恒定通量SPTFF过程中跨膜压力的变化——两种蛋白质的比较

《Journal of Membrane Science》：Transmembrane pressure evolution during constant flux SPTFF – a comparison of two proteins

　　米歇尔·迪塞普奥拉（Michele Discepola）| 巴斯蒂安·奥埃托莫（Bastian Oetomo）| 巴迪·海登（Buddy Heydon）| 詹姆斯·阿瑟顿（James Atherton）| 本·亨特（Ben Hunt）| 罗玲（Ling Luo）| 萨莉·L·格拉斯（Sally L. Gras）| 桑德拉·E·肯蒂什（Sandra E. Kentish）
澳大利亚维多利亚州墨尔本大学化学工程系数字生物工艺开发中心，邮编3010

**摘要**
单次通过切向流过滤（SPTFF）是一种实现连续生物加工的关键技术，但其性能在高蛋白质浓度下可能受到膜污染的影响。在这项研究中，我们使用乳清蛋白分离物（WPI）作为模型蛋白来探讨污染机制和临界通量，并将结果与单克隆抗体（mAb）进行比较。我们进行了批次切向流过滤（TFF）实验，分别在通量步进和压力步进条件下测定两种蛋白质系统的临界通量。无论对于WPI还是mAb溶液，随着进料浓度的增加，临界通量均显著下降，这与浓度极化模型相符。尽管WPI和mAb在结构和分子大小上存在差异，但它们的临界通量行为和凝胶浓度却非常相似，这支持了在早期研究中使用WPI作为替代品的合理性。同时，我们也评估了将批次TFF的发现应用于SPTFF的效果。在低通量下，污染主要由孔堵塞机制主导；而在高通量下，当浓度极化和滤饼层形成变得显著时，污染程度会加剧。数据可以拟合赫米亚堵塞定律（Hermia’s blocking laws），但需要更复杂的模型来解释运行初期蛋白质浓度随时间和膜长度的变化。总体而言，这项研究既突出了WPI作为模型蛋白的优点，也指出了其局限性，并为治疗性抗体生产中的过滤策略优化提供了指导。

**1. 引言**
膜分离工艺在现代生物制药生产中至关重要，尤其是在治疗性蛋白的纯化和配制过程中。超滤（UF）和渗滤（DF）已成为下游处理的标准工具，特别是在药物配制之前的最后阶段[1]。这些技术被广泛用于浓缩蛋白质并交换缓冲液的同时保持产品完整性，因此在单克隆抗体（mAb）等生物制剂的纯化中不可或缺[2]。UF和DF系统因其可扩展性、在温和条件下操作以及能够有效保留高分子量生物分子同时允许盐和其他低分子量物质通过而受到青睐[3]。然而，随着生物制药行业的发展，对高浓度制剂、连续加工和更严格监管要求的不断增长，膜过滤技术不仅需要提高效率，还需要具备更高的可靠性、更低的污染和可靠的产品质量[4]。
切向流过滤（TFF），也称为交叉流过滤，是生物加工中最常用的UF和DF配置。在这种设计中，进料溶液沿膜表面切向流动，而水和较小的溶质则透过膜。切向流通过限制浓度极化和膜污染，减少了膜表面上保留溶质的积累[5]。与正常流过滤（进料流垂直流经膜）相比，TFF具有更长的运行寿命和更高的产率[6]。尽管传统TFF通常以批次模式运行并需要较高的循环速率，这会对蛋白质溶液施加较高的剪切力[7]，但像单克隆抗体（mAb）这样的蛋白质对剪切应力敏感，可能导致结构损伤，如变性、聚集或断裂，从而影响产品产量和质量[8]。此外，批次TFF中使用的循环回路使其不太适合连续加工，因此人们对替代过滤技术的兴趣日益增加。
为了解决这些局限，单次通过切向流过滤（SPTFF）作为一种实现连续生物加工的关键技术受到了关注。在SPTFF中，进料流在膜模块中單次通过而无需循环，从而实现所需的浓度或缓冲液交换[9]。这种配置消除了对外部储罐和循环泵的需求，显著减少了滞留体积，并便于集成到连续生产平台中[10][11]。此外，SPTFF因其封闭的在线配置而能够更好地控制工艺条件，提高可扩展性，并降低污染风险[5]。

虽然SPTFF具有许多优势，但其广泛应用的主要挑战之一是在高蛋白质浓度下的膜污染。在SPTFF系统中，由于缺乏循环和低流速，会导致浓度极化增加和沿膜长度的局部污染[12]。SPTFF的流速通常比批次TFF低4-6倍（批次TFF的流速约为320升/平方米·小时[0.17米/秒][9]。污染会导致膜渗透性下降、通量分布不均以及跨膜压力增加，最终影响产品回收率、一致性和运行寿命[12]。
蛋白质过滤中的膜污染源于溶质与膜表面之间的物理和化学相互作用。根据蛋白质性质、膜特性和操作条件，可能发生孔堵塞和滤饼层沉积等机制[13][14][15]。在临界通量以下，蛋白质吸附和孔堵塞是主要机制[14][15]；而在此临界通量以上，滤饼层沉积则更为显著。这种滤饼沉积的发生可以用Zydney提出的浓度极化模型来描述[16]：
公式1
其中，凝胶浓度表示 bulk 中蛋白质开始沉淀的点，曲线的斜率代表边界层内的传质系数[16]。然而，SPTFF中的污染在空间和时间上的发展与批次TFF明显不同，因为进料浓度、粘度和剪切率沿膜长度发生变化[17]。理解这些因素如何影响污染程度对于预测系统性能和开发有效的设计改进至关重要。

