘代甲醇混合物中形成的复合物的稳定常数Ka达到了5200 M?1。尽管取得了这一重大进展，这些合成受体仍然受溶剂竞争的影响，无法在水性介质（如血液、尿液、泪液、饮料等）中测量葡萄糖。这一在水性介质中的限制意味着，在许多情况下，这些传感器的性能是在非质子性溶剂（如氯仿）中评估的，这并不能代表临床相关条件。不久之后，在1998年，作为Davis团队开创性研究的一部分，Davis和Wareham开发了一种基于八酰胺的受体108（图73），该受体受到碳水化合物结合蛋白的启发，通常使用芳香残基创建疏水性的“CH-接受”口袋，同时利用氢键motif与碳水化合物的羟基结合。分子模型显示，由联苯和苯-1,3-二羧酰胺单元形成的腔足以容纳β-葡萄糖分子。双联苯基团的平面疏水表面提供了非极性接触，而酰胺阵列与糖类的羟基之间形成了有利的氢键相互作用。108在CDCl3中对β-葡吡喃糖苷的稳定常数据报道高达300,000 M?1，但一旦引入竞争性共溶剂，这一数值会迅速降低，仅加入2%的甲醇-d4后就降至1000 M?1。2005年对外部功能团的修改产生了探针110，它能在水溶液中与d-葡萄糖结合，稳定常数为9.5 M?1。虽然这比之前的系统有所改进，但其在水中的结合强度仍然不足，严重限制了该系统在生物环境中检测糖类的实际应用。为了进一步提高110的结合性能，Davis和Barwell等人在2009年通过向核心结构中添加醚类取代基合成了系列碳水化合物受体111a–d（图73）。通过D2O中的1H NMR光谱滴定评估了111a–d的结合性质，测得其与d-葡萄糖的结合常数分别为35、41、60和47 M?1。这些受体在水中的葡萄糖亲和力较低，但对β-GlcNAc的结合力显著增强，具有良好的选择性和接近毫摩级别的亲和力。还研究了一系列其他修改，确定了可以改进结合的其他关键修改，特别是探索了CH–π（碳-氢?π）相互作用在碳水化合物识别中的作用，这些作用可以通过芳香笼的电子调控来调节。与此同时，Davis和Lecollinet等人在2002年开发了一种三环八酰胺笼受体112（图73），本质上是受体108的“扩展类似物”，旨在适应二糖底物。通过1H NMR研究了112与辛基-β-棉子糖苷115的结合，发现其在CDCl3/CD3OH（92:8）中的结合模式为1:1，结合常数为7000 M?1。选择性研究表明，只有化合物115能引起受体NMR光谱、荧光发射和圆二色性的显著变化，证实了其高选择性。化合物112通常被认为是第一个仅通过非共价相互作用就能区分二糖的受体。尽管这些早期仿生探针在选择性和灵敏度方面存在一些关键限制，但Davis和Ferrand等人继续他们的工作，在2007年采用了一种替代的仿生识别策略设计了受体116（图74），放弃了迄今为止讨论的三环笼结构。116由顶部和底部的间苯三苯基基团组成，通过通常的疏水和CH–π相互作用与碳水化合物结合，而异佛尔酰胺单元作为结构支柱，异佛尔酰胺单元与碳水化合物的羟基形成氢键。向外突出的羧基增加了水溶性并防止了聚集。在D2O中，受体116对棉子糖的选择性极强，结合常数为560–650 M?1，而对d-葡萄糖的结合常数Ka仅为11 M?1。借鉴这些经验，Davis和Sookcharoenpinyo等人在2012年报道了两种新的合成受体113和114（图73），它们具有羧酸侧链，但保留了第一代受体的降低的前组织结构，使其更易于使用。受体114对甲基棉子糖的结合常数达到了令人印象深刻的4500 M?1。与116相比，三环凝集素113和114在仿生条件下对所有赤道二糖的结合效果更优。这些发现表明，适用于酶和蛋白质的“诱导适应”或“构象选择”方法也可以用于合成仿生受体，为受体修改和改进提供了新的途径。

基于缩合芳香顶/底单元的合成受体。基于芳香单元在合成凝集素型受体设计中起关键作用的假设，Davis和Ke等人在2012年开发了双蒽基单环受体117（图74）。1H NMR滴定实验显示，葡萄糖的添加引起了受体117的显著光谱变化，其平均结合常数为56 M?1。荧光光谱进一步表明，葡萄糖的添加导致发射强度显著增加，最大增强因子为2.5。受体117对葡萄糖表现出显著的选择性，例如相对于半乳糖的选择性比约为50:1。受体117的相对结构简单意味着容易合成，并具有出色的葡萄糖识别能力，结合了集成的荧光信号系统，为有效的血糖监测提供了有希望的基础。进一步探索侧链调节时，可以使用的树状侧链来调节基于蒽的合成碳水化合物受体内的结合微观环境。2015年，Davis和Destecroix等人设计了一系列具有不同侧链结构的合成受体。当测试其对葡萄糖的结合亲和力时，从受体117的56 M?1增加到受体118的约90 M?1（图74）。此外，葡萄糖结合的荧光响应受到侧链性质的影响。与受体115相比，受体116与葡萄糖结合时的发射强度增加了3.7倍。这项工作表明，控制侧链的长度、电荷和分支程度可以使得羧基团的位置有利于改善底物结合，而不是阻碍受体腔体。结合血糖结合亲和力的提高，这些发现表明受体118对0–10 mM范围内葡萄糖浓度变化的敏感性大约提高了两倍。鉴于这一浓度范围与糖尿病相关的血糖监测高度相关，这些受体系统在医学领域具有重大的实际潜力。2016年，Davis和Mooibroek等人报道了第一个基于芘的双环模板119（图74），它由芘和异佛尔酰胺间隔物组成。这种结构具有两个平行的芳香表面和刚性的极性间隔物，与多糖的结构相匹配。引入了树状非羧酸单元以提高受体的水溶性。受体119对所有赤道碳水化合物的选择性结合已被证实，对葡萄糖和葡糖苷的结合比对其它单糖（如甘露糖和半乳糖）更强。尽管其对单糖的表现适中（例如，葡萄糖的Ka为120 M?1），但在所有赤道寡糖（如纤维四糖）上的结果显著改善。例如，纤维四糖的结合常数Ka为12,000 M?1。2016年，Davis和Rios通过将吡renyl四胺与异佛尔酰间隔物结合，合成了两种新型受体120和其异构体121（图74）。这些受体由平行的芳香单元（芘）和极性间隔物组成，旨在增强碳水化合物的相互作用。先前讨论的强水溶性树状侧链解决了芘在水中的自聚集问题。这些异构体对葡萄糖的亲和力适中（分别为120和190 M?1），而它们与β-N-乙酰-葡糖胺苷（O-GlcNAc）的结合显示出有希望的结果。特别是，受体121与GlcNAc-β-OMe的结合常数Ka为18,200 M?1，大约是第一代受体110的30倍，是天然凝集素小麦胚芽凝集素（WGA，Ka = 730 M?1）的25倍。Davis和Ríos等人还在2017年引入了手性受体122（图74），通过异佛尔酰胺间隔物将四氨基吡rene和C3-对称三胺连接起来，实现了手性。与N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的结合实验显示出16:1的手性选择性比，这在任何介质中都是合成受体中报告的最高手性选择性之一。此外，其对GlcNAc的Ka高达1280 M?1，超过了早期合成凝集素的值，是WGA的3倍。对于葡萄糖，结合常数为Ka = 250 M?1，也超过了之前的合成凝集素。这一报告标志着在将这些框架中引入手性的有效方法方面的突破，标志着合成受体首次通过纯非共价相互作用实现手性选择性的碳水化合物识别。2019年，Davis和Tromans等人开发了双环六脲受体123（图74），具有简单的对称核心结构。通过精心设计，这种受体提供了一个与所有赤道葡吡喃糖底物紧密结合的结合腔体，六个脲基提供了稳健的氢键网络。受体123对葡萄糖的结合很强，Ka约为18,000 M?1，对葡萄糖的选择性大约是大多数其他糖类的100倍，与非结合底物的1000倍。此外，受体123在多种介质中表现出优异的性能，包括在磷酸盐缓冲盐和水中的几乎相同的亲和力。此外，受体123表现出极好的热稳定性和低毒性。该系统的卓越性能和可调特性表明其在临床医学应用中的巨大潜力。创建可以根据循环血糖浓度可逆调节其生物活性的葡萄糖响应性胰岛素类似物已成为葡萄糖分子识别领域的一个重要研究方向。2024年，Slaaby、Hoeg-Jensen和Davis等人设计了一种新型的胰岛素结合物NNC2215，使用123作为葡萄糖探针，该探针在体外和体内试验中显示出与糖尿病相关的葡萄糖浓度范围相适应的可逆生物活性。153 NNC2215是通过将两个关键部分连接到胰岛素骨架上构建的：一个葡萄糖特异性的macrocycle和一个葡萄糖苷基团（图75a）。这种双重修饰策略引入了一个智能分子开关，它能够根据环境中的葡萄糖水平变化而发生构象的打开和关闭，从而动态地在胰岛素分子的生物活性构象和低活性状态之间切换（图75b和c）。生化测定表明，当环境中的葡萄糖浓度从3 mM上升到20 mM时，NNC2215与胰岛素受体的结合亲和力提高了3.2倍——这是糖尿病患者的关键血糖区间。在临床前动物测试中，证明NNC2215的葡萄糖依赖性生物活性具有两个关键的治疗优势：它显著降低了低血糖发作的风险，并部分抑制了餐后血糖的急剧上升。这些发现强调了NNC2215在糖尿病管理中实现精确血糖调节和治疗安全之间的平衡的潜力。图75

(a) NNC2215的化学结构。(b) NNC2215的功能原理。NNC2215是一种对葡萄糖敏感的胰岛素，具有分子开关。在高葡萄糖水平下，开关打开，增强其胰岛素受体亲和力以防止高血糖；在低葡萄糖水平下，开关关闭，减弱受体结合，从而降低低血糖风险。(c) NNC2215胰岛素结合物的开放态和关闭态三维结构模型。经Springer Nature出版物153授权改编。2021年，Stoddart和Liu等人设计了两种基于芘的、寺庙形状的受体124和125（图74）。154 芭芘面板充当笼子的顶部和底部，提供了平坦的、富含电子的表面，非常适合与葡萄糖环在其椅式构象中的全轴向C–H键结合。极性的C–H键作为氢键供体，与葡萄糖上的羟基形成多个[C–H?O]氢键。四个对位苯乙烯支柱在维持受体顶部和底部之间的最佳距离方面起着关键作用。使用1∶1受体-底物结合模型对滴定等温线进行非线性拟合，得到124与葡萄糖相互作用的结合常数为286 M?1。在45 mM葡萄糖存在下，荧光强度增加了高达65%。125在葡萄糖结合时也表现出类似的荧光增强作用，其与葡萄糖相互作用的结合常数估计为96 M?1。葡萄糖结合到125上时，荧光强度最多可增加85%。124和125在生理浓度（1–10 mM）下都对葡萄糖显示出强烈的荧光响应。2023年，Liu和Zhai等人开发了一种葡萄糖受体126（图74），它结合了两个二茂蒽面板和两个吡啶残基，这是基于葡萄糖的静电势图设计的。155 二茂蒽面板通过其正电边缘与葡萄糖的羟基相互作用，而甲基基团引入了空间位阻以保持结构的刚性。吡啶残基有助于提高水溶性，它们极性的C–H键作为氢键供体，增强了与葡萄糖的相互作用。为了评估碳水化合物与126的结合亲和力，进行了1H NMR滴定实验，得到的结合常数Ka为845 M?1，明显高于传统的氨基酸基分子模板。进一步用芘替换二茂蒽基团后，结合常数进一步提高到3001 M?1，部分得益于接触表面的增加。156 这些受体还对葡萄糖表现出很强的选择性。这种葡萄糖结合凝集素的合成可及性和良好性能突显了其在推进葡萄糖响应材料和传感器方面的潜力。基于凝集素的葡萄糖探针利用非酶促识别机制具有几个显著的优势（表4）。它们的运作依赖于非共价相互作用，例如ConA与葡萄糖之间的竞争性结合，不会产生像H2O2这样的副产品，也不需要氧气。这避免了与正常细胞代谢的干扰，并且本质上实现了可逆的检测。高稳定性和长期有效性也是关键优势：ConA与载体（包括GOx和纳米材料）复合物在室温下可以保持稳定的响应电流长达12天，显著优于单独的GOx系统。111 此外，一些传感器，如NIR荧光传感器，在37 °C的模拟体内条件下可以连续运行超过3个月。114 这些探针提供了宽广的检测范围，涵盖生理和病理葡萄糖浓度，并适用于包括血清、间质液和泪液在内的多种生物样本。某些传感器，如3D打印的荧光传感器，也可以适应细胞培养环境。133 此外，它们受益于多样的检测平台，整合了荧光、电化学、光学相干断层扫描和石英晶体微平衡技术，从而能够应用于从体外分析到体内植入的各种应用。表4

