《医疗卫生领域的残疾研究及残疾评估——未来发展的主题与挑战》 作者：黛布拉·A·哈利（Debra A. Harley）与萧思怡（Si-Yi Chao）

《Healthcare》：Disability Studies and Disability Evaluation in Healthcare—Themes and Challenges Moving Forward Debra A. Harley and Si-Yi Chao

　　**简单总结：**
新孢子虫病是一种寄生虫疾病，可导致牛的流产，并对畜牧业造成重大经济损失。狗在环境中传播这种寄生虫方面起着重要作用。然而，关于越南狗感染该病的信息非常有限。在这项研究中，我们检测了河内142只收容所狗的血液样本，以确定它们接触该寄生虫的普遍程度。我们使用基于重组蛋白NcGRA4的间接酶联免疫吸附测定（iELISA）来检测抗体，这些抗体表明之前的暴露。近三分之一的测试狗显示出暴露迹象，表明该寄生虫在该地区的狗中存在。我们还将这种方法与间接荧光抗体测试（iFAT）进行了比较，发现它可能作为一种大规模筛查犬新孢子虫感染的有效工具。我们的发现为越南北部狗中新孢子虫的存在提供了新的信息，并有助于改进疾病监测和控制策略，以降低牲畜感染的风险。间接荧光抗体（iFAT）
所有血清样本均通过间接荧光抗体测试（iFAT）进行了检测，以确认感染状态，并将结果与iELISA获得的结果进行比较。iFAT抗原载玻片的制备使用了N. caninum Nc-1株的速殖子，具体方法如先前所述[27]。犬血清样本首先在含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以1:50的比例稀释[28]，然后在37°C下与Neospora抗原包被的载玻片共同孵育1小时。随后，载玻片在37°C下与荧光素异硫氰酸酯（FITC）结合的山羊抗狗IgG（目录编号035-10，VMRD，华盛顿州普尔曼）孵育1小时。每次测试中都包含了商业化的N. caninum阳性和阴性对照血清（VMRD，华盛顿州普尔曼）。载玻片在荧光显微镜下观察，如果速殖子显示出明亮的线性外围荧光，则被认为是阳性样本，而如果没有荧光则为阴性样本（图2）。在1:50稀释度下呈阳性的样本进一步进行系列二倍稀释，以确定抗体的滴度。

2.7. 统计分析
统计分析使用SPSS统计软件（版本27.0；IBM公司，纽约州阿蒙克）进行。接收者操作特征（ROC）曲线分析用于确定基于NcGRA4的iELISA的最佳临界值，以iFAT作为参考标准。通过计算曲线下面积（AUC）、敏感性（Se）、特异性（Sp）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和卡帕系数（κ）（基于2×2列联表）来评估诊断性能。使用单变量和多变量逻辑回归分析评估潜在风险因素与N. caninum血清阳性之间的关联。p < 0.05被视为统计学上显著。

3. 结果
3.1. NcGRA4基iELISA的优化
使用1和2 μg/mL的NcGRA4纯化抗原浓度以及1:100和1:200的血清稀释度确定了最佳浓度，如表1所示。通过棋盘法测定，选择了1 μg/mL的纯NcGRA4蛋白浓度和1:200的样本稀释度。这些条件在使用最低抗原浓度的情况下提供了最佳的阳性与阴性（P/N）比值，从而提高了检测效率并减少了抗原消耗。尽管在阴性血清中观察到相对较高的背景反应性，但这些条件被认为是信号强度和背景噪声之间的最佳折中。所有优化实验均重复进行两次，且结果具有一致性。

3.2. NcGRA4基iELISA的诊断性能和验证
使用142个已知N. caninum抗体状态的犬血清样本评估了NcGRA4基iELISA的诊断性能（通过iFAT确定）。与iFAT相比，18个样本在这两种方法中均为阳性，而2个样本在iFAT中为阳性但在iELISA中为阴性。相比之下，只有23个样本在iELISA中为阳性。在122个iFAT阴性的样本中，99个样本被iELISA正确分类为阴性（表2）。图2显示了iFAT中抗N. caninum IgG阳性的犬样本，其N. caninum速殖子显示出广泛的外围荧光（a），而抗N. caninum IgG阴性的犬样本在×40物镜下观察不到荧光信号（b）。