为了研究过滤系统中的污染现象，研究人员经常依赖模型蛋白，如牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶或乳清蛋白分离物（WPI）[18][19][20]。WPI是一种广泛使用且价格实惠的高纯度蛋白质，来自乳制品行业。它主要由球形蛋白组成，如β-乳球蛋白（18 kDa）、α-乳白蛋白（14 kDa）以及少量较大的蛋白质（如牛血清白蛋白，66 kDa）[21]。这些蛋白质在各种环境条件下都具有良好的水溶性和结构稳定性。WPI溶液还表现出浓度依赖性的聚集和凝胶化现象，使其适合在各种剪切和浓度条件下研究污染机制[22][23]。由于其低成本和易于处理的特点，WPI成为膜污染研究的有用模型。
然而，仅使用模型蛋白不足以完全反映实际生物制药产品的复杂性。单克隆抗体在结构和分子大小上与WPI不同，IgG的分子量根据类型不同介于143 kDa到149 kDa之间，并形成由两条重链（各50 kDa）和两条轻链（各25 kDa）组成的大型Y形四聚体。这使得IgG的体积大约是典型WPI蛋白质的2-10倍[24]。这些差异可能导致与膜表面的不同相互作用。此外，由于分子大小的差异，用于超滤的膜的截留分子量（MWCO）也会因蛋白质种类而异。这意味着用模型蛋白观察到的污染现象可能无法准确预测治疗性蛋白质在SPTFF中的结果。

由于蛋白质浓度是TFF的关键质量属性（CQA），保持其一致性对于将该单元操作整合到连续生物加工中至关重要[25][26]。尽管已有多项研究探讨了SPTFF的性能[10][27][28]，但这些研究并未主要关注恒定通量操作条件——而这正是连续生物加工所需的条件，也是实现保留液恒定蛋白质浓度所必需的。本研究通过在恒定通量条件下研究SPTFF来填补这一空白。

**2. 材料与方法**
过滤实验使用了来自Bulk Nutrients（澳大利亚格罗夫）的无味WPI（每100克含约90克蛋白质、1.2克脂肪、2.4克碳水化合物和156毫克钠）。WPI溶解在去离子水中（pH约5.5，电导率<0.1 μS/cm，Millipore Synergy），在室温下搅拌过夜，然后通过0.22 μm膜过滤器（Merck）去除聚集体和任何未溶解的颗粒。商业WPI粉末已经包含来自上游处理步骤的残留缓冲盐（磷酸盐和柠檬酸盐），因此直接用水溶解可提供一个具有工业代表性的缓冲溶液环境。最终在3克/升浓度下的电导率和pH分别为0.76 mS/cm和5.5。
mAb由CSL Limited提供。该mAb的分子量约为148 kDa，等电点为8.3。mAb以高盐缓冲液的形式提供，适用于工业生产，其中TFF操作紧随离子交换层析洗脱步骤之后。用相同的缓冲液稀释至3克/升后，pH为5.3，电导率为14.3 mS/cm。
所有实验均使用10 kDa（WPI）或30 kDa（mAb）T系列盒式装置，膜为Omega?改性聚醚砜（PES）（Cytiva）。盒式装置放置在一个Centramate? TFF盒式支架（Cytiva）中，并施加扭矩以防泄漏。在进料侧安装了压力表，而在保留液和渗透液侧安装了压力传感器（MIP系列，Honeywell）。保留液压力传感器位于背压阀之前，渗透液传感器位于渗透液泵之前。这些压力读数通过数据采集系统（LabJack Corporation，美国）实时监测，并连接到PC上的LabVIEW软件。在渗透液侧安装了一个Masterflex? L/S泵（Avantor，Radnor，美国），并通过LabVIEW软件（National Instruments）控制泵速，以实现恒定的保留液蛋白质浓度。

在过滤过程中，使用1/16英寸mPath?折射率（IoR）浓度监测器（Cytiva）在保留液和渗透液两侧监测保留液蛋白质浓度。在单次通过过滤过程中，在渗透液侧安装第二个IoR传感器特别有价值，因为它对缓冲液组成敏感，可以更准确地评估蛋白质浓度[31]。为了考虑缓冲液组成的变化，保留液中的蛋白质浓度通过计算保留液和渗透液中的信号差异除以校准曲线的斜率来获得。此外，渗透液侧的传感器还用于检测是否有蛋白质穿透膜。如果检测到渗透液中有蛋白质，则实验终止并丢弃数据。