代表性基于凝集素的探针的关键特性



探针 感应组分 信号类型 检测范围 生物应用



82 ConA-GOD/ConA-GOD-GA 安培信号 4–10 mM 在线发酵监测，糖尿病患者的体内葡萄糖检测



83 ConA-Alexa488 荧光淬灭/恢复 0.15–100 mM 持续透皮葡萄糖监测，皮下可植入传感



84 ConA-APC/Dextran-MG FRET减少 2.5–30 mM 糖尿病患者的血清葡萄糖监测，潜在的皮下传感



85 ConA-Alexa647 荧光增强 2.5–20 mM（半饱和：15 mM） 长期透皮葡萄糖监测，皮下可植入传感



86 ConA-Sephadex 浊度变化 2.5–20 mM（生理范围） 可植入葡萄糖监测，OCT组织成像



87 ConA-dextran涂层微粒 OCT强度变化 — 皮下连续葡萄糖监测，可植入的OCT基成像



88 ConA-Sephadex G100 浊度变化 2.8–22.2 mM 持续间质葡萄糖监测，可植入的光纤传感



89 ConA-Sepharose/Dextran FRET 0–30 mM 3天连续间质葡萄糖监测，可植入的光纤耦合传感



90 ConA-dextran FRET 5.6–19.4 mM 急性人类连续葡萄糖监测，皮下可植入传感



91 ConA-CdTe QDs/β-CD修饰的AuNPs FRET 0.10–50 μM 直接血清葡萄糖检测，单细胞/细菌葡萄糖传感



92 ConA (C8/PEG连接器)/Os (bpy)2Clpy 电化学氧化还原信号 — 电极固定的葡萄糖检测



93 ConA-Alexa Fluor 647/glycodendrimer 荧光强度增强 2.8–11.1 mM 皮下间质葡萄糖监测，侵入性连续葡萄糖监测



94 ConA/DexP-石墨烯 石英晶体频率变化 0.01–7.5 mM 生物流体中的葡萄糖检测，临床血清葡萄糖检测



95 ConA-dextran/硫醇固定的QCM 石英晶体频率变化 2–40 mM 重量法葡萄糖监测，可植入的连续葡萄糖监测



96 ConA-APS修饰的AFM悬臂 悬臂共振频率变化 — 人工糖溶液中的体外葡萄糖检测



97 ConA-dextran 相位变化/松弛时间变化 2–20 mM 血液/血清中的连续葡萄糖监测，临床血糖控制



98 荧光染料标记的ConA-dextran FRET 2.8–25.0 mM 人类结膜下葡萄糖监测，糖尿病长期血糖控制



99 ConA-壳聚糖还原的氧化石墨烯 电化学信号变化 1.0–10.0 mM 人类血清/尿液中的同时葡萄糖/尿素检测，临床生化检测



100 ConA-dextran硫酸盐涂层的金纳米棒 纵向等离子体共振峰移动 1–30 mM 光学葡萄糖检测



101 PEGylated ConA/APTS标记的mannnotetraose 荧光各向异性变化 0–22.2 mM 长期体外葡萄糖检测，连续葡萄糖监测







102 ConA-phenoxydextran/g-C3N4-PTCA混合 电化学发光强度增加 0.1 nM–0.052 mM 非酶促葡萄糖检测，血清/尿液/葡萄糖检测



103 ConA-CdSe/ZnS QD/MG-dextran FRET 0.03–3 mM（泪液葡萄糖范围） 非侵入性泪液葡萄糖检测，糖尿病血糖监测



104 荧光标记的ConA-dextran FRET 0–11.1 mM 细胞培养中的连续葡萄糖测量，3D组织工程代谢监测



105 ConA-dextran 渗透压变化 0–16.7 mM 持续腹腔/皮下葡萄糖监测，糖尿病连续血糖监测



当然，这些探针也存在一些局限性。主要缺点是它们的亲和力低和选择性中等：天然ConA对葡萄糖的亲和力低，选择性也仅中等，容易受到其他糖类（如甘露糖）的干扰。另一个问题是仿生探针在水介质中的结合能力通常有限；早期的合成受体如calixarene衍生物在水溶液中的结合力较弱，稳定性常数远低于生理要求，且其性能受溶剂竞争的显著影响。还存在动力学和环境适应性问题：一些传感器响应时间较长，例如盘状浊度传感器的响应时间为23分钟，115 并且在复杂的基质（如细菌培养基）中会出现信号漂移。此外，临床转化也存在障碍；尽管在动物和临床试验中有应用，但一些可植入传感器的响应延迟仍然较长（5–10分钟）（与之前提到的时间问题一致），它们的长期稳定性需要进一步改进。在改进策略方面，优化天然凝集素已经显示出有希望的结果。PEG修饰的ConA表现出增强的热稳定性，在37 °C下可以运行30天，而荧光标记的配体（如mannnotetraose）增强了竞争性结合信号，提高了检测灵敏度。130 传感器设计也可以进行优化，例如结合FRET技术的3D打印PVA水凝胶传感器。133 另一方面，合成凝集素模拟物（表5）可以通过结构修饰来改进，例如引入芳香族、脲类或树枝状侧链来提高水溶性、亲和力和结合能力。例如，双环六脲受体123在生理盐水中对葡萄糖的稳定性常数（Ka）为18?000 M?1，对其他糖类的选择性提高了100倍。152



表5

代表性合成受体的关键特性



探针 结构特征 感应机制 葡萄糖结合常数（Ka） 结合选择性 溶剂系统



106 酚醛十二烷环寡聚物 氢键作用 — d-ribose > d-glucose（较弱） CCl4/C6H6



107 手性联萘衍生的环芳烃 氢键作用 — β-d-glucoside > α-异构体，甘露糖结合较弱 干CDCl3



108 三环聚酰胺受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 — β-d-glucoside ? α-异构体（45?:?1） CHCl3, CDCl3/CD3OH (92?:?8)



111 烷氧基取代的三环聚酰胺 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 111a: 35 M?1; 111b: 41 M?1; 111c: 60 M?1; 111d: 47 M?1; β-glucose > 半乳糖 (20?:?1) > GlcNAc (9?:?1) D2O, 人血浆



112 三环辛酰胺笼受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 — 辛基β-d-纤维二糖 ? 其他 CDCl3/CD3OH (92?:?8)



113 三环聚酰胺受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 2 M?1 d-纤维二糖 ? d-glucose (1300?:?1) H2O/D2O



114 三环聚酰胺受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 3 M?1 d-纤维二糖 ? d-glucose (1300?:?1) H2O/D2O



116 四环聚酰胺合成凝集素 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 11 M?1 d-纤维二糖 ? 乳糖/麦芽糖 (～50?:?1) H2O/D2O



117 双蒽基单环合成凝集素 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 56 M?1 葡萄糖 ? 半乳糖/甘露糖 (50?:?1) H2O/D2O, PBS缓冲液 (pH 7.1)



118 双蒽基受体带树枝状侧链 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 + 静电吸引 90 M?1 葡萄糖? 半乳糖/甘露糖 H2O/D2O, PBS缓冲液 (pH 7.1)



119 基于芘的双环穿线受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 + 穿线复合 120 M?1 葡萄糖 ? 甘露糖/半乳糖



120 基于芘的三环受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 120 M?1 O-GlcNAc糖肽 ? GlcNAc衍生物 H2O/D2O (pH 7)



121 基于芘的三环受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 190 M?1 GlcNAc-β-OMe ? α-异构体 (12?:?1) H2O/D2O (pH 7)



122 手性嘧啶基大环受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 250 M?1 葡萄糖 ? 甘露糖



123 双环六脲仿生受体 氢键作用 + [C–H?π]相互作用 18?200 M?1 (ITC) 葡萄糖 ? 半乳糖/甘露糖 (～100?:?1) H2O/D2O, PBS缓冲液 (pH 6–8), 人血清



124 基于芘的三环八阳离子受体 氢键作用 ([C–H?O]) + [C–H?π]相互作用 286 M?1 (荧光滴定) 葡萄糖 ? 甘露糖/果糖 (～40?:?1) H2O/D2O (pH 7)



125 基于芘的三环八阳离子受体 氢键作用 ([C–H?O]) + [C–H?π]相互作用 96 M?1 (荧光滴定) 葡萄糖 ? 蔗糖/甘露糖 (～20?:?1) H2O/D2O (pH 7)



126 基于二茂蒽的十二阳离子四内酰胺受体 氢键作用 ([N–H?O] + [C–H?O]) + [C–H?π]相互作用 684 M?1 (ITC) 葡萄糖 ? 甘露糖 (211?:?1) ? 半乳糖 (37?:?1) H2O/D2O (pH 7)



6. 基于硼酸的探针



在第二至第五节中介绍了大分子葡萄糖检测系统的范围之后，本综述将以基于小分子的探针作为结尾，这一领域主要由硼酸和特别是苯硼酸（PBAs）主导。单硼酸和双硼酸系统都很常见，这里将详细讨论。硼酸基团容易且可逆地与1,2-二醇或1,3-二醇（如糖类中的）形成硼酸酯（硼酸盐酯）。硼酸与取代的顺式二醇之间的结合比与反式或线性二醇（例如乙二醇）的结合更强，因此这些共价的可逆相互作用可以很容易地用于糖类的结合、识别和区分。糖类（以及更广泛的二醇类）的结合与识别是一个已被广泛描述和详细研究的课题，因此本文将不详细汇报该领域的历史工作。157–159

大致来说，二醇类的识别与结合过程由图76a所示的平衡关系所涵盖，这些平衡关系展示了PBA 127与其相关硼酸酯阴离子130在水溶液中相互转化的不同机制路径，这一过程最初由Edwards和Lorand在1959年进行研究。160由于这些系统的复杂性，通常会考虑图76b所示的通用平衡关系，它更广泛地描述了硼酸与酯类之间的平衡，其平衡常数表示为Keq。硼酸在结合二醇类时的反应性、稳定性和选择性关键在于硼原子中心能够在低价的sp2杂化状态和四价的sp3阴离子构型之间切换。图76

(a) 苯基硼酸与二醇类的反应。(b) 苯基硼酸与二醇类化合物反应的简化模型。

6.1. 基于单硼酸的探针

单甲基苯基硼酸衍生物可以通过多种结构修饰和现有的传感方法来用于葡萄糖检测。这包括与荧光基团的结合以创建荧光探针，将其嵌入量子点、凝胶、微凝胶或纳米钻石中，或者与功能单体聚合以制备电化学探针。使用PBAs进行葡萄糖检测可以追溯到一些开创性的研究：Yoon和Czarnik在1992年首次报道的硼酸糖类探针（探针131，图77），161以及Shinkai和James在1994年开发的邻氨基甲基苯基硼酸探针132（图77）和133（图95，见第6.2节）。163,164 Czarnik和Yoon最初的系统基于分子内电荷转移（ICT）荧光机制，即异种原子或强吸电子基团在激发状态下导致电子密度失衡，从而通过增强荧光团与周围溶剂壳层之间的偶极-偶极相互作用而引起荧光淬灭。对于探针131来说，这意味着果糖的结合会通过形成硼酸酯阴离子而导致荧光减弱，这一现象在简单暴露于碱性水溶液中也能观察到。该探针被发现能够在pH 7.4的水溶液中选择性识别d-果糖。随后在1993年，Czarnik和Yoon合成了另一种基于蒽的硼酸探针134（图77），165，它是探针131的异构体。尽管它显示出与探针131类似的螯合和荧光淬灭效果，但选择性和灵敏度有所降低。图77

基于单硼酸的探针的代表性例子。根据Edwards和Lorand160以及Wulff166,167早期的机理研究，当时已经知道，在中性条件下，在苯基硼酸上引入氧 aminoalkyl（甲基）取代基可以显著提高其对二醇类的亲和力。后来，Shinkai和James在1994年报道了基于邻氨基甲基苯基硼酸的蒽类探针132和133（见第6.2节）。163,164 与前几代系统不同，探针132在加入葡萄糖后显示出显著的荧光增强现象，当时认为这是由三级胺到蒽的光诱导电子转移（PeT）控制的，从而抑制了荧光淬灭。当葡萄糖结合时，探针132发生“开启-关闭”激活，产生新的荧光输出，最初认为是由于硼酸酯的Lewis酸度增加触发了N → B配位，从而抑制了PeT淬灭（图78a）。158,168 然而，自那时以来，人们对这一机制有了更好的理解。Wang和Franzen在2003年提出了另一种解释，他们观察到N–B键较弱，表明硼酸酯的形成可能导致“pKa转换”，使胺质质子化从而抑制PeT淬灭（图78b）。169,170 2006年，Anslyn和Zhu进一步证实了预期的N → B键仅在没有质子的溶剂中容易形成。171 十年后，即在2017年，Anslyn和Chapin等人发现探针132的荧光增强可能是在结合过程中解聚造成的（图78c）。

图78

提出了邻氨基甲基苯基硼酸荧光“开启”机制：(a) N–B键合；(b) pKa转换；(c) 解聚；(d) 松散螺栓内转换。不久之后，在2018年，Anslyn、Sun、James等人建立了o-氨基苯基硼酸荧光特性的统一理论。173,174 他们提出了一个由–B(OH)2诱导的内转换机制（图78d）。这是通过确定探针132的关键性质实现的。首先，它不会聚集。其次，他们确认在水溶液中没有观察到B → N键，即使在果糖存在的情况下也是如此。第三，在纯甲醇溶液中，硼酸–B(OH)2转化为甲氧基硼酸酯，后者在果糖结合时没有荧光响应。因此，Anslyn等人表明–B(OH)2诱导的内转换机制可以解释o-氨基甲基苯基硼酸荧光探针如何识别糖类，作者将这种现象称为“松散螺栓效应”。图79

基于硼酸的隐形眼镜传感器示意图，用于测定泪液中的葡萄糖浓度。经参考文献182许可改编。版权归美国临床化学协会所有（2004年）。在James和Shinkai最初的“开-关”传感器的基础上，James和Kijima等人于1999年开发了一种荧光“开-关”探针135（图77），使用四苯基卟啉锡（IV）作为荧光团，2-氨基甲基苯基硼酸作为糖类结合位点。175 417纳米的激发产生605纳米的 distinct fluorescence emission peak λem，加入果糖后荧光强度减弱。在这种情况下，认为荧光特性的变化是由空间因素引起的，硼酸酯-糖复形的形成导致氨基硼酸基团的旋转，从而使其远离卟啉荧光团。2000年，James和Ward等人报道了另一种o-氨基苯基硼酸探针136（图77），这是一种依赖于ICT的颜色系统。176 在碱性pH 11.32下，探针136呈紫色，加入糖类后变为红色。从机制上看，一旦形成了糖-传感器硼酸酯复合物，B → N键的相互作用得到促进，显著增加了苄基胺的酸度，使其去质子化。阴离子物种的形成导致了观察到的颜色变化。硼酸-糖复合物的稳定常数（log?K）是从相应的UV-Vis吸收-浓度曲线计算得出的，其中d-果糖的稳定常数为3.75，d-葡萄糖为1.85，乙二醇为0.66，显示出对d-葡萄糖的显著选择性。尽管由于所需的高pH值，这些传感器明显不适合原位测试，但它们非常适合特定的测试应用，例如开发葡萄糖诊断试纸。除了蒽基硼酸和o-氨基苯基硼酸系统外，还有很多不同的荧光和功能性方法通过硼酸来检测葡萄糖。2005年，Zhu和Wang等人使用四硫富瓦烯（TTF）衍生物作为电子供体，合成了含有硼酸识别基团的四硫富瓦烯-蒽化合物137（图77）。177 由于四硫富瓦烯的强电子供体能力，该探针与糖类的相互作用引起了显著的荧光响应，当果糖浓度达到50 mM时，荧光强度增加了5倍，显示出对果糖的高选择性。随后，在2006年，Zhu和Tan等人通过向探针137中添加硼酸基团合成了双硼酸探针138（图96，见第6.2节）。178 探针138与各种糖类的结合常数顺序为：d-葡萄糖 > d-甘露糖 > d-果糖 > d-半乳糖，显示出对d-葡萄糖的良好选择性（有关双硼酸探针的更多信息，请参见第6.2–6.4节）。在生理条件（pH 7.3）下，探针138的荧光强度在接触1500当量的d-葡萄糖后增强了6倍。虽然在d-半乳糖、d-甘露糖和d-果糖中也观察到了荧光增强，但响应强度明显低于d-葡萄糖（<3倍）。2004年，Lowe和Kabilan等人成功制备了一种能够检测葡萄糖的全息传感器，使用4-乙烯基苯基硼酸139（图77）作为葡萄糖探针，179 该传感器在pH 9条件下对葡萄糖的响应具有优异的可逆性。当葡萄糖与139结合形成带电的硼酸酯时，会产生Donnan电位，驱动水渗透到水凝胶中，引起膨胀。这种膨胀增加了全息条纹之间的间距，导致衍射波长的红移。去除葡萄糖后，传感器恢复到初始的衍射波长，证明了苯基硼酸与顺式二醇之间结合反应的可逆性。不幸的是，在pH 7.4和pH 8条件下，传感器在2 mM葡萄糖存在时没有显示出明显的衍射波长变化。这归因于139的pKa约为8.9；因此，在pH低于9时，其四面体硼酸构型的比例较低，导致葡萄糖结合能力减弱，从而降低了传感器的灵敏度。

