综述：OsGATA16的天然变异有助于水稻对稻瘟病原菌（Magnaporthe oryzae）产生差异性免疫反应

《Journal of Genetics and Genomics》：Natural variation of OsGATA16 contributes to differential immunity against Magnaporthe oryzae in rice

　　张洪家 | 赵丽 | 李红 | 刘妍 | 张宝帅 | 李素娣 | 张雷 | 赵家伟 | 邹唯唯 | 曹玉欣 | 胡斌 | 朱成才 | 杜行林 | 江文珠 | 权顺福 | 张志华
中国吉林省吉林大学植物科学学院植物遗传改良工程实验室，长春，吉林 130062

摘要
由真菌病原体Magnaporthe oryzae引起的水稻稻瘟病对全球水稻生产构成了严重威胁。利用种质资源中的功能基因培育抗病品种仍然是控制稻瘟病最有效和可持续的策略。通过使用多样化的水稻种质资源进行全基因组关联研究（GWAS），我们鉴定出GATA转录因子OsGATA16作为稻瘟病抗性的候选调控因子。功能分析表明，OsGATA16的过表达显著降低了抗病性，而其敲除株表现出增强的抗性，从而确立OsGATA16作为水稻免疫的负调控因子。转录组分析、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因（dual-luciferase）和DAP-seq实验结果显示，OsGATA16直接抑制二萜类化合物的生物合成。UPLC-MS/MS分析发现，osgata16突变体中pimarane型二萜类化合物的积累增加。进一步分析表明，关键的pimarane型二萜化合物abietic acid能提升抗病性，但会降低耐寒性。鉴于OsGATA16在耐寒性中的已知作用，对137个核心水稻样本的单倍型分析揭示了抗病性和耐寒性之间的权衡。以 japonica 型为主导的单倍型Hap1（具有关键残基Val292和Gly333）表现出比indica型单倍型Hap2更强的转录抑制活性，群体遗传学分析支持了这种选择差异。总体而言，OsGATA16通过抑制pimarane型二萜类化合物的生物合成来负调控抗病性，成为培育双重抗逆性水稻的重要靶标。

引言
为了适应变化的环境，植物进化出了复杂的信号网络以应对各种非生物和生物胁迫（Dangl等，2013；Zhu，2016）。水稻（Oryza sativa L.）是一种从热带到温带地区广泛种植的主要作物，对全球粮食安全至关重要。在生物胁迫中，由Magnaporthe oryzae引起的水稻稻瘟病最具破坏性，严重疫情可能导致每年10%–30%的产量损失甚至绝收（Dean等，2012；Zhang等，2016）。培育抗病品种仍然是最可持续的控制策略，这需要识别关键的抗性基因（Nelson等，2018）。
在模式植物拟南芥和其他物种中的研究表明，植物-病原体相互作用中存在两层先天免疫反应：PAMP触发的免疫（PTI），由表面模式识别受体（PRRs）启动；以及效应子触发的免疫（ETI），由细胞内NLR受体介导（Jones和Dangl，2006；Yu等，2017）。这些途径协同驱动转录重编程和翻译后修饰，从而增强抗病性（Diao等，2025；Ngou等，2021；Xu等，2025）。虽然大多数已知的水稻稻瘟病抗性基因编码NLRs，但转录因子（TFs）也起着关键作用（Chen等，2022）。例如，WRKY家族的TFs如OsWRKY45和OsWRKY31已被鉴定为抗病性的正调节因子，而WRKY70则为负调节因子（Shimono等，2007；Wang等，2023；Li等，2024）。bZIP家族的TF APIP5通过与NLR受体Piz-t相互作用来促进抗病性（Wang等，2016）。C2H2家族的TF bsr-d1的一个自然等位基因通过其启动子中的SNP招募具有更高结合亲和力的抑制TF MYBS1，从而赋予广谱抗病性（Li等，2017）。OsMYB30被鉴定为硬质细胞增厚的正调节因子，介导对M. oryzae侵入的增强抗性（Li等，2020）。SPL家族的TF IPA1通过改变其磷酸化状态来协调抗病性和生长性能（Wang等，2018）。两个VOZ家族的TFs，OsVOZ1和OsVOZ2，负调控基础防御机制，但正调控Piz-t介导的对M. oryzae的抗性（Wang等，2021）。NAC家族的TF ONAC083作为抗M. oryzae免疫的负调节因子（Bi等，2023）。
GATA家族的TFs具有锌指结构（CX2CX17-20CX2C），随后是一个识别W-GATA-R（W=A或T，R=A或G）顺式元件的基本区域，调控叶绿体发育、光合作用和胁迫反应（Lowry和Atchley，2000；Schwechheimer等，2022）。在水稻中，已鉴定出28个GATA成员。OsGATA15（也称为Neck Leaf 1或Short and Narrow Flag Leaf 1，SNFL1）调控从营养生长到生殖分枝过程中的器官发生（He等，2018；Wang等，2021；Wang等，2009）。OsGATA11（也称为Cytokinin Responsive GATA Transcription Factor1，CGA1）和OsGATA12均调节叶绿体发育、植物结构和粒产量（Hudson等，2013；Lu等，2017）。OsGATA7参与调控BR介导的植物结构、粒形和产量（Zhang等，2018）。OsGATA6已被证明能控制抽穗日期和每穗的粒数（Zhang等，2022）。OsGATA8通过调控参与胁迫耐受性、ROS清除和叶绿素生物合成的基因来增加种子大小和非生物胁迫耐受性（Nutan等，2020）。更重要的是，OsGATA8被鉴定为水稻氮吸收和分蘖形成的关键协调因子，机制是通过抑制OsAMT3.2和OsTCP19（Wu等，2024）。
我们之前报道OsGATA16为耐寒性的正调节因子（Zhang等，2021）。在这里，通过GWAS发现它作为抗病性的负调控因子。OsGATA16的敲除增强了免疫性，而其过表达则降低了抗性。机制上，OsGATA16抑制二萜类化合物的生物合成，其敲除促进了多种二萜类化合物的生物合成。单倍型分析表明，不同OsGATA16等位基因之间存在耐寒性和抗病性之间的权衡，使其成为培育双重抗逆性水稻的靶标。

