东灰松鼠（Sciurus carolinensis）中支气管分枝杆菌（Bordetella bronchiseptica）的调查

《EcoHealth》：Survey of Bordetella bronchiseptica in Eastern Gray Squirrels (Sciurus carolinensis)

　　摘要
2022至2023年间，在美国中西部俄亥俄野生动物中心（Ohio Wildlife Center）接受康复治疗的东部灰松鼠（Sciurus carolinensis）因不明原因的呼吸道疾病死亡率显著上升。研究人员开发了一种针对支气管败血波氏杆菌（B. bronchiseptica）的qPCR检测方法，用于检测表现出症状的动物。尽管共对65只松鼠进行了检测，但所有结果均为阴性。这一阴性结果强烈表明，这些死亡事件是由吸入性肺炎或其他未知病原体引起的。

引言
支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）是一种革兰氏阴性细菌，可引发多种动物物种的高度传染性和严重呼吸道疾病（Szymczak等人，2020年）。该病原体通常被称为“犬舍咳”，会导致气管和支气管的严重炎症，临床症状包括咳嗽、打喷嚏、干呕、鼻分泌物以及肺炎（Day等人，2020年）。许多哺乳动物物种以及某些人类都可能感染这种细菌。在犬类（Canis lupus domesticus）中常表现为气管支气管炎，在猪（Sus domesticus）中则表现为萎缩性鼻炎（Goodnow，1980年；Strausbaugh & Berkelman，2003年）。此外，已有记录显示该菌可导致英国的红松鼠（Sciurus vulgaris）出现支气管肺炎并最终死亡（Simpson等人，2013年）。支气管败血波氏杆菌也可能是人类未诊断呼吸道疾病的原因（Szymczak等人，2020年）。目前已有针对该菌的活疫苗，并且在许多小型动物医院中作为常规疫苗系列使用。密切监测疑似疫情并控制其传播至关重要。

本研究最初是为了检测被送入俄亥俄野生动物中心（OWC）的东部灰松鼠而开展的。OWC工作人员观察到这些松鼠出现了上呼吸道疾病的症状以及死亡率上升的情况。鉴于这一情况，以及过去曾在与其密切相关的松鼠物种中发现过支气管败血波氏杆菌感染的历史，初步怀疑该菌是导致死亡的原因，因为这种高度传染性的细菌容易在共同饲养的动物间传播。

方法
我们与俄亥俄动物疾病诊断实验室（ADDL）合作，利用Tizolova开发的方法（Tizolova等人，2014年）建立了针对支气管败血波氏杆菌的检测方案。该方法提高了检测敏感性（从每反应100 CFU提高到24 CFU），从而提升了检测准确性，因此被选为我们的主要参考方法（Tizolova等人，2014年）。我们从商业公司Integrated DNA Technologies（IDT网站）购买了所需的引物和探针。寡核苷酸序列详见表1。通过使用ADDL保存的已知阳性及阴性对照样本，验证了该检测方法的灵敏度和特异性。

具体操作步骤：
1. 从ADDL获取支气管败血波氏杆菌参考菌株，在Tryptic Soy Blood Agar和MacConkey琼脂培养基上37±2°C条件下培养24至48小时。
2. 使用MagMax Core核酸纯化试剂盒（Thermo Fisher，加利福尼亚）从样本中提取DNA。
3. 设计的引物和探针用于实时PCR扩增flaA基因与fliA基因之间的基因间序列。PCR反应体系包含：5 μl TaqMan Fast Virus 1-step、10.6 μl H2O、1 μl 10 μM Fla2、1 μl 10 μM Fla12以及0.4 μl 10 μM fla-FAM3。将2 μl提取的DNA模板与18 μl反应体系混合，总反应体积为20 μl。
4. 使用Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统进行反应：第一轮在50°C加热5分钟进行逆转录（Hold 1），随后在95°C加热20秒进行初始PCR激活（Hold 2）；共进行45轮循环，每轮条件为95°C加热3秒（变性）和60°C加热45秒（退火和延伸）。每个循环在60°C时收集荧光信号（Tizolova等人，2014年）。
5. 每次实验均包含已知的支气管败血波氏杆菌阳性及阴性对照样本。

样本检测：
在2023年2月至2024年2月期间，从OWC的东部灰松鼠个体中采集鼻拭子样本。这些松鼠通常被分组饲养（每组3-8只，年龄相近），这十分关键，因为支气管败血波氏杆菌具有高度传染性。样本采集后保存在生理盐水中，并置于-80°C冷冻状态直至运输。
6. 将样本送往ADDL，使用qPCR方法检测支气管败血波氏杆菌。

后续验证：
在完成OWC样本检测后，对五株已知阳性菌株及一株因呼吸道疾病死亡的兔子进行了十倍稀释验证。通过对这些样本进行检测，确认了该PCR方法的特异性，即它不会对其他非目标病原体（如支气管败血波氏杆菌相关菌种、禽型波氏杆菌、亨氏波氏杆菌、佩特里波氏杆菌、牛呼吸道合胞病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、传染性牛鼻气管炎病毒（IBR）、甲型流感病毒（IAV）、猪肺炎支原体（MHP）、猪鼻支原体（MHR）、猪副流感病毒3型（BPIV-3）、猪流行性繁殖综合征病毒（PRRSv）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2））产生误报。

结果：
对OWC中65只疑似感染的松鼠进行了支气管败血波氏杆菌的qPCR检测，所有结果均为阴性。因此可排除该菌是导致东部灰松鼠死亡率上升的原因。

讨论：
最初认为该疾病是由支气管败血波氏杆菌引起的，但因检测结果为阴性，这一可能性被排除。研究人员推断最可能的病因是吸入性肺炎（图2）。受影响的主要是新生或幼年松鼠，而吸入性肺炎在野生动物康复中较为常见，尤其是因为松鼠有强烈的进食习惯。

进一步分析：
需要进一步调查其他可能的细菌病因，如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）及厌氧菌（Aspiration Pneumonia，2009年）。通过十倍稀释验证了该PCR方法的特异性，确认其检测效率为95%，具有较高的可靠性。特异性测试确保了该方法在遇到类似病原体时不会产生误报。

结论：
支气管败血波氏杆菌在兽医领域是常见的病原体，其传染性要求必须尽可能预防疫情爆发。尽管OWC的松鼠样本检测结果均为阴性，但该检测方法的建立将简化ADDL未来的检测工作。未来该检测可与其他qPCR方法同时进行，有助于科学家同时检测多种传染病，快速确定感染原因。本研究结果排除了支气管败血波氏杆菌作为致病因素的可能性，确认吸入性肺炎是最可能的病因。目前关于该菌在野生动物中的研究仍不如在家养动物中深入，希望这项研究和检测方案能对其他野生动物保护者和研究人员有所帮助。虽然本研究针对东部灰松鼠的呼吸道疾病，但该检测方法适用于所有物种，可用来筛查支气管败血波氏杆菌的存在。其他研究机构在研究松鼠呼吸道感染时也可参考这些结果。