3-丙烯酰胺基苯基硼酸140（AAPBA，图77）可以集成到丙烯酰胺共聚物中，并已验证其在生理pH条件下能够结合葡萄糖。因此，在同一年，Lowe团队使用140作为葡萄糖探针，构建了一种集成到隐形眼镜中的葡萄糖敏感型全息传感器，用于微创葡萄糖检测。180 在pH 7.4的PBS溶液中，该传感器对2 mM葡萄糖表现出可逆的响应，用缓冲液冲洗后恢复到初始的衍射波长，从而证明了其在生理环境中的适用性。此外，初步的人体试验结果表明，该传感器能够跟踪血糖波动，为后续的体内验证和设备优化奠定了坚实的基础。2008年，Lowe团队使用2-丙烯酰胺基苯基硼酸141（图77）作为葡萄糖探针，构建了具有更低乳酸和pH干扰的全息葡萄糖传感器。181

2004年，Asher和Alexeev等人使用4-氨基-3-氟苯基硼酸142和4-羧基-3-氟苯基硼酸143（图77和79）作为葡萄糖探针，构建了一种新型的光子晶体葡萄糖传感器。182 4-乙酰氨基-3-氟苯基硼酸的pKa为7.81，而3-氟-4-N-甲基羧酰胺苯基硼酸的pKa为7.28；这两个值都适合生理pH。在生理pH和离子强度下，该传感器在泪液中实现了高灵敏度和选择性的葡萄糖检测，检测限低至1 μmol L?1，并且能够通过视觉区分不同葡萄糖浓度下的衍射颜色变化。Geddes和Badugu在2004年展示了另一种基于奎尼盐的系统，用于检测泪液中的葡萄糖。这种基团的高溶解度和较低的pKa（在缓冲液中为6.70–7.90，结合葡萄糖后为6.10–6.95）使其能够在隐形眼镜的酸性介质（pH 5.5–6.5）中使用，为可穿戴诊断设备的开发提供了可能。在这项研究中，他们报道了探针144a–c（图77），183 其荧光通过葡萄糖配位时的电荷中和来调节。这些系统的吸收波长为345纳米，发射波长为450纳米，适用于荧光检测，并在隐形眼镜中展示了适当的连续监测泪液葡萄糖水平的能力，检测范围为50–500 μM。Pyrene也可以用作荧光团，例如Pitchumani和Tharmaraj在2013年开发的探针145（图77）。184 与葡萄糖反应时，512纳米处的荧光信号显著增强，这归功于pyrene-硼酸PeT淬灭的抑制作用，使得这种探针成为“开-关”型探针。探针145在其荧光强度和葡萄糖浓度之间显示出强烈的线性关联，相关系数（R2 = 0.9998），并且具有令人印象深刻的检测限为5.0 × 10?7 M。Coumarin也是一种经典的发色团，也可以用于检测葡萄糖。2013年，Zhang和Bai设计并合成了单硼酸探针146，使用coumarin作为荧光团（图77）。185 该探针利用α,β-不饱和酮连接剂在coumarin和苯基硼酸之间延伸共轭，实现了最大的吸收和发射波长分别为463纳米和616纳米。探针146具有良好的水溶性，在1% DMSO（二甲基亚砜）-PBS中的选择性显示如下：d-果糖 > d-山梨醇 ? d-半乳糖 ≈ d-葡萄糖 ≈ d-甘露糖。这项工作为开发具有良好水溶性、较大Stokes位移和较长发射波长的葡萄糖基荧光探针提供了有价值的设计视角。与先前的应用类似，这些传统的单光子荧光探针存在激发波长较短和组织穿透深度不足的问题，这些问题可以通过使用双光子显微镜（TPM）部分解决（见上文）。2012年，Cho和Lim等人设计并合成了单硼酸探针147，其激发波长为780纳米（图77.186）。该探针对d-葡萄糖、d-半乳糖和d-果糖的解离常数分别为0.60 ± 0.03 M、0.35 ± 0.01 M和0.048 ± 0.002 M，显示出对葡萄糖的良好选择性。将HeLa细胞和初级皮层神经元与147以及LysoTracker Red（一种特异性针对酸性囊泡的荧光探针）共培养后，发现147主要位于细胞质中，只有少量存在于溶酶体中。加入20 mM d-葡萄糖后，细胞内的荧光强度最初增加随后下降，而加入半乳糖或果糖时没有观察到这种变化（图80a–h），证实了其良好的选择性。同样，在对大鼠海马组织切片的成像中，147能够监测葡萄糖的吸收情况，而对其他糖类的吸收没有反应。

伪彩色的TPM图像显示，标记有147的（a）–（c）HeLa细胞和（d）–（f）初级皮层神经元细胞分别在（a）和（d）100秒、（b）和（e）300秒以及（c）和（f）1000秒的时间点被捕获。（g）和（h）为（g）HeLa细胞和（h）初级皮层神经元的双光子激发荧光（TPEF）强度随时间的变化情况。在780纳米波长下，用飞秒脉冲激光激发后，在500–620纳米范围内记录TPEF信号。经参考文献186许可改编。版权所有（2012）英国皇家化学会。

到目前为止讨论的所有单硼酸小分子系统都依赖于硼酸与葡萄糖二醇之间的简单结合来引发响应。Jiang和Huang等人在2013年提出了一种有趣的设计思路，即葡萄糖可以利用其两组顺式二醇结构来连接两个含有硼酸的分子。他们报告的“两亲性单体”探针148采用了高亲脂性的芘作为荧光团和亲脂性的“尾部”，与极性的硼酸“头部”形成互补（图77和81）。该系统的设计目的是在高葡萄糖浓度下促使荧光团聚集成发色团，从而在较长波长下发射光线。实验观察到，这种聚集体确实可以在pH 10.0的碳酸盐缓冲液中发出约390纳米的荧光，而葡萄糖桥接的聚集体则发出约510纳米的荧光。相比之下，加入果糖后仅观察到轻微的荧光增强，因为在果糖存在下无法形成二聚体。葡萄糖的可检测最低浓度为10 μM，且芘聚体的灵敏度高于大多数单硼酸小分子探针，为小分子探针的设计提供了新的思路。

（a）示意图展示了探针148与果糖形成1:1复合物，以及与葡萄糖形成1:2聚集体。（b）在含有2%（体积比）甲醇的pH 10.0碳酸盐缓冲液中，记录了148在不同葡萄糖浓度（0–10 mM）下的荧光光谱（b）和（c）荧光光谱（d）。图中插图显示了荧光团与单体之间的强度比与糖浓度的关系。探针148的浓度为0.1 mM，激发波长为λex = 328 nm。经参考文献187许可改编。版权所有（2013）美国化学会。

从小分子探针发展而来的方法是将其整合到聚合物中，并应用于胶束和凝胶基系统中。例如，2016年，Wei和Wang等人合成了单体荧光探针149（图77和82.188）。与上述两亲性系统148类似，每个葡萄糖分子可以与两个硼酸结合，导致含有硼酸的聚合物链交联，从而增强荧光信号。荧光光谱显示，探针149的荧光强度与葡萄糖浓度对数呈良好的线性关系（R2 = 0.992），检测限为0.8 μM。此外，该探针对葡萄糖具有出色的选择性，对其他所有测试的生物分子（包括果糖和乳糖）的荧光增强作用可以忽略不计。该方法在人类血清白蛋白中的应用表明，它可以准确检测到8.0 ± 0.1 mM的正常葡萄糖浓度。通过尖峰恢复法验证了该方法的准确性，范围为90.5%至100%，相对标准差为1.2%至3.8%，表明该方法能够准确测定复杂生物样本中的葡萄糖含量。

（a）示意图展示了探针148与果糖形成1:1复合物，以及与葡萄糖形成1:2聚集体。（b）在含有2%（体积比）甲醇的pH 10.0碳酸盐缓冲液中，记录了148在不同葡萄糖浓度（0–10 mM）下的荧光光谱。图中插图显示了荧光团与单体之间的强度比与糖浓度的关系。探针148的浓度为0.1 mM，激发波长为λex = 328 nm。经参考文献187许可改编。版权所有（2013）美国化学会。

暂时远离溶液中的小分子探针，将它们整合到聚合物中并在胶束和凝胶基系统中应用也变得越来越普遍。例如，Liu和Zhang等人在2014年制备了一种耐光漂白的微凝胶探针150，使用3-丙烯酰胺苯基硼酸（AAPBA）作为葡萄糖识别位点，聚（氨基胺）（G1.0 PAMAM）作为荧光团（图83.189）。425纳米处的荧光强度随着葡萄糖浓度的增加而显著增强，这是由于微凝胶网络的变化和氢键的增加所致。微凝胶探针150能够检测低至10 μM的葡萄糖浓度，表现出快速的响应和优异的光稳定性，优于参考有机染料DAPI（4′,6-二胺基-2-苯基吲哚），适用于长期和连续的血糖监测。在HepG2细胞实验中，随着葡萄糖浓度的增加，荧光逐渐增强，MTT实验表明在100 μg/mL的浓度下对HepG2细胞没有显著的细胞毒性。在体内小鼠实验中，将微凝胶注射到小鼠耳朵的真皮层中，PAMAM功能化的微凝胶探针150在365纳米光源激发下发出蓝光，证实了微凝胶探针150能够实现无创的经皮血糖检测。这项研究有潜力发展成为智能多功能连续血糖监测传感器，从而为糖尿病管理和临床医学提供准确的检测方法。

（a）示意图展示了用于体内葡萄糖检测的PAMAM功能化微凝胶探针150。（b）体外不同葡萄糖浓度下微凝胶的荧光响应。（c）将微凝胶植入小鼠耳朵真皮层后的体内实验。左图为注射前；中图为加入1 mg/mL G1.0 PAMAM后；右图为注射1 mg/mL PAMAM功能化微凝胶探针150后的情况。经参考文献189许可改编。版权所有（2014）英国皇家化学会。

将小分子探针整合到水凝胶中也非常常见。例如，Sakata和Kajisa等人将4-乙烯基苯基硼酸与2-羟基乙基甲基丙烯酸（HEMA）聚合，合成了基于苯基硼酸的水凝胶151（图84），旨在构建用于场效应晶体管（FET）生物传感器的葡萄糖响应性水凝胶。当葡萄糖浓度从10 μM增加到40 mM时，水凝胶FET的栅极表面电位向负方向变化。此外，覆盖在栅极上的水凝胶可以抑制由蛋白质（如白蛋白）非特异性吸附引起的噪声。实验数据显示，表面电位的变化与葡萄糖浓度对数呈线性关系，检测限为5 μM。这项研究有望应用于制造用于生物流体中葡萄糖检测的可穿戴设备。

（a）基于硼酸水凝胶的FET用于葡萄糖传感的示意图。经参考文献188许可改编。版权所有（2016）Elsevier B.V.

2014年，Liu和Zhang等人开发了一种抗光漂白的微凝胶探针150，使用3-丙烯酰胺苯基硼酸（AAPBA）作为葡萄糖识别位点，聚（氨基胺）（G1.0 PAMAM）作为荧光团（图83.189）。425纳米处的荧光强度随着葡萄糖浓度的增加而显著增强，这是由于微凝胶网络的变化和氢键的增加所致。微凝胶探针150能够检测低至10 μM的葡萄糖浓度，表现出快速响应和优异的光稳定性，优于参考有机染料DAPI（4′,6-二胺基-2-苯基吲哚），适用于长期和连续的血糖监测。在HepG2细胞实验中，随着葡萄糖浓度的增加，荧光逐渐增强，MTT实验表明在100 μg/mL的浓度下对HepG2细胞没有显著的细胞毒性。在体内小鼠实验中，微凝胶被注射到小鼠耳朵的真皮层中，PAMAM功能化的微凝胶探针150在365纳米光源激发下发出蓝光，证实了微凝胶探针150可以实现无线经皮葡萄糖检测。这项研究有潜力发展为智能多功能连续血糖监测传感器，从而为糖尿病管理和临床医学提供准确的检测方法。

（a）体内葡萄糖检测用PAMAM功能化微凝胶探针150的示意图。（b）体外不同葡萄糖浓度下微凝胶的荧光响应。（c）将微凝胶植入小鼠耳朵真皮层的体内实验。左图为注射前；中图为加入1 mg/mL G1.0 PAMAM后；右图为注射1 mg/mL PAMAM功能化微凝胶探针150后的情况。经参考文献189许可改编。版权所有（2014）英国皇家化学会。

将小分子探针整合到水凝胶中也很常见。例如，Sakata和Kajisa等人将4-乙烯基苯基硼酸与2-羟基乙基甲基丙烯酸（HEMA）聚合，合成了苯基硼酸基水凝胶151（图84），旨在构建用于场效应晶体管（FET）生物传感器的葡萄糖响应性水凝胶。当葡萄糖浓度从10 μM增加到40 mM时，水凝胶FET的栅极表面电位发生负方向变化。此外，覆盖在栅极上的水凝胶可以抑制蛋白质（如白蛋白）的非特异性吸附引起的噪声。实验数据显示，表面电位的变化与葡萄糖浓度对数呈线性关系，检测限为5 μM。这项研究有望应用于制造专门用于生物流体中葡萄糖检测的可穿戴设备。

（a）基于硼酸水凝胶的FET用于葡萄糖传感的示意图。经参考文献190改编，由Taylor & Francis出版。2017年，Yun和Yetisen等人开发了一种新型的葡萄糖敏感型水凝胶光纤传感器152，使用AAPBA引入硼酸（图85.191）。该研究选用聚（丙烯酰胺-聚（乙二醇）二丙烯酸）（p(AM-co-PEGDA）作为光纤的核心材料，海藻酸钠作为包层。AAPBA硼酸通过共价键结合到水凝胶光纤核心中。当葡萄糖扩散到水凝胶中时，会与AAPBA发生复合物形成，改变系统的Donnan平衡，进而影响其密度和折射率。因此，通过测量输出光强度的变化可以监测葡萄糖浓度。这种水凝胶光纤传感器152能够实现快速、敏感且可逆的葡萄糖检测，具有在糖尿病患者中进行连续血糖监测的巨大潜力，有助于更有效的糖尿病管理。

（a）葡萄糖响应性p(AM-co-PEGDA-co-3-APBA)光纤核心的结构组成，表面涂覆有海藻酸钠。（b）水凝胶基质152通过3-APBA功能化，该物质处于带电的四面体形式。（c）PBA衍生物与葡萄糖的二醇结构相互作用，导致水凝胶纤维的折射率发生变化。（d）通过监测输出光强度的变化可以量化葡萄糖浓度的变化。经Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim出版。正如预期，小分子硼酸基探针在溶液、凝胶和自组装系统中的成功应用促使它们被整合到异质糖类识别系统中，例如量子点。例如，Zhou和Wu等人在2010年使用的纳米探针153（APBA-QDs）利用3-氨基苯基硼酸（APBA）修饰的CdTe/ZnTe/ZnS量子点进行细胞内葡萄糖成像（图86a.192）。TEM显示，随着葡萄糖浓度的增加，APBA-QD组装体通过紧密堆积而增加，这与之前提出的桥接/交联机制一致。体外实验表明，153在0.4–20.0 mM的生理浓度范围内对葡萄糖具有敏感的响应，检测限为50 μM。细胞成像显示153能够进入细胞，并主要分布在细胞质的特定区域（图86b–d），证实了APBA-QDs作为葡萄糖传感纳米探针的可行性。

