《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：De novo design and evaluation of dual inhibitory peptide binders targeting MDMX-p53 and MDM2-p53 interactions
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为解决MDMX/MDM2过表达导致p53功能失活的癌症治疗难题，研究人员通过RFdiffusion、ProteinMPNN、AlphaFold等多平台设计了可同时靶向MDMX与MDM2的双重抑制肽，发现Mb2与Mb4在结合亲和力、静电互补性和热稳定性上均优于天然p53，分子动力学模拟证实其结合稳定，为p53通路恢复提供了新型肽类候选药物。
在细胞对抗癌变的保卫战中，p53蛋白被誉为“基因组守护者”，它能够响应DNA损伤等应激信号，通过调控细胞周期停滞、凋亡或衰老来防止异常细胞增殖。然而，在许多癌症中，p53本身并未发生突变，其功能却被两个“反派”蛋白——MDMX（Murine double minute X，亦称MDM4）和MDM2（Murine double minute 2）所压制。MDM2作为一种E3泛素连接酶，会给p53贴上降解标签，使其被蛋白酶体清除；而MDMX则通过结合p53的转录激活结构域来直接抑制其活性。在正常情况下，两者精密调控着p53的活性，但在多种癌症中，MDMX和MDM2的过表达导致p53被过度“绑架”或降解，使其肿瘤抑制功能完全失效。传统的治疗策略，如开发小分子或订书肽（stapled peptides）抑制剂，往往只能靶向MDMX或MDM2其中之一。然而，这两个蛋白功能存在冗余和补偿机制，只抑制一个，另一个仍会继续压制p53，导致治疗效果有限。因此，开发能够同时抑制MDMX-p53和MDM2-p53相互作用的“双重抑制剂”，成为恢复p53功能、更有效对抗癌症的关键策略。近期，一项发表于《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》的研究，通过先进的计算机模拟方法，设计并评估了有望实现这一目标的新型肽类抑制剂。
研究者综合运用了多种前沿计算工具与方法。首先，从蛋白质数据库（PDB）获取MDMX-p53复合物结构（3DAB），利用RFdiffusion生成简化的MDMX主干结构，并基于实验数据定义了结合界面的热点残基。接着，使用ProteinMPNN设计了四个靶向MDMX结合裂隙的候选肽序列（Mb1-Mb4）。随后，通过AlphaFold Multimer和AlphaFold 3对肽-MDMX复合物进行高分辨率结构预测与精修验证。为全面评估设计肽的性能，研究还计算了肽与MDMX结合界面的静电互补性（使用PyMOL APBS插件），预测了肽的热稳定性（通过DeepSTABp服务器），并估算了结合亲和力（使用PRODIGY服务器）。最后，为验证复合物在动态环境下的稳定性，对筛选出的最佳肽（Mb2和Mb4）与MDMX/MDM2的复合物进行了时长达300纳秒的分子动力学（MD）模拟，使用GROMACS软件和CHARMM36力场，并分析了RMSD（均方根偏差）、RMSF（均方根涨落）、Rg（回转半径）、SASA（溶剂可及表面积）和PCA（主成分分析）等指标。
3.1 针对MDMX的肽类结合剂的结构建模
该部分旨在设计能够破坏MDMX-p53相互作用的肽。研究利用RFdiffusion和ProteinMPNN生成了四个肽序列（Mb1: SAKEIIEQALLQNVE, Mb2: SAEEIITQALLENVE, Mb3: EAQKEIEEALLANVE, Mb4: AAEEIITKALLENVE），并使用AlphaFold Multimer预测了它们与MDMX的复合物结构。通过将预测模型与实验测定的MDMX-p53复合物（PDB: 3DAB）进行叠合比较（图1），并计算pLDDT（预测局部距离差异测试）、ipTM（界面预测模板建模）、iPAE（界面预测对齐误差）和RMSD等置信度指标（表1），证实了所有四个肽（Mb1-Mb4）都能与MDMX形成稳定的复合物，且结构偏差极小。其中，Mb2和Mb4显示出略强的预测相互作用指标。
3.2 使用AlphaFold 3对预测复合物进行比较验证