在实验前，两个传感器均根据WPI和mAb的最大浓度（100克/升）进行了校准（见图1）。蛋白质浓度最初基于特定蛋白质浓度的溶液稀释结果，随后通过HPLC分析或UV/Vis吸光度测定进行确认。IoR传感器对蛋白质浓度表现出线性响应，并且已被证明能够在由聚集引起的浑浊环境中估计蛋白质浓度 [32], [33]。下载：下载高分辨率图像（156KB）下载：下载全尺寸图像

图1. IoR传感器对WPI（黑色方块）和mAb（红色圆圈）的校准曲线。经过折射率校正后的信号是减去缓冲液基线后的信号。

如图1所示，WPI和mAb的校准曲线具有不同的斜率。这强调了针对每种蛋白质单独校准传感器的重要性，因为观察到的差异表明折射率的变化是蛋白质特异性的，不能在不同蛋白质之间泛化。在本研究中使用的WPI系统中，这种差异没有实际影响，因为所有蛋白质种类都能被膜保留。

为了评估临界通量，首先使用Omega聚醚砜（PES）T系列卡匣（Cytiva）在批次TFF模式下进行了通量阶跃实验，膜面积为0.0093平方米。这些卡匣的初始标准化水渗透率（NWP）分别为160升/米2·小时·巴（用于WPI的10kDa膜）和260升/米2·小时·巴（用于mAb的30kDa膜），这些值随时间缓慢下降（见支持信息表S4和S5）。进料流速保持在46毫升/分钟（276升/米2·小时，基于无间隔通道的横流速度为0.056米/秒），而渗透通量通过控制渗透泵速度逐步增加。通过收集2分钟间隔内的渗透液并用分析天平测量其质量来确定渗透通量值。每个通量阶跃持续30分钟，随后暂停5分钟，在此期间夹持渗透管线以允许膜表面积累的蛋白质重新分布和溶解，如Chaubal和Zydney [34]之前所述。这些实验是在循环模式下进行的，浓浆和渗透液都返回到进料罐。使用10-70克/升范围内的较高蛋白质浓度来模拟通常更明显的污染情况。还对WPI在进料流速为92毫升/分钟（550升/米2·小时，即横流速度为0.11米/秒）或23毫升/分钟（140升/米2·小时，即横流速度为0.028米/秒）且蛋白质浓度相似的情况下进行了额外实验。

在膜清洗后，进行了在恒定跨膜压力（ΔP）下的额外实验。这些实验使用与通量阶跃实验相同的膜以及相同的进料流速和蛋白质浓度进行。为了在每次运行中保持恒定的进料浓度，渗透液和浓浆流再次循环回进料罐。ΔP逐步增加。在每个压力阶跃处，首先让渗透通量稳定（约5分钟），然后按照上述方法进行记录。

在SPTFF实验中，使用了过滤面积为0.1平方米的卡匣。在每个实验之前，将进料蛋白质溶液在膜模块中循环5分钟，此时渗透管线关闭且浓浆背压阀完全打开，以允许蛋白质在膜通道内均匀分布，而不引起任何浓度或流速变化。然后通过减小浓浆背压阀的开度并启动渗透泵来开始实验，从而建立沿膜的轴向浓度和流速剖面。

过滤在恒定进料流速92毫升/分钟或46毫升/分钟下进行，渗透通量分别为50升/米2·小时或25升/米2·小时，以实现单次通过时的体积浓度因子（VCF）为10。在生物制药应用中，特别是在多级单次过滤系统中，通常使用VCF为10 [35]。例如，1克/升的进料在46毫升/分钟的流速下浓缩到10克/升，并且在浓浆中的流速为4.6毫升/分钟。对于WPI，还在进料流速为92毫升/分钟和渗透通量为25升/米2·小时的条件下进行了实验，得到VCF为1.8；而对于mAb，则在浓浆浓度为100克/升和渗透通量为10升/米2·小时的条件下进行了额外实验，以更好地反映操作实践。在这些使用0.1平方米膜卡匣的SPTFF实验中，每次实验后都测试了标准化水渗透率（NWP），只有当NWP在130-200升/米2·小时·巴（WPI的10 kDa膜）或280-380升/米2·小时·巴（mAb的30 kDa膜）的范围内时，才继续进行后续实验（见支持信息表S5和S6）。应当注意的是，由于膜制造的变异性，这些卡匣的初始NWP值高于93平方厘米卡匣记录的值。进行了一些重复实验以评估在相同操作条件下的ΔP剖面的可重复性。重复运行的结果显示出良好的一致性，当按初始ΔP标准化时，ΔP剖面在实验误差范围内重叠。

膜清洗使用0.5 M NaOH进行，然后用去离子水冲洗，使用后的膜储存在0.1 M NaOH中。在使用WPI的SPTFF实验中途还使用了0.1 M HCl进行清洗步骤，以去除任何积累的盐沉积物。对于使用mAb溶液的实验，定期使用尺寸排阻色谱法监测蛋白质聚集体的存在。这些分析确认，在整个实验期间，此类高分子量物种占总蛋白质质量的比例始终低于1%。