（a）示意图展示了用于葡萄糖检测的PBA修饰的CdTe/ZnTe/ZnS量子点153。（b）–（d）扫描共聚焦荧光显微镜图像（左）、透射电子显微镜图像（中）以及合并图像（右），这些图像是从与153（5.0 mg/mL）孵育的小鼠黑色素瘤B16F10细胞获得的。葡萄糖分别以（b）0 mM、（c）2.0 mM和（d）20.0 mM的浓度添加。局部光致发光光谱是从黄色圆圈标记的特定区域记录的。经参考文献192许可改编。版权所有（2010）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。Shi和Qu等人在2013年采用了类似的方法，使用石墨烯量子点（GQDs）（纳米探针154，图87.193）。在这项研究中，GQDs是由羧基修饰的石墨烯氧化物与APBA通过1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）偶联而成。在水溶液中，探针154对葡萄糖表现出快速而敏感的响应，其结合导致通过交联而聚集，从而改变荧光谱型。这种方法实现了0.1–10 mM范围内的葡萄糖检测，检测限为5.0 μM，Stern–Volmer分析显示良好的线性关系（相关系数R = 0.999）。观察到葡萄糖对其他糖类的选择性非常好，仅葡萄糖能够引发GQDs的交联。探针154的成功应用证明了对大鼠脑微透析液中的葡萄糖水平进行测量。

（a）通过APBA修饰GQDs以合成量子点APBA-GQDs 154。（b）添加或不添加葡萄糖时探针154的荧光光谱。（c）TEM图像显示探针154在暴露于20 mM葡萄糖时的紧密堆积状态。（d）提出的葡萄糖识别中的表面淬灭状态（SQS）机制。经参考文献193许可改编。版权所有（2013）英国皇家化学会。进一步的发展包括Zhou和Hao等人在2016年发布的报告，他们使用BA（硼酸）修饰的QDs开发了一种比率荧光葡萄糖探针155（图88），结合了红色和绿色发光的CdTe量子点（r-QDs和g-QDs）。154的使用使得比率荧光技术成为可能，实现了视觉比色和荧光葡萄糖检测。在这种情况下，只有g-QD组分被APBA修饰，因此葡萄糖的添加仅在g-QD部位引发交联聚集，导致绿色荧光淬灭，而r-QD的输出保持不变。这种随着葡萄糖浓度增加从绿色变为红色的比率颜色变化可以用来量化葡萄糖浓度，功能范围为0.1–2.0 mM，检测限为4.5 μM。探针155的应用通过在人类血清样本中检测葡萄糖水平来说明，证明了这种比率荧光探针能够高效、简单地快速、灵敏且特异性地可视化识别葡萄糖，而无需复杂的设备。图88。

比率荧光探针155的合成示意图及其葡萄糖检测机制。其他非量子点（QD）光学固体支持的/基于硼酸的葡萄糖检测方法也在开发中，例如Strano和Yum等人在2012年使用的芳基硼酸系统156，该系统采用了BA-SWNT复合材料。通过高通量筛选，作者测试了30种不同的芳基硼酸，最终确定4-氰基苯基硼酸是可行的可逆葡萄糖传感器，在加入45.5 mM葡萄糖时显示出最大的荧光响应（达到原始SC/SWNT荧光水平的75%）（见第6.4节关于PBA的功能/电子修饰的工作）。硼酸与SWNT表面结合会导致荧光淬灭，这是由于PeT效应。当葡萄糖与SWNT结合的硼酸复合时，会发生预期的sp2/sp3中性/阴离子转换，降低硼酸的还原潜能。这种转变减少了硼酸与SWNT之间的电位差，从而降低了PeT淬灭的程度，并使纳米管的荧光恢复。这种4-氰基苯基硼酸BA-SWNT在生理葡萄糖浓度0–30 mM范围内展示了敏感的荧光响应，为近红外光学检测和识别糖类及糖蛋白提供了一个新的平台。图89。

硼酸与悬浮在SWNT上的胆酸钠复合的示意图，以及随后的硼酸SWNT复合物对葡萄糖的检测机制。改编自参考文献195。版权（2012）美国化学学会。另外，Guan和Cai等人在2022年报道了一种光子纳米链探针PNCs 157，它可以通过比色法检测葡萄糖（图90）。这种探针由一维的磁纳米粒子阵列组成，这些粒子被苯基硼酸修饰的羟凝胶包裹，厚度为几十纳米。当葡萄糖浓度从0增加到20 mM时，溶液的颜色从绿色变为黄色或橙色，因为探针PNCs 157的波长向红端移动了130 nm。这项研究开发出一种快速、连续且可逆的葡萄糖检测光子纳米链探针，采用了一种独特的合成方法。这种探针在实时连续监测葡萄糖方面显示出巨大潜力，并有助于实现葡萄糖诊断设备的微型化。图90。

Fe3O4@PVP@poly(AAPBA-co-HEAAm) PNCs 157的特性和葡萄糖检测性能。(a) 扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像；(b) 在水平磁场下的暗场光学显微镜图像；(c) 数码照片；(d) 在不同葡萄糖浓度循环扫描时的衍射波长。改编自Wiley-VCH Verlag GmbH出版的参考文献196。更近期的是，Mei和Lu等人在2023年开发了一种葡萄糖响应的上转换纳米探针158（UCNP@mSiO2/FITC-BA），其中苯基硼酸修饰的荧光异硫氰酸酯158a（FITC-BA）作为葡萄糖检测单元（图91）。这种纳米探针158成功用于小鼠体内实时检测和调节血糖水平。制备这种探针首先需要将介孔二氧化硅涂层在NaYF4:Yb/Tm纳米颗粒上，然后可以将硼酸158a引入孔隙中。评估结果显示，纳米探针158的荧光强度与葡萄糖浓度成正比变化，经过多次循环后响应幅度保持不变，显示出良好的可逆性和稳定性。在体内小鼠实验中，当用980 nm近红外光照射时，纳米探针158会发出470 nm的蓝光。这种光激活的光敏蛋白导致细胞内钙离子增加，进而刺激转录因子促进GLP-1（胰高血糖素样肽-1）从工程化的HEK293细胞中分泌。最终，这一过程刺激了胰岛细胞分泌胰岛素，降低了血糖水平。此外，血糖的降低提供了对纳米探针158荧光强度的反馈调节，抑制了基因激活，建立了有助于糖尿病小鼠维持血糖稳态的反馈机制。这项研究展示了使用基于荧光异硫氰酸酯的硼酸葡萄糖探针实现血糖浓度的实时反馈调节。基于硼酸的系统也被用来实现直接的、葡萄糖触发的胰岛素释放。2025年，Egawa等人报道了一种完全可溶解的葡萄糖响应胰岛素递送系统，由GOx和p-硼氧基苯甲酰基（BPmoc）修饰的胰岛素前药组成。在高葡萄糖条件下，GOx生成过氧化氢，触发BPmoc的裂解并释放活性胰岛素。体外和体内研究表明，在高血糖条件下，该系统能够依赖葡萄糖激活胰岛素并选择性地降低血糖，从而降低低血糖的风险。图91。

(a) 158a（FITC-BA）在葡萄糖结合前后疏水性质的变化。(b) 在添加不同葡萄糖浓度后纳米探针158的荧光恢复情况。(c) 与商用血糖仪测量的血糖水平相比的羟凝胶荧光强度。(d) 用于糖尿病小鼠的可逆葡萄糖检测和葡萄糖反馈光遗传学治疗的上转换纳米探针158。改编自参考文献197的许可。版权（2023）美国化学学会。到目前为止讨论的单硼酸系统仅依赖于光学输出。我们不限于这些技术，因此本小节的剩余部分将以一些非光学的基于硼酸的葡萄糖传感器作为结束。一个值得注意的例子是Zhao和Awino等人在2016年的工作，他们开发的硼酸修饰的分子印迹纳米颗粒（MINPs）159能够实现类似酶的葡萄糖检测（图92）。通过使用Click化学将表面活性剂159a与重氮化物159b结合，制备了烷基官能化的表面交联胶束，然后使用4-乙烯基苯基硼酸-葡萄糖复合物“模板”进行功能化。随后的洗涤过程去除了葡萄糖，从而获得了包含两个硼酸基团的酶类似葡萄糖特异性识别位点。在HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸）缓冲液（pH 7.4）中的结合研究表明，其结合亲和力为Ka = 1.18 × 10^3 M^-1（相比之下，Davis的凝集素模拟系统为7–19 × 10^3 M^-1，见第5.2节），对葡萄糖的选择性很高，而对其他D-六糖和非六糖醛的结合亲和力很小。这项工作为开发用于糖类识别的分子印迹纳米颗粒奠定了坚实的基础，并为选择性识别单糖和多糖提供了一种有前景的通用设计策略。图92。

使用硼酸修饰的MINP 159进行葡萄糖检测的方法。改编自参考文献199的许可。版权（2016）美国化学学会。2020年，Qi和Qiao等人使用了一种完全不同的胶束基底层状物，设计并合成了一种高灵敏度的葡萄糖纳米探针160（P(MAn-St-NIPAm-PBA）（图93）。使用嵌段共聚物P(MAn-St-NIPAm)作为支撑，使得胶束表面具有高密度的PBA位点，从而可以选择性地形成PBA–葡萄糖–PBA复合物。因此，葡萄糖可以被选择性地结合，而其他糖类则不会被强烈结合。在捕获葡萄糖后，通过pH触发的释放和使用特定分析物的酶促反应实现可控制的检测。在大鼠脑样本中，这种方法基于级联酶反应和醌的紫外强度变化，能够在0.30–10.0 mM的范围内检测葡萄糖，检测限为0.20 mM。实验表明，葡萄糖浓度与产生的醌在470 nm处的紫外强度呈线性关系，提供了一种创新的非荧光团衍生的基于硼酸的葡萄糖检测平台。图93。

(a) 选择性及可控检测纳米反应器160用于葡萄糖检测的示意图。(b) 大鼠脑中微渗析过程的示意图。(c) 使用空心纳米反应器捕获和释放葡萄糖的程序。(d) 装备有GOx酶和肌红蛋白（Myo）基催化剂的空心纳米反应器，可以通过温度调节来控制大鼠脑中的葡萄糖检测。改编自参考文献200的许可。版权（2020）美国化学学会。2017年，Schiller和Axthelm等人开发的氟化硼酸吡啶盐161可以利用19F核磁共振（19F NMR）光谱方法检测葡萄糖（并与其他二醇区分开）（图94）。使用这种探针，研究了59种双醇类化合物，证明了161能够区分一系列单糖（例如葡萄糖、果糖）及其异构体，以及其他分析物，包括多元醇、羧酸、氨基酸和儿茶酚，基于代表性的19F NMR化学位移。与其他基于NMR的探针相比，161的阳离子性质使其具有良好的水溶性，而氟的引入提高了其对化学/磁环境变化的敏感性，宽化的化学位移范围（防止信号重叠），并且背景干扰最小，从而确保了可靠和清晰的信号。此外，特征性的19F NMR分析指纹在不同pH条件下表现出良好的稳定性，使其特别适合医疗应用。图94。

用于19F NMR光谱的探针161。改编自参考文献201的许可。版权（2017）美国化学学会。

6.2. 基于二硼酸的探针

如本节开头所述，James和Shinkai的早期工作对糖类识别系统的发展做出了开创性的贡献。这包括在第6.1节中详细讨论的单硼酸132，以及二硼酸探针133（图95）。探针133代表了第一个具有高葡萄糖选择性的基于硼酸的探针，这是由于葡萄糖能够结合两个硼酸的能力，如上述许多系统中所见。在这种情况下，桥接作用发生在分子内部，最初认为是形成了1:1的吡喃糖复合物133a。然而，在1999年，Norrild和Bielecki等人确认133a仅存在于无水条件下，而在水存在的情况下，呋喃糖的1:1形式133b更优选。这是通过1H和13C NMR光谱分析，特别是1Jcc耦合常数确定的，证明了所有五个自由羟基基团都结合在133b的硼中心上，因此具有这种结合偏好。探针133在pH 7.77的甲醇/水溶液中对葡萄糖的结合常数Ka为3981 M^-1，远高于果糖（316 M^-1）和半乳糖（158 M^-1）。图95。

探针133在CD3OD中与β-吡喃糖形式结合，在碱性水介质中与α-呋喃糖形式结合。这项工作随后催生了广泛的双硼酸糖类探针领域，由于其结合葡萄糖的双齿性质，使得相对于其他糖类（如半乳糖和果糖）具有出色的选择性。总体而言，二硼酸系统可以分为非Shinkai型和Shinkai型，后者特指基于蒽-o-氨基甲基苯基硼酸的类型。

6.3. 非Shinkai类型的二硼酸探针

关于二硼酸的最早报道早于1994年Shinkai和Murakami等人报导的第一个葡萄糖选择性探针，他们在1993年提出了第一个二硼酸探针162（图96）。由于卟啉在水介质中的聚集，探针162最初不显示荧光。然而，在加入糖类后，硼酸盐的形成破坏了这种聚集，增加了亲水性，从而恢复了荧光。因此，对硼酸具有更高亲和力的糖类显示出更高的解聚效率和更强的荧光输出。因此，荧光输出与单糖与硼酸的结合常数相关：d-果糖 > d-阿拉伯糖 > d-甘露糖 ≈ d-葡萄糖。图96。