为进一步确保可靠性，研究使用更新的AlphaFold 3对肽-MDMX复合物进行了独立建模。将AlphaFold 3与AlphaFold Multimer的预测结果进行结构叠合（图3），并比较了PAE图、ipTM和pTM（预测模板建模）值（表2），结果显示两者高度一致。尽管AlphaFold 3的ipTM分数普遍较低，但其较高的pTM分数支持了模型预测的可靠性，增强了Mb2和Mb4作为候选分子的可信度。
3.3 蛋白-肽复合物的静电互补性与结构稳定性
通过计算MDMX、p53及四个设计肽的表面静电势（图4），发现设计的肽（尤其是Mb2和Mb4）比天然p53肽具有更强的负表面电势。这增强了它们与MDMX p53结合界面（该区域富含正电荷）的静电互补性，从原理上解释了其可能具有更强、更稳定结合能力的缘由。
3.4 设计肽结合剂的热稳定性分析
使用DeepSTABp服务器在裂解物和细胞两种环境下预测了肽的熔解温度（Tm）。结果显示（表3），所有四个设计肽的预测Tm值均显著高于天然p53肽，表明它们具有更优越的热稳定性，在生理条件下更不易变性或降解，其中Mb2和Mb4的Tm值尤为突出。
3.5 设计肽结合剂与MDMX的结合亲和力评估
使用PRODIGY服务器评估了设计肽与MDMX的结合亲和力，并以天然p53肽作为基准（表4）。所有设计肽与MDMX的结合自由能（ΔG）都更负，解离常数（Kd）更低，表明结合更强。其中，Mb2和Mb4的ΔG和Kd值最优，并且它们形成了更多、更稳定的分子间接触，显示出最高的结合潜力。
3.6 评估Mb2和Mb4肽对MDM2-p53相互作用的抑制
鉴于MDM2是p53的另一关键负调控因子，研究进一步评估了Mb2和Mb4抑制MDM2-p53相互作用的潜力。使用AlphaFold 3预测了Mb2和Mb4与MDM2的复合物结构（图5），并与实验结构（PDB: 1YCR）进行比较。PRODIGY结合亲和力预测结果显示（表5），Mb2和Mb4与MDM2的结合也强于天然p53肽，证实了它们具有双重抑制MDMX和MDM2的潜力。
3.7 分子动力学模拟揭示Mb2和Mb4与MDMX和MDM2的稳定持久结合
对p53、Mb2、Mb4分别与MDMX和MDM2形成的复合物进行了300纳秒的分子动力学模拟。RMSD分析显示，所有复合物均能达到平衡，且Mb2和Mb4的复合物通常表现出比p53复合物更低、更稳定的RMSD值（图6A，图7A）。RMSF分析表明，在关键结合区域，Mb2和Mb4复合物的残基波动性低于p53复合物（图6B，图7B）。Rg和SASA分析显示，设计肽的复合物保持了结构紧凑性和稳定的界面埋藏（图6C-D，图7C-D）。PCA分析进一步揭示，Mb2和Mb4的复合物在构象空间中分布更集中，表明其构象动态更稳定（图6E，图7E）。这些动态模拟结果从多个维度证实了Mb2和Mb4能与MDMX和MDM2形成稳定、持久的复合物。
研究结论与讨论
本研究通过一套整合了结构生成、序列设计、复合物预测、能量计算和动力学模拟的先进计算流程，成功设计并评估了靶向p53负调控蛋白MDMX和MDM2的双重抑制肽。在四个候选肽中，Mb2（SAEEIITQALLENVE）和Mb4（AAEEIITKALLENVE）被鉴定为最具潜力的先导化合物。综合多项评估指标（表6），它们相对于天然p53肽展现出了多方面的优势：预测的结合亲和力更强（ΔG更负，Kd更低），与靶蛋白结合界面的静电互补性更佳，热稳定性（预测Tm值）显著提高。尤为重要的是，计算模型和分子动力学模拟均证实，Mb2和Mb4不仅能有效结合MDMX，也能稳定结合MDM2，实现了对这两个关键p53抑制因子的“一石二鸟”式靶向。这种双重抑制策略有望更彻底地解除癌细胞对p53的封锁，恢复其肿瘤抑制功能，从而克服单靶点抑制剂因补偿机制而疗效不足的问题。
讨论部分指出，尽管计算结果充满希望，但本研究完全基于计算机模拟（in silico），其结论亟需后续实验验证。例如，需要通过表面等离子体共振（SPR）或等温滴定量热法（ITC）等生物物理技术实测结合动力学，在细胞模型中验证其恢复p53转录活性和诱导癌细胞凋亡的能力，并在动物模型中评估其药效和药代动力学性质。此外，肽类药物固有的挑战，如体内稳定性差、细胞膜渗透性低和潜在的免疫原性，也需要在未来通过肽链订合（peptide stapling）、环化或与穿膜肽偶联等策略进行优化。
尽管如此，这项研究为开发基于p53通路的新型抗癌疗法提供了重要的概念验证和坚实的计算基础。它展示了如何利用RFdiffusion、ProteinMPNN、AlphaFold系列等人工智能驱动工具进行高效的“从无到有”（de novo）的肽类药物设计。若Mb2和Mb4能通过后续实验验证，它们将成为对抗MDMX/MDM2过表达型癌症的有力候选武器，为那些对现有疗法不敏感的患者带来新的治疗希望。