3. 批量TFF中的临界通量确定

进行了批量TFF实验，以估计WPI和mAb溶液在恒定体积蛋白质浓度下的临界通量。首先，在进料浓度为10克/升、15克/升、30克/升、50克/升和70克/升的情况下进行了一系列通量阶跃实验。在这些实验中，渗透通量逐步增加，每个阶跃持续30分钟，以使系统达到稳态。通量阶跃方法已被证明是评估膜过滤污染研究中临界通量的有效方法 [37], [38], [39]。图2显示了其中一个实验中相应的跨膜压力（ΔP）和蛋白质浓度剖面的示例。在较低的通量水平下，跨膜压力最初急剧上升，随后趋于平稳，表明污染最小且主要由孔堵塞引起 [29]。相比之下，在较高的通量下，ΔP在初始上升后继续逐渐增加，表明过渡到更严重的污染现象。这种ΔP的逐渐增加与膜表面开始形成饼层一致 [29]。

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图2. 在进料浓度为30克/升的情况下，mAb的通量阶跃实验示例，显示了ΔP（黑色）和出口蛋白质浓度（红色）随时间的变化。进料流速为46毫升/分钟（280升/米2·小时）。渗透通量阶跃分别为5、18、31、43、48和53升/米2·小时。

为了量化这些效应，通过将ΔP的变化除以阶跃持续时间来确定每个通量阶跃的压强增加率（dΔP/dt）。然后将这些值与相应的渗透通量绘制在一起（图3）。对于每种蛋白质浓度，结果关系在低通量下最初是线性的，然后在较高通量下偏离线性。污染速率迅速增加的点被定义为临界通量 [40]。对于WPI，线性范围在10克/升时扩展到76升/米2·小时，但在30克/升时临界通量降至47升/米2·小时，在70克/升时进一步降至27升/米2·小时。在10克/升的mAb中也观察到了类似的浓度依赖趋势，而线性范围持续到大约80升/米2·小时，但临界通量在30克/升时降至43升/米2·小时，在70克/升时进一步降至18升/米2·小时。

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图3. 在不同进料蛋白质浓度的批量TFF通量阶跃实验中，跨膜压力增加率（dΔP/dt）作为通量的函数，对于WPI（A）和mAb（B）。进料流速为46毫升/分钟（280升/米2·小时）。

在膜清洗后，使用相同的膜卡匣在逐步增加跨膜压力的条件下进行了测试，并观察了渗透通量。对于WPI（图4A）和mAb（图4B），在这些条件下，数据一致地在压力-通量图中显示出两个不同的区域。在低ΔP下，渗透通量与压力成比例增加，并随蛋白质浓度降低。这种线性区域反映了过滤阻力由蛋白质吸附到清洁膜和孔堵塞决定的情况 [14]。然而，在较高的ΔP值下，ΔP-通量曲线的斜率降低，表明污染现象变得更加严重。在这种区域，浓度极化和饼层沉积成为膜阻力的重要因素 [14], [15]。如上所述，分隔这两个区域的转折点可以确定为临界通量（弱形式），在此之后系统从低速污染转变为高速污染。

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图4. 在不同进料蛋白质浓度的批量TFF实验中，渗透通量作为跨膜压力（ΔP）的函数，对于WPI（A）和mAb（B）。进料流速为46毫升/分钟（280升/米2·小时）。

临界通量的浓度依赖性在两种蛋白质系统中都得到了证实，如之前所观察到的 [36]。实际上，这个参数的值只有轻微差异，ΔP-通量曲线的整体形状以及随着浓度增加而逐渐降低的临界通量在两种通量阶跃和压力阶跃系统以及两种蛋白质中都是一致的。这种一致性表明，尽管WPI和mAb在结构和分子组成上存在差异，但在超滤过程中表现出相似的污染转变，体积浓度是决定临界通量的主要因素。

尽管蛋白质大小和应用膜的分子截留率不同，但两种蛋白质系统的行为在定量值上惊人地一致。在这两种情况下，体积浓度的对数与相应的临界通量之间存在明显的线性相关性（见图5）。

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图5. 在进料流速为46毫升/分钟（黑色方块）、23毫升/分钟（蓝色方块）和92毫升/分钟（红色方块）的情况下，WPI的临界通量作为体积蛋白质浓度的函数；对于mAb，在进料流速为46毫升/分钟（黑色圆圈）的情况下。显示了重复实验的误差条。

图5表明，两种蛋白质表现出相似的行为，凝胶浓度为140 ± 3克/升，质量传递系数为7.7 ± 0.2 × 10^-6米/秒，横流速度为0.056米/秒（46毫升/分钟）。考虑到蛋白质的显著不同大小和结构以及缓冲液组成的差异，两组数据之间的一致性有些令人惊讶。这表明WIP可以用作更昂贵的mAb制备的替代品来确定质量传递系数。