非Shinkai类型二硼酸探针的代表性例子。本综述尚未讨论的一个应用是手性识别。早期的一个例子来自Shinkai和James在1995年报道的二硼酸探针163（图96），它可以区分单糖的手性异构体。当在289 nm处激发时，探针163在358 nm处显示出强烈的荧光发射。由于163是围绕BINOL（1,1′-双-2-萘酚）衍生的手性骨架构建的，因此它可以（R）-或（S）-手性，每种手性异构体以不同的方式结合糖类。实验表明，探针（S）-163对L-果糖具有显著的识别能力，而（R）-163对d-果糖有强烈的偏好。在1995年他们的工作基础上，Shinkai和Linnane等人合成了酞菁二硼酸探针164（图96）。在葡萄糖浓度低于1.0 mM时，荧光信号较弱，而在浓度超过1.0 mM时，在365 nm处出现显著的发射峰（λex = 275 nm），浓度增加到100 mM时增强了20倍。使用Corey–Pauling–Koltun模型和结合研究发现，探针164形成的是1:2复合物而不是1:1复合物，这可能是由于两个硼酸之间的距离，不同于上述机制。由于这种单硼酸型的结合机制，该探针的选择性较差，葡萄糖、果糖和半乳糖的稳定常数处于相似的范围（log Ka 分别为 1.96、2.24 和 1.86）。这清楚地表明了通过适当定向的硼酸对实现的有效协同结合效应，这将是我们在本节中探讨的趋势。为了研究两个硼酸之间的距离对结合的影响，Shinkai 和 James 等人在 1997 年设计了二硼酸探针 165（图 96），该探针使用萘作为荧光团，并拥有一个狭窄的结合口袋。不幸的是，尽管距离显著缩短，但发现它不能结合像 D-葡萄糖这样的“大”糖分子，反而能以 1:1 的比例紧密结合像山梨醇这样的“小”糖分子。结合导致苄胺-苯硼酸在 347 nm 处的荧光强度增加。探针 165 被证明能有效检测山梨醇等重要的小分子糖类，这表明仔细调整硼酸之间的距离对选择性至关重要，并且可以调节系统以适应特定的糖类。1999 年，Norrild 和 Eggert 等人合成了二硼酸化合物 166，该化合物对 D-葡萄糖具有选择性且水溶性良好，这一设计是基于 Shinkai 和 James 的探针 133 的研究，并将苯环连接器替换为阳离子吡啶环（图 96）。1H 和 13C 核磁共振光谱数据证实，探针 166 在生理 pH 下以 1:1 的比例与 D-葡萄糖结合。探针 166 的 pKa 值分别为 3.7 和 4.7（未结合状态和结合状态），这提高了其在中性水溶液中结合糖类的能力。探针 166 与 D-葡萄糖的结合常数高达 2512 M^-1。尽管探针 166 的葡萄糖选择性低于探针 133，但其离子性质解决了通常阻碍这类基于荧光的探针使用的水溶性问题。不久之后，在 2001/2002 年，James、Bosch 和 Arimori 等人报道了基于 ICT 荧光的探针 167 和 168（图 96）。首先开发的是单硼酸探针 167，其显示出的糖类稳定性常数顺序为：D-果糖 > D-半乳糖 > D-葡萄糖。在甲醇/水缓冲液（52.1 wt% 甲醇，pH 8.21）中，随着果糖浓度的增加，探针 167 的荧光强度升高，其发射波长从 404 nm 移动到 362 nm。另一方面，这种探针的“二聚体”版本探针 168 在相同条件下对 D-葡萄糖具有选择性，其发射波长几乎相同（从 405 nm 变化到 360 nm）。这一简单的结构变化产生了以下选择性顺序：D-葡萄糖 > D-果糖 > D-半乳糖 > D- mannose，进一步展示了硼酸间距的关键性以及串联硼酸结合的重要作用。这种双-邻氨基苯硼酸基团现在非常普遍，自 1990 年代以来开发的许多双硼酸化合物都遵循简单的模块化模式，如图 96 中的模型结构 169 所示。这些探针通常保留二硼酸基团和三级胺结构，并通过改变间隔物和荧光团来调整选择性和荧光特性。Gibson 和 Appleton 等人在 2000 年的工作很好地说明了这一特定方法，他们合成了一系列二硼酸衍生物 170（图 96），其中烷基二胺间隔物的长度有所不同。观察到荧光输出有高达两倍的差异，6-碳和 7-碳间隔物显示出最佳的葡萄糖选择性，而较长的 8-碳和 12-碳间隔物则更倾向于选择果糖，再次强调了硼酸间距的关键性。同样，James 和 Arimori 等人在 2001 年设计并合成了葡萄糖探针 171（图 96），其中包含两个硼酸基团、一个单个芘荧光团和一个六亚甲基间隔物。与 Gibson 和 Appleton 的研究一致，探针 171 对葡萄糖表现出一定的选择性，其稳定常数顺序为：D-葡萄糖（962 ± 70 M^-1）、D-果糖（784 ± 44 M^-1）、D-半乳糖（657 ± 39 M^-1）和 D-甘露糖（74 ± 3 M^-1）。2002 年，他们使用相同的单芘框架筛选了 C3 到 C8 的间隔物长度，密切观察了糖类的选择性。有趣的是，传感器 1724–6（图 96）对 D-葡萄糖表现出高亲和力，而 1727–8 对 D-半乳糖表现出更高的亲和力，这与之前的研究有些矛盾，但主要突出了传感器整体结构的重要性，因为荧光团的变化似乎也会影响糖类的选择性。2004 年，James 和 Phillips 等人进一步研究了这一现象，他们开发了一系列表示探针 171，同时改变了间隔物和荧光团（图 96）。他们研究了同样的 C3–C8 间隔物，这次结合了五种常见的多环芳烃：芘（a）、菲（b）、蒽（c）、1-萘（d）和 2-萘（e）。还研究了一些双荧光团系统（为清晰起见未在此展示）。这项研究表明，含有单个芘荧光团的探针 1734a、173a 和 1736a 对 D-葡萄糖表现出最高的亲和力，而 1737a 和 1738a 对 D-半乳糖的结合强度最强。荧光团的修改也影响了结合选择性：1736a、1736b 和 1736c 对 D-葡萄糖具有选择性，而 1736d 和 1736e 对 D-半乳糖具有选择性。值得注意的是，含有两个荧光团的探针的结合亲和力降低了。2009 年，James 和 Phillips 等人设计并合成了一种双硼酸镊子型探针 174（图 96）。他们发现探针 174 与 D-葡萄糖、D-甘露糖以 1:1 的比例结合（低浓度时），与 D-果糖以 2:1 的比例结合。探针 174 在 377 nm 处的荧光强度在结合糖类后增强，而在 470 nm 处的荧光强度则根据具体的单糖而变化。探针 174 与糖类的结合稳定性顺序为：D-葡萄糖 > D-半乳糖 > D-甘露糖。Fossey 和 Zhai 等人在 2017 年的工作是对这一方法的延伸，他们开发了四种新型二硼酸化合物 175a–c 和 176，这些化合物具有双三唑核心（图 96）。这些化合物可以通过铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）快速衍生物化来组合组装。探针 175a–c 被用于快速筛选区域异构体以优化硼酸间距。使用等温滴定量热法测定了这些新合成化合物与果糖和葡萄糖的结合常数，发现探针 175a 和 175b 对果糖的亲和力高于葡萄糖。相反，176c 对葡萄糖的结合亲和力是果糖的两倍多，延续了上述趋势。基于这一结构筛选，他们开发了一种基于香豆素的“开-关”型葡萄糖选择性荧光探针 176，加入 5 mM 葡萄糖后其荧光强度逐渐减弱（I/I0 = 0.79）。这些绝不是唯一开发的二硼酸模块化系统，还有许多创新的类似物。例如，2001 年 Drueckhammer 和 Yang 等人利用计算方法设计了专门针对葡萄糖吡喃糖的二硼酸探针 177（图 96）。合成后，对探针的评估显示其葡萄糖结合常数为 Ka = 40,000 M^-1，对葡萄糖的亲和力是其他单糖（包括经常引起问题的果糖）的 400 倍。尽管具有这种显著的选择性，探针 177 仍有一些局限性，如水溶性差和灵敏度低，需要 30% 的甲醇作为共溶剂，且当葡萄糖浓度为 0.1 M 时荧光响应值（F/F0）仅为 0.5。2006 年 Kubik 和 Heinrichs 等人的另一项研究报告了一种“开-关”型二硼酸探针 178（图 96），该探针具有环状四肽骨架。在 285 nm 的激发下，探针 178 在 480 nm 处产生发射峰，加入葡萄糖后该峰减少了 50%。D-葡萄糖的 Ka 值（24,800 ± 1200 M^-1）是 L-葡萄糖（11,900 ± 1600 M^-1）的两倍多，而与甘露糖和半乳糖的响应非常低。因此，探针 178 在葡萄糖识别方面具有高亲和力、选择性和对映选择性，可用作水溶液中的葡萄糖光学探针，尽管需要较高的 pH 值。这篇综述已经讨论了许多离子探针，这些探针通常基于吡啶，通常是为了提高溶解性、特定应用（例如在隐形眼镜中的使用）或特定靶向策略（例如靶向线粒体的三苯基膦基团）而设计的。然而，离子系统的电荷特性可以进一步被利用，例如 Singaram 和 Suri 等人在 2003 年设计的葡萄糖探针系统 179（图 96）。他们将双阳离子二硼酸 4,7-phenanthrolinium viologen 与羟基芘三磺酸三钠吡喃盐配对。这两种双阳离子和三阴离子物种的互补性质使得它们既能通过静电吸引也能通过电子转移进行作用，导致吡喃荧光团的淬灭，从而作为报告单元。当加入葡萄糖并发生结合时，这些静电相互作用被抑制，荧光发射得以恢复。由于两个组分的离子性质，该传感系统具有优异的水溶性，可以有效检测 0–20 mM 范围内的葡萄糖浓度。随后在 2007 年，同一团队使用类似的吡喃方法但不同的 viologen 同系物开发了探针 180（图 96）。他们观察到探针 180 对葡萄糖具有高结合亲和力（Kb = 1900 M^-1），葡萄糖/果糖的选择性比为 1.7。

双阳离子 viologen 还可以用来促进探针与带电表面的结合。Singaram 和 Cordes 等人在 2006 年合成了一种基于水溶性量子点（QDs）的葡萄糖选择性系统 181（图 96），其工作原理是基于阳离子吡啶通过极性表面基团（羧酸、胺）与 QDs 表面进行静电结合，从而淬灭 QDs 的固有荧光。在葡萄糖存在下，viologen 破坏剂与葡萄糖结合，导致复合物解离并释放荧光量子点。然后可以通过监测荧光强度的增加来定量检测葡萄糖浓度。同样，这种硼酸基团也可以用于制备 GQD 系统，如 Qiu 和 Li 等人在 2013 年使用的探针 182（图 96）所示。

存在大量二硼酸系统，因此现在将简要概述其中的一些机制和应用。2011 年，Tang 和 Liu 等人设计并合成了一种基于四苯乙烯（TPE）核心的二硼酸葡萄糖探针 183，该探针利用聚集诱导发射（AIE）效应（图 97）。在水溶液中，探针 183 的荧光因分子内旋转而淬灭。当加入葡萄糖时，探针 183 与葡萄糖形成 1:1 复合物，形成寡聚桥接结构，其中葡萄糖与硼酸结合。这抑制了 TPE 的旋转并触发了 AIE 效应，使荧光信号重新开启。由于果糖、半乳糖和甘露糖等糖类只有一个顺式二醇结构，只有葡萄糖能够形成大复合物，从而实现了出色的选择性。探针 183 对葡萄糖具有良好的选择性，并成功实现了人工尿液中葡萄糖的敏感检测。

探针 183 通过形成寡聚复合物来检测葡萄糖。2012 年，Jiang 和 Wu 等人开发了一种荧光超分子探针 184-γ-CyD（图 98），该探针结合了苯并二硼酸（STDBA）和 γ-环糊精（γ-CyD）以实现选择性葡萄糖识别。与果糖（Ka = 789 ± 47 M^-1）相比，探针 184-γ-CyD 对葡萄糖的结合亲和力更高（Ka = 1048 ± 64 M^-1）。在 1% DMSO 缓冲液（pH 10.5）中，加入葡萄糖后荧光显著增强，光谱带变窄，这可能是由于葡萄糖结合增强了荧光团在腔内的刚性。当加入果糖时，455 nm 处的荧光发射峰被淬灭，并且波长蓝移至 438 nm。这伴随着 CD 信号的变化，表明 STDBA 二聚体发生了解聚。葡萄糖结合的评估显示，探针 184-γ-CyD 在 0.1 mM 果糖、半乳糖或甘露糖存在下的相对误差低于 30%。此外，人工尿液中葡萄糖检测的偏差小于25%，这表明184-γ-CyD探针具有良好的选择性，并且能够在复杂系统中有效定量葡萄糖。图98。

探针184以及2:2 184-γ-CyD复合物与葡萄糖和果糖的相互作用。作为上述已经讨论过的19F NMR光谱探针同一家族的一部分，2015年Schiller和Axthelm等人设计并合成了含氟硼酸接头的联吡啶盐185a–c作为糖类探针（图96）。利用这些糖类探针，他们开发了一种方法，将他们与二醇分析物形成的19F NMR光谱转换为二维条形码，从而能够在生理水条件下（50 mM HEPES或磷酸盐缓冲液，10% D2O，pH 7.4）检测和识别九种含二醇的生物分析物，这一过程再次得益于它们的离子性质。由于硼酸/硼酸盐酯在NMR时间尺度上的缓慢平衡，每种分析物都会产生一组独特的19F信号，这些信号来源于所有平衡态物种的独特结构和分布。这些信号结合形成了一个“二维条形码”，使得无需多变量分析即可识别分析物。这种NMR指纹可以直观地区分大多数分析物，并且受益于19F NMR光谱学的通常优势：高分辨率、低/无背景信号、高灵敏度以及抗pH干扰性。2021年，Galan和Ramos-Soriano等人报告了一种基于振动诱导发射（VIE）的荧光探针186，用于通过荧光和视觉比色法检测葡萄糖（图99a）。当在350 nm处激发时，探针186在592 nm处显示出强烈的宽荧光峰，同时在大约432 nm处也有一个较小的荧光峰。当加入d-葡萄糖时，在452 nm处出现一个新的强荧光峰（图99b），而原来的592 nm信号减弱。同时，溶液的荧光光谱从橙红色（自由探针）变为亮蓝绿色（与葡萄糖配位的探针），这种变化肉眼可见。相比之下，果糖会淬灭探针186的荧光，而不会引起明显的颜色变化，这突显了其出色的选择性。同样，单个单糖的效果可以通过肉眼进行比色观察（图99）。

(a) 探针186的化学结构。(b) 随着d-葡萄糖量增加，探针186的荧光变化。(c) 在365 nm紫外线照射下，探针186在各种单糖存在下的荧光图像。改编自Wiley-VCH GmbH出版的参考文献224。

6.4. Shinkai型二硼酸探针

这一最后的部分将特别关注Shinkai型二硼酸探针，即那些基于Shinkai和James在1994年报道的蒽邻氨基甲基苯硼酸荧光探针132和133的探针（见上文）。这些早期的Shinkai型探针现在被广泛认为是基于硼酸的葡萄糖探针的起点，并且是硼酸葡萄糖探针研究史上的一个重要里程碑。通过将邻氨基 methylphenylboronic acid与各种荧光团结合，研究人员成功制备了一系列荧光“开启”探针。

1995年，Shinkai和James等人报道了一种糖类探针187，该探针具有由两个硼酸基团和两个冠醚基团组成的别构耦合系统（图100）。这种设计使得可以通过冠醚与金属离子的配位形成“三明治”结构，改变两个硼酸基团之间的距离来调节葡萄糖的结合和释放。当糖类和盐类一起溶解时，会发生别构耦合效应，这可以通过荧光强度的变化来监测。在锂（Li+）等阳离子存在下，两个冠醚都参与阳离子的配位，形成一个1:1的糖类：探针伪大环复合物。较大的阳离子如Na2+、K+和Sr2+会破坏1:1复合物的形成，导致探针187的荧光丧失。这种创新策略为特定糖类的分子探针设计提供了新的方法。2004年，James和Zhao等人报道了一种Shinkai型蒽二硼酸荧光探针188，其对酒石酸等糖酸具有改进的对映选择性和化学选择性。这种方法在每个烷基胺侧链引入了一个立体中心，利用这两个立体中心来更好地区分不同的糖类，并基于结合常数区分手性糖类。图100。