3.3. 犬只中N. caninum感染的血清流行率
总体而言，通过iFAT确定的N. caninum感染血清流行率为14.08%（95% CI: 8.60–21.75%），而基于NcGRA4的iELISA检测到的血清流行率为28.87%（95% CI: 20.72–39.17%）。在区级层面，Quoc Oai区的血清流行率为17.57%（95% CI: 9.35–30.04%），Hoai Duc区的血清流行率为10.29%（95% CI: 4.14–21.21%）。相比之下，iELISA-NcGRA4在两个区域都检测到更多的血清阳性样本，分别为28.38%（95% CI: 17.57–43.38%）和29.41%（95% CI: 17.97–45.42%）。总体而言，iELISA-NcGRA4在两个区域的N. caninum血清流行率均高于iFAT（图4）。

3.4. 血清阳性犬只中的iFAT抗体滴度分布
在20只iFAT血清阳性的犬只中，针对N. caninum的抗体滴度范围从1:100到1:1600不等。大多数阳性样本的滴度为中等，主要是1:200（11/20），其次是1:400（4/20）。在Hoai Duc区（n = 7），滴度限于1:200和1:400，而在Quoc Oai区（n = 13）则观察到了更广泛的分布（1:100–1:1600）。只有两只犬只的滴度高于1:800。不同区域之间的血清阳性率没有显著差异（p = 0.21）。

3.5. 与N. caninum血清阳性犬只相关的风险因素
单变量分析表明，包括性别、年龄、品种和居住条件在内的评估因素均与N. caninum血清阳性无显著关联（p > 0.05）（表3）。表3. 单变量逻辑回归分析潜在风险因素与N. caninum血清阳性的关联。

4. 讨论
犬N. caninum感染的诊断主要依赖于血清学检测方法，这些方法已被广泛用于临床和血清流行病学研究[28]。然而，提高诊断准确性仍然至关重要，尤其是考虑到血清学检测方法可能与密切相关的原生动物寄生虫存在交叉反应[29]。在本研究中，我们使用iFAT作为参考方法，评估了一种基于重组NcGRA4的iELISA在越南北部犬只中检测N. caninum特异性IgG抗体的诊断性能。采用了通常推荐的犬血清滴度临界值1:50来定义iFAT血清阳性。基于NcGRA4的iELISA显示出良好的总体区分能力，ROC曲线下面积约为0.92。在选定的临界值下，该检测方法的敏感性为90.00%，表明其可作为犬群血清流行病学调查的实用筛查工具。然而，尽管ROC曲线表现良好，但其特异性仅为81.15%，与iFAT的一致性仅为0.49，这表明应谨慎解读基于NcGRA4的iELISA的实际诊断性能，可能不适合单独用于确认检测。OD值分布的分析显示，在选定的临界值附近，iFAT阳性和iFAT阴性样本之间存在部分重叠（图3b）。

3.3. 犬只中N. caninum感染的血清流行率
总体而言，通过iFAT确定的N. caninum感染血清流行率为14.08%（95% CI: 8.60–21.75%），而基于NcGRA4的iELISA检测到的血清流行率为28.87%（95% CI: 20.72–39.17%）。在Quoc Oai区，基于iFAT的血清流行率为17.57%（95% CI: 9.35–30.04%），在Hoai Duc区为10.29%（95% CI: 4.14–21.21%）。相比之下，iELISA-NcGRA4在两个区域都检测到了更多的血清阳性样本，血清流行率分别为28.38%（95% CI: 17.57–43.38%）和29.41%（95% CI: 17.97–45.42%）。总体而言，iELISA-NcGRA4在两个区域检测到的N. caninum血清流行率均高于iFAT（图4）。