众所周知，这个质量传递系数将取决于层流中的浓浆流速（），我们在92毫升/分钟和23毫升/分钟的结果与这种关系相当一致（见图5和支持信息中的图S2）。本研究中观察到的mAb的凝胶浓度低于之前使用Pelicon卡匣的mAb研究的值，后者约为200克/升 [41]。这种差异可能归因于mAb和所用缓冲液条件的不同。然而，凝胶浓度与之前记录的脱脂奶蛋白质的值（126克/千克 [42]）相当一致。

3. SPTFF中的膜污染表征 - 乳清蛋白分离物（WPI）

与批量TFF相比，由于沿膜通道连续去除渗透液，SPTFF在流速和蛋白质浓度上都表现出显著的轴向梯度。随着进料流通过模块，横流速度减小而蛋白质浓度增加，导致局部质量传递系数和临界通量逐步降低。根据我们实验确定的关联关系，质量传递系数从模块入口处的约1.1x10-5 m/s（流速=0.056 m/s）降低到出口附近的3.5x10-6 m/s（流速=0.0056 m/s），实验条件为进料流量为46 mL/min，渗透通量为25 litres.m-2.h-1。应用凝胶浓度为140 g/L的浓度极化模型后，预测的临界通量沿着模块长度显著降低，这既是由于质量传递系数的减小，也是由于保留物浓度的增加。例如，对于进料浓度为5 g/L的情况，预测的临界通量从入口处的132 litres.m-2.h-1降低到出口附近的13 litres.m-2.h-1。这一分析表明，即使在平均通量低于临界值的情况下，模块下游区域的局部操作条件也可能超过临界通量。

WPI SPTFF实验最初在恒定渗透通量25 litres.m-2.h-1和恒定进料流量46 mL/min的条件下进行，有效滤液体积流量（VCF）为10（见图6.A）。随后又进行了三次实验，渗透通量仍为25 litres.m-2.h-1，但进料流量增加到92 mL/min（见支持信息图S4）。这显著降低了出口保留物的浓度（例如，进料浓度为1 g/L的样品在出口处的浓度从10 g/L降至1.8 g/L），并提高了平均橫流速度（即保留物流速从4.6 mL/min增加到50.6 mL/min），使得出口保留物的橫流速度从0.0056 m/s变为0.062 m/s。

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图6. A）在恒定渗透通量25 litres.m-2.h-1和进料流量46 mL/min的条件下进行WPI SPTFF过程中，跨膜压力（ΔP）随时间的变化情况，曲线分别对应不同的保留物出口浓度：10 g/L（黑色）、30 g/L（红色）、30 g/L（重复实验，棕色）和50 g/L（蓝色）。B）在恒定渗透通量25 litres.m-2.h-1和出口浓度为30 g/L的条件下进行WPI SPTFF时，蛋白质浓度与跨膜压力（ΔP）的关系。

在所有情况下，都存在一个初始阶段，持续时间约为十分钟，在此期间出口保留物的蛋白质浓度从起始进料浓度开始增加（见图6B）。有趣的是，当通过除以该时间点的值来标准化ΔP数据后，所有七条浓度曲线都重合，显示出相同的趋势（见图7）。这种一致性表明，此时间点之后的污染遵循与浓度无关的机制。这令人惊讶，因为Hermia的孔堵塞模型预测孔堵塞和滤饼形成应在较高浓度下更快发生。这表明任何与浓度相关的效应仅在实验的最初几分钟内表现明显，此时孔堵塞正在发生。图6A清楚地显示了浓度依赖性：在十分钟时刻，ΔP值随浓度单调上升。需要注意的是，图6A中出口浓度为30 g/L时两条曲线的差异反映了归一化水渗透性（NWP）的变化。较高的曲线是在新鲜膜上进行的第一次实验（NWP = 260 litres.m-2.h-1.bar-1），而较低的曲线是在清洁后的使用膜上进行的（NWP = 190 litres.m-2.h-1.bar-1）。

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图7. 在恒定渗透通量25 litres.m-2.h-1和进料流量46 mL/min的条件下进行WPI SPTFF实验时，归一化跨膜压力（ΔP/ΔP0）随时间的变化情况。线条分别对应不同的出口保留物蛋白质浓度：10 g/L（黑色）、30 g/L（红色）和50 g/L（蓝色）。

使用Origin软件中的Levenberg-Marquardt算法进行了非线性回归分析，以确定Hermia的堵塞过滤定律是否能够合理地拟合数据，包括这一早期阶段。初步模拟表明，使用结合孔堵塞和滤饼形成的模型（方程4）是最佳方法，可以捕捉到全部行为范围。虽然通过拟合四个参数可以获得对数据的极佳拟合，但这些参数在不同实验间的变化并不符合物理现实的趋势。为了减少可调参数的数量，选择了一个值以匹配从NWP实验确定的平均膜渗透性（164 litres.m-2.h-1.bar-1）。进一步观察到B值在各实验间相对稳定。这并不奇怪，因为Field和Wu指出，对于特定的膜模块几何形状，B值仅应随保留物流速与流通量的比值变化。在46 mL/min的实验中，这个比值是恒定的（在模块入口处为400 m2）。将进料流量增加到96 mL/min应该会使保留物流速与流通量的平均比值翻倍，但初步模拟表明B的任何变化都在误差范围内。因此将此值设定为平均值0.0041 s-1。这个值明显低于Nourafkan等人[43]记录的恒定通量下的mRNA TFF值（0.72 s-1至1.04 s-1）。这可能反映了使用了中空纤维膜或更高的橫流速度。相反，Kirschner等人[29]记录的B值（乳胶珠为0.007 s-1至0.052 s-1，大豆乳液为0.003 s-1）与我们的值更为一致。值得注意的是，Kirschner没有考虑膜污染的早期阶段，这是变化最大的时期。