代表性的Shinkai型二硼酸探针示例。2002年，Wang和Karnati等人设计并合成了一系列含有两个蒽荧光团的二硼酸荧光探针189a–c（图100）。其中，探针189a对葡萄糖的选择性最高，其在1:1 MeOH/磷酸盐缓冲液中对葡萄糖、果糖和半乳糖的Ka值分别为1472、34和30 M?1，分别比果糖和半乳糖高出43倍和49倍的选择性。1H NMR研究显示，探针189a通过预期的双齿配位模式以1:1的化学计量比与α-d-葡萄糖呋喃糖结合。与之前类似探针189a–c的模块化合成和筛选一样，这进一步强调了两个硼酸识别基团之间的距离和角度的微妙变化的重要性，强调了这些系统可以针对选择性和灵敏度进行精细调整。为了进一步探索结构效应，2006年Wang和Kaur等人通过在para-硼酸位置引入氰基或硝基吸电子基团或氟原子，合成了相关的单硼酸190a–c和二硼酸191a–c（图100）。这项研究表明，单硼酸190a–c对果糖表现出显著的选择性，而二硼酸衍生物191a–c则对葡萄糖具有选择性。电子富集的191c对葡萄糖的结合最弱（Ka = 630 M?1），而电子贫乏的191a和191b的Ka值分别为2540 M?1和1808 M?1，显著高于原始化合物191d（Ka = 1472 M?1）。然而，探针191a–c的选择性相对于母体系统191d有所下降，这一趋势在单硼酸190a–c中也有观察到，清楚地说明了灵敏度和选择性之间的典型权衡。2010年，Takeuchi和Shibata等人开发了一种使用Shinkai报告的二硼酸探针192的可注射水凝胶微珠葡萄糖荧光传感器（图101a–d）。使用微流控技术生产了高度均匀且可重复的可注射微珠，实现了微创植入和经皮传输，无需外部电源或可植入电子设备或线路即可进行有效的血糖监测。这些基于二硼酸的微珠对葡萄糖表现出高灵敏度。通过将这些微珠植入小鼠的耳皮肤中，成功实现了连续的体内血糖监测（见上文）。结果表明，这些微珠能够动态监测从0到1000 mg dL?1（0–5.55 × 10?3 mol L?1）范围内的血糖浓度。随后，在2011年，Takeuchi和Heo等人发现，荧光水凝胶微珠在体内长期血糖监测中存在问题，包括容易从植入部位分散和难以清除，以及由于生物相容性差引起的炎症反应。为了解决这些问题，他们改进了聚合技术，并构建了一种使用PAM（聚丙烯酰胺）水凝胶与PEG（聚乙二醇）共轭的新型水凝胶纤维葡萄糖传感器（图101e）。这种新的葡萄糖传感器能够有效监测长达140天的血糖波动，显示出优越的稳定性和灵敏度。这些新型葡萄糖传感器实现了微创植入、长期稳定监测和易于清除，为长期血糖监测提供了新的方法。最近，在2025年，Ichiki等人进一步发展了这一概念，开发了一种在其尖端嵌入荧光硼酸功能化水凝胶的光学微针传感器。该设备可以采集亚纳升体积的间质液，实现了在生理相关浓度范围内的微创血糖测量。图101。

(a) 用于葡萄糖可逆识别的探针192。(b) 192微珠的荧光强度与测量血糖浓度随时间的变化。(c) 用于体内连续血糖监测的可注射荧光微珠的示意图。(d) 使用注射的192微珠进行的小鼠体内连续血糖监测。（e) 植入192纤维的小鼠耳朵：纤维在植入部位保持了一个月。图a–d：经Wiley-VCH GmbH许可改编。图e：经2011年美国国家科学院许可改编。这类二硼酸探针还应用于双分析物传感，例如对细胞代谢至关重要的葡萄糖和氧气。2013年，Meldrum和Zhang等人开发了一种双响应聚合物薄膜传感器193，用于检测葡萄糖和氧气（图102）。这种双响应传感器由三个部分组成：一个发出蓝光的葡萄糖探针193a（GS-COOH）；一个发出红光的氧气探针193b（OS）；以及一个对分析物无反应并发出黄光的内部参考探针Rhod-MA。所有三个部分都被整合到聚合物薄膜中，并沉积在经过TMSPA（三甲氧基硅基丙基甲基丙烯酸酯）处理的石英玻璃上。选择性测试表明，葡萄糖的选择性高于果糖、甘露糖或半乳糖。这种双响应传感器成功应用于细菌细胞（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、小鼠巨噬细胞J774以及人类宫颈癌HeLa细胞中葡萄糖和氧气消耗的敏感检测。图102。

(a) 探针193的组成：探针193a（葡萄糖探针），193b（氧气探针），Rhod-MA（内置内部参考）。(b)–(e) 双探针193对葡萄糖(b)和氧气(c)及(d)和(e)的响应。(b)：对葡萄糖的荧光响应；(c)：使用445 nm和580 nm处荧光信号的比例进行葡萄糖的比率荧光变化；(d)：对氧气的荧光响应；(e)：使用580 nm和650 nm处荧光信号的比例进行氧气的比率荧光变化。经2013年Elsevier Ltd.许可改编。此后，2014年Meldrum和Tian等人设计了一种基于聚合物的传感器194（G-PS），用于细胞内葡萄糖监测（图103）。该传感器使用聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)（PHPMA）作为生物相容性聚合物基质，并包含少量的聚([2-(甲基丙烯酰氧)乙基]三甲铵氯化物)（PMAETMA）以确保细胞渗透性。作为单体，葡萄糖探针194a（GS-MA）可以很容易地与HPMA和MAETMA共聚。为了减轻复杂细胞环境对测量的影响，将基于罗丹明的非响应葡萄糖探针Rhod-MA集成到聚合物传感器中，以产生比率传感器194。在PBS中，194在445 nm处的蓝光荧光随着葡萄糖浓度的增加而增强，在50 mM葡萄糖浓度下增强了4.5倍。通过比较葡萄糖探针和罗丹明的荧光（分别为445 nm的蓝光和580 nm的红光），可以更准确地测量葡萄糖浓度的变化，从而提高了探针在实际应用中的准确性和可靠性。HeLa细胞被用作测试环境，细胞内葡萄糖浓度在5分钟内与高浓度的细胞外葡萄糖（25 mM）达到平衡，但在正常浓度（10 mM）下需要30分钟才能达到平衡，表明传感器194能够有效测量细胞内葡萄糖浓度的动态变化，尽管速度相对较慢。图103。

(a) 葡萄糖探针194的合成。(b) 探针194在PBS缓冲液中对葡萄糖的荧光响应。(c) 葡萄糖浓度函数下的荧光强度比变化。(d) 使用探针194测量细胞内葡萄糖浓度。(e) 和(f) HeLa细胞中探针194的细胞图像。(e) 显示在405 nm处激发的葡萄糖探针荧光的蓝通道。(f) 显示在561 nm处激发的罗丹明内部参考荧光的红通道;(g) (e) 和(f) 与明场图像的叠加。改编自皇家化学会发表的参考文献238。在此基础上，同一组(Tian等人)在2022年报道了一种可穿戴荧光智能隐形眼镜，用于实时检测泪液中的葡萄糖，这代表了从细胞内传感到经皮/眼部可穿戴传感的范式转变。这种智能隐形眼镜传感器通过将两种关键组件——一种经过硼酸改性的超灵敏葡萄糖探针195（GS-NHS）和一种基于罗丹明的参考探针RDMA——移植到聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸)（PHEMA）水凝胶网络中制成。选择PHEMA水凝胶作为隐形眼镜材料是因为其柔软、透明的特性和高的含水量确保了长时间佩戴时的舒适性，并促进了泪液中的葡萄糖快速扩散到固定的探针上。葡萄糖与195中的硼酸部分的结合抑制了“松散螺栓效应”，即荧光团的旋转能量损失机制。这种抑制作用导致440纳米处的蓝色荧光发射呈现出浓度依赖性的增加。同时，参考探针RDMA在595纳米处发出稳定的红色荧光，且这种发射不受葡萄糖或眼泪成分（例如Na+、K+、白蛋白）的影响。这种比率测量设计实现了低检测限，荧光光谱法为9.3微摩尔，基于智能手机的分析方法为23微摩尔，并且其线性响应范围为0.1-1毫摩尔，这与人体眼泪中葡萄糖的生理浓度完美匹配。通过便携式紫外LED（发光二极管）的照明，可以使用智能手机捕捉到隐形眼镜的荧光图像，并通过分析蓝光与红光（B/R）的RGB强度比来确定葡萄糖浓度。在新西兰白兔体内的验证证实了该传感器的生物相容性（佩戴7天后未观察到眼睛刺激）和可靠性：B/R比率的变化与商用血糖仪测量的血糖水平变化相一致。图104。

(a) 用于检测葡萄糖的智能隐形眼镜的组成部件。HEMA水凝胶网络包含一个高灵敏度的葡萄糖探针195和一个用于校准的参考探针。(b) 佩戴在人造眼睛上的隐形眼镜的照片及其在不同葡萄糖浓度的人造眼泪中的荧光图像。(c) 通过智能手机监测葡萄糖的智能隐形眼镜的示意图。(d) 和 (e) 佩戴智能隐形眼镜的兔子图像：(d) 无紫外LED照明；(e) 有紫外LED照明。(f) 对兔子隐形眼镜进行时间依赖性荧光分析，以及通过商用血糖仪测量的相应血糖水平。经参考文献239许可改编。版权所有（2022）Elsevier B.V. 2014年，DeHennis和Tian等人开发了一种无线皮下植入式葡萄糖传感器，该传感器使用Shinkai衍生的196作为葡萄糖探针，并结合可穿戴传感器，形成了一个新型的连续葡萄糖监测系统（图105）。2014年，DeHennis和Tian等人开发了一种无线皮下植入式葡萄糖传感器，该传感器使用Shinkai衍生的196作为葡萄糖探针，并结合可穿戴传感器，形成了一个新型的连续葡萄糖监测系统（图105）。二硼酸探针196被涂覆在一个微型光学检测系统上，该系统通过无线通信连接到外部发射器，外部发射器再通过蓝牙连接到智能手机应用程序，从而实现连续葡萄糖监测（CGM）。测试表明，该系统的准确性可与传统的静脉血糖测量方法相媲美。初步的临床研究表明，在12名1型糖尿病患者中，这种传感器的血糖测量准确性与现有的商用CGM设备相当。图105。

(a) 可植入式葡萄糖传感器的照片。(b) 扫描电子显微镜（SEM）图像，显示了嫁接在PMMA传感器外壳外的葡萄糖指示剂水凝胶。(c) 葡萄糖结合探针196。(d) 连续葡萄糖监测系统的组成部分。经参考文献240许可改编。版权所有（2014）Elsevier B.V. 随着这一发展，几家公司致力于将基于共聚物的二硼酸CGM传感器商业化，最终推出了Eversense CGM。2019年，对Eversense CGM进行了为期90天的人体研究，证明了该设备的安全性和有效性，使其获得了欧洲和南非的CE标志批准，并在2018年获得了美国FDA的批准。在这些试验中，紧凑型传感器被植入上臂的皮下组织中，而不是手腕，从而提高了患者的舒适度，并允许可拆卸的接收器/电源佩戴在手臂上。此外，PRECISE和PROMISE试验评估了Eversense CGM系统在180天（6个月）期间的性能。与之前的研究结果一致，该设备被证明是安全且有效的，只有少数传感器需要在180天期满前更换，这一情况通过传感器与智能手机应用程序的警报来提示。最新的365天长期CGM系统已在美国向消费者提供。2022年，Eversense E3 180天传感器获得了欧洲的CE标志认证和FDA的批准。在其临床成功之后，Eversense系统成为第一个通过FDA De Novo途径获得FDA批准作为集成连续葡萄糖监测系统（iCGM）的长期CGM。与胰岛素泵集成后，iCGM系统使用算法来预测和应对低血糖和高血糖事件及趋势，而无需患者干预。2017年，Yang和Tang等人开发了一种新型的非侵入性、高选择性的纳米传感器，该传感器结合了原始的Shinkai探针133，成功地实现了对细胞内葡萄糖的敏感检测。这种纳米传感器利用脂质体封装了适配体功能化的金纳米颗粒（AuNPs）、Shinkai探针133以及与AuNPs结合的罗丹明染料标记的互补寡核苷酸。当这种纳米传感器进入细胞后，探针197被葡萄糖结合，引发纳米传感器的构象变化。这种构象变化触发罗丹明标记的寡核苷酸从金纳米颗粒中释放。由于罗丹明染料不再受到金纳米颗粒的淬灭作用，荧光信号得以恢复，从而动态反映了葡萄糖浓度的变化。通过将葡萄糖特异性探针133与核酸识别机制相结合，这种纳米传感器实现了对细胞内葡萄糖的高选择性。然而，该方法需要使用十六烷基三甲基溴化物作为细胞膜渗透剂来促进纳米探针进入细胞，这可能会干扰细胞的葡萄糖代谢，限制了纳米传感器准确反映细胞内葡萄糖波动的能力。图106。

(a) 基于金纳米颗粒功能化的适配体和Shinkai探针133包封的脂质体的细胞内葡萄糖监测示意图。(b) 在正常氧条件下（0、4、8、12和24小时），197对HeLa细胞内葡萄糖消耗的动态检测。(c) 在不同氧浓度（20%、10%、5%、1% O2）下以及添加2-DG（5 mM）后，HeLa细胞中的葡萄糖荧光图像。经参考文献248许可改编。版权所有（2017）美国化学学会。2019年，Bazan和Wang等人开发了一种基于Shinkai探针衍生物198 DBA2+的电化学葡萄糖传感器，该传感器对葡萄糖具有高亲和力（Kd ≈ 1 mM）和优异的选择性。探针198包含两个邻氨基甲基苯硼酸基团，这一设计为保持葡萄糖选择性提供了化学基础。在磷酸盐缓冲液中，葡萄糖与198反应，将探针的pKa从9.4降低到6.3，从而引发探针的脱质子化，释放的质子被HPO42?中和。当存在葡萄糖时，系统中的198和HPO42?（离子导电性较高，左侧，红色）转化为198/葡萄糖复合物（DBA-G）和HPO4?（离子导电性较低，右侧，蓝色），198的质子释放率与葡萄糖浓度（0–30 mM）呈良好的线性关系。此外，这种电化学传感器在检测葡萄糖时不会干扰其他糖类（如麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖和半乳糖），表明该电化学传感器在葡萄糖定量检测方面具有良好的应用前景。图107。

(a) PBS缓冲溶液中198 DBA2+与葡萄糖结合反应的示意图。(b) 和 (c) 随着连续添加0.5 M或2 M葡萄糖浓度（b），或添加等体积水作为对照（c），1毫升测试溶液的电阻（R）的变化。经参考文献249许可改编。版权所有（2019）Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。2019年，Tian和Deng等人基于三色核壳聚合物开发了对该葡萄糖和氧气具有双重响应性的比率测量纳米传感器199。纳米传感器199是通过将红色发光的氧探针199a（OS1）和黄色发光的参考探针RDMA共价嵌入到疏水核心中，并将蓝色发光的葡萄糖探针195 GS-NHS共价嫁接到亲水壳层中构建的。传感器199可以同时灵敏地检测0.01到5.0 mM范围内的葡萄糖和0.05–39.3 mg L?1范围内的溶解氧。用纳米传感器199染色的HeLa细胞在添加葡萄糖时显示蓝色荧光增加，在氧气减少时显示红色荧光增加，同时保持恒定的黄色荧光，从而允许进行比率测量解释。这项研究中开发的比率测量发光纳米传感器199可以同时监测细胞内葡萄糖和氧气浓度，具有良好的细胞渗透性和低细胞毒性，是细胞成像和实时动态监测的理想工具。图108。