3.4. 血清阳性犬只中的iFAT抗体滴度分布
在20只iFAT血清阳性的犬只中，针对N. caninum的抗体滴度范围从1:100到1:1600不等。大多数阳性样本的滴度为中等，主要是1:200（11/20），其次是1:400（4/20）。在Hoai Duc区（n = 7），滴度仅限于1:200和1:400，而在Quoc Oai区（n = 13）则观察到了更广泛的分布（1:100–1:1600）。仅有两只犬只的滴度高于1:800。不同区域之间的血清阳性率没有显著差异（p = 0.21）。

3.5. 与N. caninum血清阳性犬只相关的风险因素
单变量分析显示，包括性别、年龄、品种和居住条件在内的因素均与N. caninum血清阳性无显著关联（p > 0.05）（表3）。表3. 单变量逻辑回归分析潜在风险因素与N. caninum血清阳性的关联。这些发现支持这样的假设：收容所中的狗感染犬新孢子虫（N. caninum）的情况相对较为一致，这可能是由于它们在被收容之前有着相似的背景历史、共享的环境条件或管理方式。尽管如此，仍需要结合临床和分子数据的纵向研究来更好地理解感染动态以及不同抗体滴度的临床意义。在本研究中，包括年龄、性别、品种和居住条件在内的所有评估变量都与犬新孢子虫血清阳性无关。一些先前的研究也得到了类似的结果，即未观察到人口统计因素与犬新孢子虫感染之间存在显著关联[36,49]。相比之下，其他研究则认为某些宿主或环境相关因素可能是潜在的风险决定因素[37,45,50]，这表明犬新孢子虫感染的流行病学情况可能因当地条件和研究设计而异。本研究中未发现显著关联的原因可能有几个：首先，相对有限的样本量可能降低了检测弱关联或中等关联的统计能力；其次，研究对象仅为收容所中的狗，它们很可能面临相似的管理条件、喂养方式和环境暴露，从而导致样本群体具有较高的同质性，从而掩盖了各群体之间的潜在差异；此外，缺乏关于狗在被收容前的详细历史信息可能限制了识别相关暴露风险因素的能力。

本研究存在一些局限性：首先，基于收容所的采样策略可能会引入选择偏差，无法完全反映越南北部的整体犬群体情况，从而限制了研究结果的普遍适用性；其次，由于缺乏基于PCR等分子技术的确认方法，无法准确判断真实的感染状态，也无法区分当前感染和过去的感染，特别是在ELISA检测呈阳性而iFAT检测呈阴性的样本中；第三，在检测优化过程中观察到的较高背景反应性可能降低了检测的特异性，导致了假阳性ELISA结果的出现；此外，不能排除与其他顶复门寄生虫抗体之间的交叉反应，这可能会影响基于NcGRA4的iELISA的诊断性能；第四，对潜在风险因素的分析受到收集数据的质量和完整性的限制。最后，横断面设计方式无法评估抗体的时间变化和感染进展。未来需要结合分子诊断技术、改进检测方法、进行纵向采样并收集更全面的风险因素数据，以更好地了解越南犬新孢子虫的流行病学和传播动态。

**结论**：基于重组NcGRA4的iELISA显示了良好的诊断性能，并且与iFAT的结果有中等程度的一致性，这表明其作为流行病学监测和大规模检测犬新孢子虫感染的筛查工具具有潜在价值。尽管本研究未识别出显著的风险因素，但这些发现提供了重要的基线流行病学数据。本研究首次提供了犬只感染犬新孢子虫的血清学证据，为未来的流行病学研究和控制策略提供了宝贵的基础数据。

**补充材料**：相关支持信息可下载于：
https://www.mdpi.com/article/10.3390/ani16081205/s1
图S1：重组NcGRA4蛋白的表达和纯化过程。
泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：洗脱出的重组NcGRA4；泳道2：纯化的重组NcGRA4。预期的32-kDa NcGRA4条带由黑色箭头标示。