由于操作主要在临界通量以下，滤饼形成部分虽然不为零，但很小，因此也将此值设定为常数5.2 m-1，这是基于初始模拟和观察结果（见图7），即在初始阶段后ζ与浓度无关。这些限制将可调参数的数量减少到仅σ一个。我们的σ值远小于Nourafkan等人的值（1.6 x 10^5至1.2 x 10^6），但与Kirschner等人使用的常见模型污染剂的结果相当（乳胶珠为100 m-1，大豆油为32至81 m-1，见图8）。

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图8. 不同渗透通量下WPI（WPI）和mAb的孔堵塞参数（σ）作为保留物蛋白质浓度的函数。虚线代表对每个数据系列的最佳拟合线。根据Hermia的理论，σ值应取决于进料/保留液中的蛋白质浓度，我们的结果也遵循这一趋势（见图8）。与预期一致，污染在过滤器出口附近最为严重，那里蛋白质浓度最高，质量传递系数最低，σ与模块出口处的蛋白质浓度相关。然而，理想情况下，图8中的趋势线应通过原点，25 litres.m-2.h-1和50 litres.m-2.h-1的数据应重合。这些差异的出现是因为本研究中使用的机械模型是为批次TFF开发的，因此没有考虑当前系统中的空间和时间变化。特别是，我们的实验在初始阶段表现出非稳态，此时关键的模型假设被打破。在开始时，膜上的蛋白质浓度是均匀的，等于进料浓度。在运行的前十分钟内，渗透液的去除导致保留物出口浓度增加，直到达到目标VCF 10（见图6b），从而沿膜长度产生轴向浓度梯度。在同一时期，保留物流速不稳定，调整以适应渗透液的抽取。这些初始的瞬态条件（出口蛋白质浓度和流速变化了十倍）没有被模型很好地捕捉到。孔堵塞参数（σ）主要根据过滤曲线的初始部分确定，在此期间孔堵塞导致压力急剧上升。由于这一阶段受到这些未考虑变化的影响最大，因此使用该模型无法高精度地确定σ。同样，模型也不能正确表示这一早期阶段的数据（见支持信息图S3和S4）。

另一组WPI SPTFF实验在更高的渗透通量50 litres.m-2.h-1和进料流量92 mL/min的条件下进行，最终也达到了10的体积浓度因子（VCF）（见图9）。与25 litres.m-2.h-1下的实验不同，在那种情况下，无论初始蛋白质浓度如何，归一化ΔP曲线都重叠。具体来说，较高的进料浓度（> 20 g/L）导致归一化ΔP更快更明显地增加，表明污染更为严重。这些结果支持了这样的假设：在50 litres.m-2.h-1的通量和超过20 g/L的浓度下，系统运行在临界通量以上，此时表面污染机制如滤饼形成起主导作用。通过SEM成像确认了滤饼的形成（见支持信息图S6）。

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图9. A）在恒定渗透通量50 litres.m-2.h-1和进料流量92 mL/min的条件下进行WPI SPTFF过程中，跨膜压力（ΔP）随时间的变化情况。曲线分别对应不同的保留物出口浓度：5 g/L（紫色）、10 g/L（黑色）、20 g/L（绿色）、30 g/L（红色）和50 g/L（蓝色）。B）在恒定渗透通量50 litres.m-2.h-1和进料流量92 mL/min的条件下进行WPI SPTFF实验时，归一化跨膜压力（ΔP/ΔP0）随时间的变化情况。曲线分别对应不同的保留物出口浓度：10 g/L（黑色）、20 g/L（绿色）、30 g/L（红色）和50 g/L（蓝色）。

在这种更高通量下的数据可以使用与25 litres.m-2.h-1通量相同的中间孔堵塞和滤饼形成模型进行拟合（见表S1）。在拟合该模型时，我们保持了相同的B值0.0041 s-1，并再次基于NWP实验提供的值。对于低于临界通量的保留物蛋白质浓度（即20 g/L及以下），我们保持ζ为5.2 m-1，但对于高于临界通量的情况，允许该值增加。在此范围内，ζ值随蛋白质浓度显著增加（见表S1）。然而，需要注意的是，这两次实验的误差范围相对较大。这可能是由于需要拟合两个参数（σ和ζ），并且实验时间较短，因为当系统压力超过1.6 bar时必须终止实验。然而，ζ与蛋白质浓度之间的相关性证实了SPTFF中膜表面蛋白质积累显著受到进料组成的影响，表层阻力成为随时间跨膜压力增加的主要因素。