(a) 聚合物比率测量纳米传感器199的组成和合成。(b) 用纳米传感器199（0.5 mg mL?1）培养24小时的HeLa细胞的共聚焦荧光图像（λex = 405 nm）。(c) 共聚焦图像的合并图像。蓝色通道/黄色通道（d）和红色通道/黄色通道（e）的比值。经参考文献250许可改编。版权所有（2019）Elsevier B.V. 2021年，Meng和Wang等人通过在Shinkai探针133的苯硼酸的对位引入氟、氯、甲氧基或氰基取代基，合成了苯硼酸修饰的二硼酸探针200a–d。与Wang和Kaur的先前工作一致，电子贫瘠的氰基取代探针200d在33% MeOH中展现出最高的葡萄糖结合亲和力（6489.5 M?1）。更重要的是，它具有良好的水溶性、超灵敏的葡萄糖识别能力，检测限为1.51 μM，并且在pH范围6.0–9.0内具有稳定性和灵敏的荧光响应。由于这些特性，探针200d成功用于细胞裂解液和血浆样本中的葡萄糖检测。2023年，James和Wang等人通过在200d的蒽上引入羧酸酯和甲酸酯取代基，合成了蒽修饰的二硼酸探针201a–b。201a（CO2Me衍生物）对葡萄糖表现出高敏感性（F/F0 = 47.8，LOD = 1.37 μM），而探针201b显示出高葡萄糖亲和力（Ka = 4.5 × 103 M?1）。探针201a成功用于区分正常细胞和肿瘤细胞中的葡萄糖异质性。此外，探针201a和201b还有效地用于斑马鱼幼体的葡萄糖荧光成像。这项研究为设计高效的基于硼酸的葡萄糖探针提供了新的策略，并为葡萄糖相关疾病的诊断和治疗提供了可靠的检测工具。图109。

(a) 苯硼酸修饰的探针200a–d和蒽修饰的二硼酸探针201a–b的结构。(b) 和 (c) 在不含葡萄糖的DMEM中预培养0、4、8、12和24小时的HeLa细胞的共聚焦显微镜图像（b），然后与50 μM 201a共培养30分钟。(d) 探针201a区分Caco-2细胞和FHC细胞的流式图像。(e) 探针201a区分HepG2细胞和L-02细胞的流式图像。(f) 和 (g) 在空白培养基和20 μM ampkinone培养基中预培养4小时的7 dpf斑马鱼胚胎的荧光共聚焦图像（f）和荧光强度（g），然后进一步与50 μM 201a共培养1小时。经美国化学学会发表的参考文献252改编。基于硼酸的探针明显优于本文第2-5节讨论的其他类型探针（表6）。一个关键特点是其可逆的识别机制：它们与葡萄糖的顺式二醇形成可逆的共价硼酸酯，不产生副产品。由于其性质，它们可以很容易地结构修饰以控制波长、溶解度、荧光机制，或与其他功能基团（如荧光团、纳米材料和聚合物）结合，从而构建多种检测平台。这些探针具有广泛的应用性，可检测生理范围内的葡萄糖浓度，并便于在各种样本中检测，包括血清、间质液和细胞内液。此外，它们表现出优异的稳定性：化学稳定，在储存过程中不易降解，某些探针（例如PEG键合的聚丙烯酰胺水凝胶纤维）可以在生理温度下在体内稳定运行长达140天（更长期的试验正在进行中），在长期应用中优于酶基探针。表6

代表性硼酸基探针的关键特性

| 探针 | λex/λem | 葡萄糖结合常数（Ka） | 特性 | 检测系统 |
|----------------|------------------|------------------|------------------|--------------------------------------|
| 131 | —/416 nm | — | 配位增强淬灭（CHEQ） | 20 mM磷酸盐缓冲液（1% DMSO，pH = 7.4） |
| 132 | 370/420 nm | — | 光诱导电子转移（PeT）+ 松动螺栓内部转换 | 0.05 mol dm?3 NaCl水溶液 |
| 133 | 370/423 nm | 3981 M?1 | 选择性顺序：d-葡萄糖 > d-阿洛糖 > d-果糖 ≈ d-半乳糖 > 乙二醇 | 33.3% MeOH/H2O缓冲液（pH = 7.77），生理葡萄糖水平检测 |
| 134 | 348/416 nm | — | 选择性顺序：儿茶酚 > 多巴胺 ≈ l-DOPA > 葡萄糖 > 酚 | 20 mM磷酸盐缓冲液（pH = 7.4），1% v/v DMSO，儿茶酚/儿茶酚胺化学传感 |
| 135 | 417/605 nm | — | “开-关”型PeT传感器 | 水 + MeOH（1：1 v/v），pH = 10.0 |
| 136 | —/— | 70.8 M?1 | 选择性顺序：d-果糖 > d-葡萄糖 > 乙二醇 | MeOH–H2O（1：2 w/w）含0.05 mol dm?3 NaCl（pH 11.32），视觉检测 |
| 137 | 370/420 nm | 70 ± 7 M?1 | 选择性顺序：d-果糖 > d-甘露糖 > d-葡萄糖 > d-半乳糖 | THF/H2O（1：1 v/v）含0.033 M磷酸盐缓冲液（pH = 7.3），果糖选择性检测 |
| 138 | 370/420 nm | 130 ± 2.8 M?1 | 选择性顺序：d-葡萄糖 > d-甘露糖 > d-果糖 > d-半乳糖 | THF/H2O（1：1 v/v）含0.033 M磷酸盐缓冲液（pH = 7.3） |
| 139 | —/— | — | 检测范围 ≥0.4 mM，完全可逆 | 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4/8/9） |
| 140 | —/— | — | 完全可逆，生理pH兼容 | PBS缓冲液（pH 7.4），泪液 |
| 141 | —/— | — | 线性范围0–23 mM，葡萄糖选择性，乳酸干扰可忽略，pH稳定 | PBS缓冲液（pH 6–7），人工泪液 |
| 142 | —/— | 370 M?1（阴离子硼酸形式） | 葡萄糖选择性，LOD 10 μM | 人工泪液（pH 7.4） |
| 143 | —/— | 284 M?1（阴离子硼酸形式） | 葡萄糖选择性，LOD 1 μM | 人工泪液（pH 7.4） |
| 144a | 345/457 nm | 20.2 M?1 | 葡萄糖响应性，pKa = 6.62（与葡萄糖 ??） | 磷酸盐缓冲液（pH 7.5），模拟泪液环境 |
| 144b | 345/457 nm | 1.0 M?1 | 葡萄糖响应性，pKa = 6.90（与葡萄糖 ??） | 磷酸盐缓冲液（pH 7.5），模拟泪液环境 |
| 144c | 345/457 nm | 2.3 M?1 | 优先识别果糖但响应葡萄糖，pKa = 6.90（与葡萄糖 ??） | 磷酸盐缓冲液（pH 7.5），模拟泪液环境 |
| 145 | 420/512 nm | — | 线性范围0–50 equiv.葡萄糖 | DMSO |
| 146 | 463/616 nm | 15 M?1 | 检测范围0–300 mmol L?1，LOD 1.0 mmol L?1 | 50 mmol L?1磷酸盐缓冲液（pH 7.4） |
| 147 | 366/500 nm | 1.67 M?1 | 检测范围0–1.0 M，λex/λem：780 nm/500–620 nm（双光子） | 30 mM PBS缓冲液（pH 7.4），活细胞，深层组织 |
| 148 | 328/390, 510 nm | 1378 M?1 | 选择性顺序：d-葡萄糖 > d-果糖 > d-甘露糖 > d-半乳糖，LOD 10 μM | 0.1 M碳酸盐缓冲液（pH 10.0）含2%（v/v）甲醇 |
| 149 | 358/418 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围0.003–3.0 mM | 20 mM NH3–NH4Cl缓冲液，人血清 |
| 150 | 360/425 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围0–20 mM，LOD 10 μM，低细胞毒性 | PBS缓冲液（pH 7.4），人工泪液，HepG2细胞，小鼠 |
| 151 | — | — | 葡萄糖选择性，线性范围10 μM–40 mM，LOD ～5 μM，pH稳定 | PBS缓冲液，泪液，汗液，唾液模拟 |
| 152 | 532 nm（激光源）/— | — | 葡萄糖选择性，线性范围1.0–12.0 mM | PBS缓冲液，明胶幻影组织，猪组织（体外） |
| 153 | —/585–609 nm | 葡萄糖选择性，线性范围0.4–20.0 mM，LOD 50 μM | 水介质（pH 7.4），小鼠黑色素瘤B16F10细胞 |
| 154 | 290/370 nm | ------------------- | 葡萄糖选择性，线性范围0.1–10 mM，LOD 5.0 μM | 水溶液（生理pH），大鼠纹状体微透析液 |
| 155 | 330/530,660 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围0.1–2.0 mM，LOD 4.5 μM，pH稳定 | 0.1 M PBS缓冲液（pH 7.4），肉眼可见葡萄糖检测，人血清样本 |
| 156 | 785/1000–1150 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围5–30 mM，非光漂白，近红外荧光 | 2%胆酸钠水悬浮液（pH 6–9，生理范围） |
| 157 | 可见光/532–655 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围0–20 mM，肉眼可见，PBS中分散性好 | PBS缓冲液（pH = 8.0，离子强度150 mM） |
| 158 | 980/473,520 nm | — | 葡萄糖选择性，线性范围0–30 mM，可回收，深层组织穿透，生物相容 | 水溶液，HEK293细胞 + RIN-m5F细胞，糖尿病小鼠 |
| 159 | —/— | 1.18 × 103 M?1 | 葡萄糖选择性，共价分子印迹 + 硼酸酯形成，pH稳定 | d-醛糖在水介质中的识别，模仿天然凝集素-糖结合 |
| 160 | —/— | — | 葡萄糖选择性，线性范围0.30–10.0 mM，pH可控捕获/释放 | 磷酸盐缓冲液（pH 4.0–6.0），大鼠脑微透析液 |
| 161 | —/— | 132 ± 33 M?1 | 葡萄糖选择性，LOD 1 mM，独特的19F NMR指纹，pH稳定 | 100 mM HEPES缓冲液（pH 7.4，合成尿液（30 mM HEPES） |
| 162 | 415/632 nm | — | 选择性顺序：d-果糖 > d-阿拉伯糖 > d-甘露糖 ≈ d-葡萄糖 | DMSO-水（1：30）缓冲液（pH 10.5） |
| 163 | 289/358 nm | 2000 M?1（d-葡萄糖），1260 M?1（l-葡萄糖） | d/l-单糖的手性识别 | 33.3% MeOH/H2O，pH 7.77，手性混合物中的鉴别 |
| 164 | 273/365 nm | 91.2 M?1 | 葡萄糖检测范围1.0–100 mM | 33% MeOH/水缓冲液（pH 7.77） |
| 164 | 296/347 nm | — | 对“小”糖类的高选择性 | H2O-MeOH（300：1 v/v），pH 8.0 |
| 166 | 377/427 nm | 2512 M?1 | 葡萄糖选择性，水溶性，热稳定 | 0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4） |
| 167 | 274/404 → 362 nm | 186 M?1 | 选择性顺序：d-果糖 > d-半乳糖 > d-葡萄糖 | 52.1 wt% MeOH-磷酸盐缓冲液（pH 8.21） |
| 168 | 265/405 → 360 nm | 140 ± 13 M?1 | 选择性顺序：d-葡萄糖 > d-果糖 > d-半乳糖 | 52.1 wt% MeOH-PBS（pH 8.21） |
| 170 | 343/378 nm | — | 6-碳间隔：葡萄糖选择性，间隔长度依赖性特异性 | 33%（v/v）甲醇：水（pH 7.77） |
| 171 | —/397 nm | 962 ± 70 M?1 | 葡萄糖选择性 | 52.1 wt% MeOH/PBS（pH 8.21） |
| 174 | 342/377, 470 nm | 2660 ± 200 M?1 | 双信号调制（PeT + 发光体） | 52.1 wt% MeOH-磷酸盐缓冲液，pH 8.21 |
| 175c | —/— | 6.19 × 103 ± 731 M?1 | 葡萄糖选择性 | pH 8.21 PBS缓冲液 + 20% DMSO |
| 176 | 330/432 nm | — | 葡萄糖选择性（荧光“开-关” | 甲醇缓冲液（pH 8.21） |
| 177 | 375/447 nm | 4.0 × 104 M?1 | d-吡喃糖选择性 | 30% MeOH-PBS（pH 7.5） |
| 178 | 285/480 nm | 24800 M?1（d-葡萄糖） | Ka = 11900 M?1（l-葡萄糖），对映选择性 | 水/甲醇（1：1，v/v），pH = 11.7 |
| 179 | 470/510 nm | 1800 ± 200 M?1 | 电荷调控淬灭/恢复 | PBS（pH 7.4） |
| 180 | 460/510 nm | 1900 ± 200 M?1 | 葡萄糖选择性（glu/fru = 1.7，glu/gal = 11） | PBS（pH 7.4） |
| 181 | 460/604 nm | — | 葡萄糖选择性（特定于葡萄糖的淬灭/恢复） | PBS（pH 7.4） |
| 182 | 310/445 nm | | 线性范围0–60 mM，GQDs特性 | PBS（pH 7.4） |
| 183 | 365/485 nm | — | 葡萄糖特异性（促进寡聚化），AIE活性 | 2 vol% DMSO/碳酸盐缓冲液（pH 10.5），人工尿液 |
| 184 | 376/448 nm | 1048 ± 64 M?1 | 葡萄糖选择性，超分子荧光集合体 | 1 vol% DMSO/水缓冲液（pH 10.5） |
| 185a | — | 45 M?1 | 基于19F NMR的传感器，LOD 200 μM | 50 mM磷酸盐/HEPES缓冲液 |
| 186 | 350/592 → 452 nm | 816 M?1 | 振动诱导发射（VIE），LOD 9.4 μM | 80% MeOH/10 mM PBS（pH 7.4） |
| 187 | 370/423 nm | 53.7 M?1 | 从二硼酸“裂隙”设计继承的葡萄糖选择性 | 33.3% MeOH-H2O（pH7.77） |
| 188 | 365/429 nm | 28.2 M?1 | 对糖酸的高对映选择性（高达550：1） | 52.1% MeOH/水，0.05 M NaCl缓冲液 |
| 189a | 370/423 nm | 1472 M?1 | 高葡萄糖选择性（果糖：43倍，半乳糖：49倍） | 50% MeOH/0.1 M磷酸盐缓冲液 |
| 190a | 370/423 nm | 101 ± 5.2 M?1 | 优先识别果糖，果糖/葡萄糖选择性13倍 | 50% MeOH/磷酸盐缓冲液（pH7.4） |
| 191a | 370/423 nm | 2540 ± 90.1 M?1 | 对果糖的选择性3倍，荧光增强10倍 | 50% MeOH/磷酸盐缓冲液（pH7.4） |
| 192 | 405/450 nm | — | 葡萄糖选择性，PEG修饰以提高生物相容性 | 通过小鼠耳朵的皮下注射实现最小侵入性体内连续血糖监测 |
| 193 | 390/445利用与葡萄糖顺式二醇的可逆共价结合，这些系统实现了无副产物的传感和卓越的结构适应性，能够与荧光团、聚合物和纳米材料集成，适用于光学、电化学和基于光纤的平台。其耐用性得到了证明：PEG链接的水凝胶纤维在体内可运行140天，而Eversense连续葡萄糖监测系统也展示了成功的临床转化，提供了长期可植入的传感（迄今为止的使用寿命超过1年）。尽管存在一些限制，如pH值依赖性、疏水性荧光团以及与其他顺式二醇生物分析物的潜在交叉反应性，但基于硼酸的设计结合了稳定性、适应性和下一代葡萄糖监测的强大潜力。总体而言，这些进展为开发高亲和力和生物相容性的非酶促、可逆识别系统指明了明确的方向。特别是基于硼酸的探针，似乎将主导未来的发展，架起基础创新与实际临床应用之间的桥梁。鉴于近年来葡萄糖探针在生物成像应用中取得的显著进展，我们希望以强调几个仍需迫切进一步研究的重点领域来结束这篇综述。