使用mAb进行的单克隆抗体（mAb）SPTFF实验的进行方式与WPI相同，进料浓度（1至5 g/L）、浓度因子和渗透通量（25和50 litres.m-2.h-1）也相似，使用的也是几何形状类似的30 kDa Omega T系列盒式装置。mAb SPTFF过程中记录的绝对ΔP值低于WPI在相同操作条件下的记录。这可以归因于mAb过滤中使用的膜孔径较大（30 kDa对比10 kDa），从而降低了膜阻力。实际上，这种情况下的NWP平均值达到了340 litres/m2.h.bar，远高于10 kDa膜的记录值（164 litres.m-2.h.bar-1）。

在恒定渗透通量25 litres.m-2.h-1下进行的SPTFF实验数据如图10所示，展示了在不同进料流量和保留物出口蛋白质浓度下的ΔP变化情况。应当注意，这些压力曲线中噪声的增加是由于使用了PID控制器来维持渗透泵的恒定流量所致。下载：下载高分辨率图片（537KB）下载：下载全尺寸图片

图10. (A) 在SPTFF实验中，随着时间变化的跨膜压力（ΔP），实验中使用的是mAb，渗透通量恒定为25升/平方米·小时。实验在进料流量为46毫升/分钟的情况下进行，保留液出口蛋白浓度分别为30克/升（黑色和红色）和50克/升（蓝色）；以及在更高的进料流量92毫升/分钟的情况下，保留液出口浓度为9克/升（绿色）。(B) 在恒定渗透通量25升/平方米·小时和进料流量46毫升/分钟的情况下，SPTFF mAb实验的标准化跨膜压力（ΔP/ΔP0）随时间的变化。保留液出口蛋白浓度分别为30克/升（红色）和50克/升（蓝色）。再次强调，当以非稳态期结束时的跨膜压力为基准进行标准化后，数据重合，表明操作处于临界通量以下，且这一参数的进一步变化与浓度无关（图10B）。实际上，基于这一点来看，mAb和WPI之间的行为差异非常小（见支持信息图S8）。

进行了一组类似的实验来达到体积浓度因子（VCF）为10的条件，进料流量为92毫升/分钟，渗透通量为50升/平方米·小时（图11A）。在这种情况下，保留液浓度为10克/升和30克/升的标准化压力曲线明显分化（图11B）。对应于30克/升出口浓度的实验显示出比10克/升出口更明显的标准化ΔP增加。这种行为反映了在较高蛋白浓度下污染加剧和压力积累，这与超过临界通量一致。下载：下载高分辨率图片（384KB）下载：下载全尺寸图片

图11. A) 在SPTFF实验中，随着时间变化的跨膜压力（ΔP），实验中使用的是mAb，渗透通量恒定为50升/平方米·小时。实验在进料流量为92毫升/分钟的情况下进行，保留液出口蛋白浓度分别为10克/升（黑色）和30克/升（红色）。B) 在恒定渗透通量50升/平方米·小时和恒定进料流量92毫升/分钟的情况下，SPTFF mAb实验的标准化跨膜压力（ΔP/ΔP0）随时间的变化。图中显示的进料浓度分别为1克/升（黑色）和3克/升（红色）。

对于图10和图11的数据，采用了与WPI相同的建模方法，B的值保持为0.0041秒^-1，而初始跨膜压力（ΔP0）在大多数情况下是根据标准化水渗透性（NWP）测量值（340升/平方米·小时·巴）设定的。请注意，使用这个值无法准确模拟保留液浓度为10克/升、通量为25升/平方米·小时的数据集，因为实验中的跨膜压力始终低于这个初始值（见图10A）。在这种情况下，模拟预测的初始渗透性为680升/平方米·小时·巴。

在低于临界通量的情况下，数据的最佳拟合得到了一个 cakes 常数 K = 3.0 米^-1，这比之前为WPI确定的值略低。这可能反映了mAb溶液的更高纯度，应该减少了污染速率。即使在超过临界通量之后，相应的cakes常数也相对较低，约为6.3米^-1。对于这个系统，孔隙阻塞参数（σ）再次被发现随蛋白浓度变化，而在这种情况下，它大致独立于施加的通量（见图8）。

还进行了一项实验，通量为10升/平方米·小时，进料流量为18.5毫升/分钟。这些条件是有意选择的，以便在不超过临界通量的情况下达到100克/升的保留液浓度（见图S9）。这些数据同样可以使用B = 0.0041秒^-1和K = 3.0米^-1来建模。较高的保留液浓度导致了σ的较大值（见表S2），但与之前的实验结果一致（图8）。

讨论与结论

本研究调查了WPI和mAb在批量和恒定通量下的SPTFF条件下的污染行为和临界通量特性。尽管两种系统在分子大小、结构和膜分子量截断值上有显著差异，但批量实验结果揭示了这两种蛋白质的整体行为存在意想不到的相似性。在两种情况下，临界通量都随着体积浓度的增加而一致降低，表明浓度极化和凝胶层形成是污染发生的关键决定因素。当拟合到浓度极化模型时，WPI和mAb的临界通量数据在实验误差范围内得出了相同的凝胶浓度和传质系数。这种密切对应关系增强了该框架的稳健性，并突显了WPI作为膜污染早期研究中mAb的有效和经济替代品的潜力。

SPTFF实验进一步在连续操作下确认了这些观察结果。在渗透通量为25升/平方米·小时、保留液浓度在10克/升到50克/升之间的情况下，WPI和mAb系统主要在其各自的临界通量阈值以下运行，表现出稳定的（ΔP）曲线和最小的污染。相反，在通量为50升/平方米·小时或更高出口浓度下运行时，系统超过了临界通量阈值，导致ΔP迅速增加以及表面污染现象（如凝胶层形成）的出现。这些结果清楚地表明，批量模式下观察到的临界通量行为可以转移到SPTFF操作中，使得批量研究能够成为连续过滤设计的宝贵预测工具。然而，在两种模式之间直接外推数据时必须小心，因为SPTFF中的局部浓度和速度梯度沿膜变化，在循环批次系统中无法捕获这些变化。

Kirschner等人提出的机械模型[29]有效地描述了恒定通量操作期间跨膜压力的时间演变。通过结合中间孔隙阻塞和饼层过滤项，该模型捕捉到了两种蛋白质系统中污染进展的主要特征。重要的是，从拟合中得出的孔隙阻塞参数（σ）与蛋白浓度呈线性关系，这与Hermia的经典过滤定律所建议的理论依赖性一致。尽管如此，该模型在拟合实验数据的初始阶段存在一些局限性，特别是在SPTFF操作的早期阶段。这种偏差可能是因为模型假设进料和保留液浓度以及 Crossflow 速度是恒定的。相反，在SPTFF的初始阶段，蛋白浓度随时间显著变化。即使在达到稳态之后，浓度和局部剪切率沿膜长度也会变化。这些变化改变了传质和污染的局部驱动力，表明需要一个更为先进、空间分辨率更高的模型来准确捕捉这些动态。因此，我们未来的工作将尝试扩展现有模型，以考虑SPTFF模块特有的浓度和 Crossflow 速度的轴向变化。

扩大SPTFF规模带来了额外的挑战。增加膜面积和进料流量可能导致更大的轴向浓度梯度以及更低的局部 Crossflow 速度，从而导致较低的传质系数和靠近模块出口处的局部临界通量降低。仔细设计模块几何形状和流动分布对于管理这些变化非常重要。在恒定通量操作中，保持关键参数（如渗透通量和 Crossflow 速度）在扩大规模时的稳定性对于保持相似的流体力学和传质条件至关重要。

本研究中呈现的实验使用了单一的缓冲液组成、pH值、离子强度和温度。虽然这种方法能够控制地评估恒定通量下SPTFF中污染的机械方面，但在结果方面存在局限性。众所周知，溶液的属性如pH值和离子强度通过改变静电作用力、蛋白构象和聚集[44],[45]来影响蛋白-蛋白和蛋白-膜相互作用。因此，本文报告的参数应在所研究的特定物理化学环境的背景下进行解释。

未来的工作可以通过系统地探索不同的缓冲液和条件来扩展所提出方法的适用性。特别是，结合机械模型的计算模拟可以在不需要大量实验工作的情况下预测更广泛pH值和离子强度范围内的污染[46],[47]。通过引入考虑静电相互作用和蛋白稳定性的物理化学参数，这样的模拟可以提供关于缓冲液组成和过滤条件变化如何影响污染动态的见解。

从实际角度来看，所呈现的结果表明，尽管WPI和mAb在物理上存在差异，但它们展现出相似的污染机制和临界通量行为。这种一致性突显了使用WPI作为替代蛋白在早期过程开发和模型验证中降低实验成本和材料消耗的潜力。然而，这种方法受到蛋白质来源和所用膜的不同物理化学性质的局限性。这些差异，加上WPI使用10 kDa膜而mAb使用30 kDa膜的选择，意味着无法在同一基础上比较通量、跨膜压力和阻力的绝对值。尽管两种系统的临界通量随体积浓度的变化趋势相似，但污染的机制可能并不相同。因此，虽然WPI有助于复制定性的污染转变，但它可能无法完全捕捉工业相关条件下的抗体污染的定量细节。

作者贡献声明：

Buddy Heydon：方法论。James Atherton：写作 - 审稿与编辑、项目管理、资金获取。Michele Discepola：写作 - 原始草稿、可视化、方法论、调查、正式分析、数据管理、概念化。Bastian Oetomo：写作 - 审稿与编辑、软件、方法论、调查。Sally L. Gras：写作 - 审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取。Sandra Kentish：写作 - 审稿与编辑、监督、项目管理、方法论、正式分析、概念化。Ben Hunt：写作 - 审稿与编辑、验证、资源管理、调查。Ling Luo：写作 - 审稿与编辑、监督。