7.1 葡萄糖传感研究的未来

信号分子监测已成为信号转导领域的研究热点之一。其中，Ca2+作为一种成熟的第二信使，是细胞内最保守且普遍存在的信号分子之一。钙信号的生成和终止源于细胞内钙离子浓度的时空动态波动，由此产生了两种典型的现象：钙振荡和钙波。关于细胞内葡萄糖传感的实验研究表明，细胞内葡萄糖水平也经历了类似钙信号的振荡波动。越来越多的证据表明，葡萄糖具有“信使”分子的特性。它不仅与Ca2+和ROS等信号的生成密切相关，还参与调节各种代谢相关蛋白质功能的信号转导过程。然而，目前对细胞内葡萄糖的实时和动态检测的研究仍处于初级阶段。不同类型探针在检测细胞内葡萄糖动态时的准确性和灵敏度仍不清楚，需要进一步研究。随着糖尿病、癌症和神经性疾病等重大健康问题对全球造成的日益严重威胁——这些问题都表现出葡萄糖代谢和功能的显著异常——在复杂的生物环境中实现葡萄糖的特异性识别已成为一个核心挑战。直到最近，关于细胞内葡萄糖传感的研究仍然相当有限。此外，关于血糖波动对其他信号分子影响的研究也较少。特别是，实现高时空分辨率的动态检测对于阐明葡萄糖作为信号分子的传感机制、信号转导途径和生物功能至关重要。高效葡萄糖探针的发展和应用有望揭示与疾病相关的葡萄糖异常的功能角色和调节机制。如果能够阐明细胞间的完整通信机制，将为解决由细胞信号转导障碍引起的一系列严重人类疾病（如糖尿病、癌症和精神疾病）提供新的见解和策略。

7.2 葡萄糖探针研究的未来

对于葡萄糖示踪探针的未来发展，应优先考虑非干扰性探针作为关键目标，重点设计能够完全模拟内源性葡萄糖代谢的示踪剂。这样的示踪剂应避免干扰糖酵解或改变细胞生理状态，从而能够准确追踪生物系统中的葡萄糖摄取和动态变化。通过密切模仿自然代谢过程，这些工具可以更准确地了解细胞和组织层面的葡萄糖利用和调节情况。同时，开发可逆识别机制对于克服“代谢捕获”的限制至关重要。基于葡萄糖与葡萄糖结合蛋白ConA和硼酸的可逆结合开发的探针可以实时响应葡萄糖浓度的变化，实现对波动的动态监测而不仅仅是静态捕捉。这种可逆性对于理解快速代谢变化（如对激素信号或环境刺激的反应）至关重要。基于硼酸的荧光探针代表了葡萄糖识别研究中快速发展的领域。在本节中，我们概述了一系列影响大多数基于硼酸的荧光探针性能和实用性的常见挑战。到目前为止，大多数基于硼酸的葡萄糖荧光探针的发射波长较短，这通常导致信噪比较低，从而影响了获取数据的可靠性和精确性。因此，设计和开发基于近红外（NIR）的硼酸探针是推进荧光成像技术的关键方向。除了发展NIR探针外，开发比率计型硼酸荧光探针同样重要，因为这些系统通过内部信号校准机制能够在生物医学环境中实现更准确和定量的检测。在构建高性能的基于硼酸的荧光探针时，必须仔细考虑和优化几个关键参数，包括水溶性、荧光量子产率（QY）、光稳定性、细胞毒性和细胞通透性。

7.3 多模态检测系统

尽管在过去十年中葡萄糖探针的设计和应用取得了相当大的进展，但依赖单一检测模式的主要缺点是其无法全面捕捉多维的生物信息。在这种情况下，整合多种葡萄糖检测技术受到了越来越多的关注，因为这可以降低误诊的风险并最小化关键数据的丢失。正如本综述所总结的，已经采用了多种策略来检测活体系统中的葡萄糖波动，包括基于葡萄糖类似物的示踪剂、基于酶的探针、基于荧光蛋白的探针、基于凝集素的传感器以及其他探针。因此，在生物葡萄糖检测中，发展多模态葡萄糖检测技术对于有效评估不同葡萄糖检测方法的准确性和灵敏度至关重要。促进多模态技术与智能设备的整合是另一个重要方向。通过智能设备结合荧光-电化学或MRI-光学多模态方法，可以同时获取代谢和解剖学信息，从而更全面地理解与葡萄糖相关的生物过程。此外，集成人工智能算法的便携设备（如智能手机集成传感器）能够实现实时数据分析，提高葡萄糖检测的实用性和效率。在未来的研究中，整合多模态葡萄糖检测数据将提供对活细胞和整个生物体中葡萄糖动态变化的更全面和准确的见解。

7.4 多通道检测系统

由于生物系统的复杂性和高度动态性，静态的单信号获取方法不足以捕捉所有生理和病理变化。强健的检测系统具有同时监测单个生物样本中多种分析物的出色能力。这种多重检测方法对于显著增强我们对复杂生物现象的理解具有巨大潜力，因为通常多种分子共同作用以触发特定的生理或病理反应。这种多重方法可以深入了解细胞信号级联的时空协调，从而推进我们对生物复杂性和疾病发病机制的理解。通过监测葡萄糖以及多种信号分子或生理代谢参数的信息，我们可以获取细胞内的动态和多源代谢参数。例如，未来可以开发出能够同时监测葡萄糖和其他关键信号分子（如Ca2+、ROS等）的多通道荧光平台。随后，这种多目标分子监测方法将为研究细胞葡萄糖稳态的调节机制、葡萄糖与信号分子之间的相互作用及其时空演变模式提供全面的信息。这将有助于深入分析细胞能量代谢网络中的动态相关性，并最终为代谢性疾病的发病机制提供新的见解。

7.5 体内细胞成像和检测

体内细胞成像和检测是一种新兴的生物光子成像技术，能够实现对活体小动物中细胞靶分子的非侵入性、实时和动态监测。体内细胞成像在活体动物中的关键优势包括：(1) 反映真实的生理状态：可以在动物自由移动并保持接近自然生理条件的情况下进行监测。这避免了体外实验中通常引入的行为和功能变化，因为在体外实验中细胞被从其自然环境中移除。(2) 长期动态监测：该方法能够持续纵向观察同一动物，从而可以追踪细胞的发育、分化、迁移以及疾病的发展或治疗反应等过程。(3) 减少个体间差异：在同一个体内重复成像可以减少由个体动物差异引起的变异性，从而提高实验数据的可靠性和可比性。为了全面理解葡萄糖代谢的异质性，需要开发具有单细胞和亚细胞分辨率的高分辨率成像系统。在超分辨率细胞成像领域，目前广泛采用了几种先进技术，包括 Stimulated Emission Depletion (STED)、Structured Illumination Microscopy (SIM) 和 Photo-Activated Localization Microscopy/STORM (PALM/STORM)。这些成像方式克服了光的衍射限制，允许在纳米尺度上可视化细胞结构和分子事件。通过将超分辨率成像与体内光学成像方法相结合，研究人员可以更深入和准确地了解清醒动物在生理条件下的细胞内分子和细胞结构的行为。例如，未来可以将高分辨率的细胞内葡萄糖动态成像与系统葡萄糖水平的监测相结合，以研究细胞葡萄糖稳态与系统葡萄糖控制之间的调节机制。这些创新有望为这些疾病的精确诊断和靶向治疗提供坚实的理论框架。葡萄糖探针在细胞研究和体内应用中已被证明非常有效，已有几种探针成功应用于疾病模型中，揭示了葡萄糖稳态与病理之间的关键联系。本综述清晰地概述了当前的探针技术和塑造其发展的设计原则。通过强调这些进展，我们旨在加深对健康和疾病中葡萄糖调节的理解，同时推动传感平台的创新。这样的进展为临床研究、分子成像和治疗发现带来了希望。展望未来，突破性进展将需要化学生物学、生物分析和医学科学之间的跨学科合作和资源共享。我们希望这份综述能够成为这些努力的催化剂，激发下一代葡萄糖传感工具的开发，并加速它们转化为有影响力的应用。

利益冲突

声明没有利益冲突。缩写符号

AAPBA 3-丙烯酰胺苯硼酸
AD 阿尔茨海默病
ADP 腺苷二磷酸
AEQ 藻红蛋白
AFM 原子力显微镜
AIE 聚集诱导发光
AMP 腺苷一磷酸
AMPK AMP激活的蛋白激酶
APBA 3-氨基苯硼酸
APS 氨丙基硅烷
ATP 腺苷三磷酸
BA 硼酸
BINOL 1,1′-联-2-萘酚
BPmoc p-硼苯甲磺酰基
C–D 碳-氘
CDP-DAG 胞苷二磷酸二酰甘油
CE 毛细管电泳
CFP 蓝色荧光蛋白
CGM 持续葡萄糖监测
CH–π 碳-氢··π键
CHEQ 螯合增强猝灭
Chol 胆固醇
ChOx 胆固醇氧化酶
CLP 盒装荧光素三芳基膦酯
CoA 辅酶A
ConA 葛根宁A
cpYFP 环状置换黄色荧光蛋白
CQDs 碳量子点
CS 凝胶多糖
CT 计算机断层扫描
CTP 胞苷三磷酸
Cy3 花青素3
Cy5.5 花青素5.5
CyNA 苯甲基化三羧花青素染料
DAP 2,3-二氨基苯嗪
DAPI 4′,6-二氨基-2-苯基吲哚
DBA 二硼酸
DCM 二氰亚甲基-4H-吡喃
DCI 二氰异呋喃
DexP 环氧衍生物右旋糖酐
DMEM 杜尔贝科改良鹰液
DMSO 二甲基亚砜
DNP 动态核极化
E. coli 大肠杆菌
ECL 电化学发光
EDC 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺
eCFP 增强型蓝色荧光蛋白
ESIPT 激发态分子内质子转移
ETC 电子传递链
eYFP 增强型黄色荧光蛋白
FAS 荧光亲和传感器
FD-FLIM 频域荧光寿命成像显微镜
FDG 2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖
FET 场效应晶体管
FFT 快速傅里叶变换
FI 荧光强度
FITC 荧光素异硫氰酸酯
FLIM 荧光寿命成像显微镜
FRET 弗斯特共振能量转移
G-3-P 葡萄糖-3-磷酸
G-6-P 葡萄糖-6-磷酸
GA 甘油醛
γ-CyD γ-环糊精
GBP 葡萄糖结合蛋白
GBM 葡萄糖结合分子
GBGPs 葡萄糖/半乳糖结合蛋白
GL 类葡萄糖配体
GlcN d-葡萄糖胺
GlcNAc N-乙酰葡萄糖胺
GLP-1 胰高血糖素样肽1
GLUTs 葡萄糖转运蛋白
GMP 鸟苷一磷酸
GO 石墨烯氧化物
GOx 葡萄糖氧化酶
GQDs 石墨烯量子点
GSH 缬氨酸谷胱甘肽
GSSH 谷胱甘肽二硫化物
H2O2 过氧化氢
HEMA 2-羟基乙基甲基丙烯酸
HEPES 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸
HUVEC 人脐静脉内皮细胞
ICT 分子内电荷转移
IL-6 白细胞介素-6
IL-17 白细胞介素-17
iCGM 集成持续葡萄糖监测
IFE 内部滤光效应
IMP 肌苷一磷酸
ITC 等温滴定量热法
ITO 酒石酸铟锡
KATP ATP敏感钾通道
LED 发光二极管
LOD 检测限
MCU 线粒体钙转运蛋白
MG 马来酸绿
MINP 分子印迹纳米粒子
MglB 细菌d-半乳糖结合周质蛋白
MOF 金属有机框架
MRI 磁共振成像
MRS 磁共振光谱
MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物
Myo 肌红蛋白
NADPH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
NBD 7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑
NBD-Cl 4-氯-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑
NCLX Na/Ca/Li交换剂
NIR 近红外
NMR 核磁共振
OAA 苍氨酸丙酮酸
OCT 光学相干断层扫描
OPD o-苯二胺
PA 磷脂酸
PALM 光激活定位显微镜
PAM 聚丙烯酰胺
PAMAM 聚胺
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PBA 苯硼酸
PC 磷脂胆碱
PDT 光动力疗法
PE 磷脂乙醇胺
PEBBLE 生物定位嵌入的探针
PEG 聚乙二醇
PEP 磷烯醇丙酮酸
6-P-GL 6-磷酸葡糖醇酸
PeT 光诱导电子转移
PET 正电子发射断层扫描
PHPMA 聚(N-2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺
PHEMA 聚(2-羟基乙基)甲基丙烯酸
PI 磷脂酰肌醇
PI3K 磷酸肌醇3-激酶
PMAETMA [2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵氯化物
PMCA 细胞膜钙转运蛋白
POD 过氧化物酶
PVA 聚乙烯醇
QCM 石英晶体微天平
QD 量子点
PS 磷脂丝氨酸
QY 量子产率
Rhod2 罗丹明2
RLU 相对光单位
rGO 还原型氧化石墨烯
ROI 关注区域
Rorc RAR相关孤儿受体
RORγt 视黄酸相关孤儿受体γt
ROS 活性氧
SC 磷酸钠
SEM 扫描电子显微镜
SERCA 肌浆/内质网钙转运蛋白
SGLT 钠-葡萄糖共转运蛋白
SIM 结构照明显微镜
SiR 硅罗丹明
siRNA 小干扰RNA
SLC2A 溶质载体家族2A
SNR 信噪比
SRS 受激拉曼散射
STDBA 苯并二硼酸
STED 受激发射衰减
STORM 随机光学重建显微镜
STRIDE 氘的谱学追踪
SUR1 磺酰脲受体
SWNT 单壁碳纳米管
TAG 三酰甘油
T1WI T1加权成像
TAMRA 四甲基罗丹明
TCA 三羧酸
TD-FLIM 时间域荧光寿命成像显微镜
TG 甘油三酯
TGF-β 转化生长因子β
Th17 辅助T细胞17
THF 四氢呋喃
TMB 3,3′,5,5-四甲基苯二胺
TMSPA 三甲基氧乙基丙烯酸
TNR 目标组织噪声比
TPM 两光子显微镜
TPE 四苯乙烯
TPEF 两光子激发荧光
TTF 四硫富瓦烯
TTP 胸腺嘧啶三磷酸
UDP 尿苷二磷酸
UTP 尿苷三磷酸
UV 紫外线
UV-Vis 紫外-可见光
VDCC 电压依赖性钙通道
VIE 振动诱导发射
VLDL 极低密度脂蛋白
WGA 小麦胚芽凝集素
XRD X射线衍射
YFP 黄色荧光蛋白

数据可用性

本研究未生成或分析新的数据。致谢

H. W. 感谢济宁医科大学和山东第一医科大学的支持。感谢山东省自然科学基金（ZR2023QB084）的资助。W. H. Z. 感谢宁夏医科大学与山东第一医科大学的医学科技研究中心的支持，以及中国宁夏省自然科学基金（项目编号2023AAC05030）的资助。K. W. 感谢山东第一医科大学和巴斯大学的支持，以及山东省自然科学基金（ZR2023QB181）的资助。L. W. 感谢南京大学提供的“唐学者”项目支持。S. E. L. 感谢EPSRC的资助（项目编号EP/W036193/1）。T. D. J. 感谢巴斯大学和河南师范大学化学与化学工程学院开放研究基金的资助（项目编号2020ZD01）。参考文献

脚注

?这些作者对本研究的贡献均等。