结果
**OsGATA16被鉴定为水稻稻瘟病的候选调控因子**
本研究使用了来自韩国和其他国家的168个水稻样本（150个japonica型和18个indica型，补充数据1）进行GWAS。基因型数据包括总共132万个高质量单核苷酸多态性（SNPs）。群体遗传分析显示该样本可划分为两个对应于japonica型和indica型的亚群（图1A和1B）。表型统计显示168个品种的抗病性呈正偏态分布，可能是由于田间感染率相对较低（图1C；补充数据1）。在6号染色体上鉴定出一个主要峰，包括一个主导峰SNP Chr06_22350551和其他5个相关位点（Chr06_22395713、Chr06_22395054、Chr06_22263038、Chr06_22362190、Chr06_22373752）（图1D）。LD衰减分析表明连锁距离为230 kb（r2降低到最大值的一半），符合以japonica型为主导的群体结构（图S1）。LD块分析鉴定出四个包含13个候选基因的LD块（图1E；表S1）。其中，Os06g0571800（编码OsGATA16）对茉莉酸（JA）有明显响应，JA是一种调节抗病性的关键激素（Shen等，2025），基于在线表达数据，使其成为抗病性调控的强候选基因（图1F和S2）。

**OsGATA16负调控对M. oryzae的免疫**
Os06g0571800编码GATA转录因子OsGATA16，该因子之前被鉴定为水稻耐寒性的正调节因子（Zhang等，2021）。为了研究其在抗病性中的作用，我们在japonica品种ZH11背景下获得了两个CRISPR/Cas9敲除突变株：gata16-1（+37 bp至+43 bp处的7 bp缺失）和gata16-2（+44 bp和+45 bp处的2 bp缺失）（图S3）。在Kitaake品种（即KT）背景下获得的两个独立过表达株与我们的先前报道相同（Zhang等，2021）。在生长室中通过喷施接种进行的稻瘟病抗性测定显示，这两个突变株的病斑面积和真菌生物量显著低于野生型（ZH11）（图2A、2B、S4），而过表达株的病斑面积显著高于野生型（KT）（图2C和2D）。与这些表型一致，三个病原体响应标记基因（OsPR1a、OsPR4和OsPR10a）（McGee等，2001；Mitsuhara等，2008）在gata16突变株中上调，在OsGATA16过表达株中在M. oryzae接种后48小时下调（图2E和2F）。这些结果表明OsGATA16负调控水稻的抗病性。

**OsGATA16抑制二萜类化合物的生物合成**
为了探究OsGATA16调控基础抗性的分子机制，我们对正常条件下的OsGATA16过表达株进行了RNA-seq分析。根据|log2 (倍数变化，FC) | > 1和假发现率（FDR）< 0.05的标准，我们分别在根部和茎部鉴定出2457个和616个差异表达基因（DEGs）（补充数据2）。基因本体论（GO）富集分析显示，“阳离子结合”相关术语在茎部显著富集（图3A），而“DNA复制”相关术语在根部富集（图S5A）。值得注意的是，“京都基因与基因组百科全书”（KEGG）中的“二萜类化合物生物合成”类别在茎部和根部均显著富集（图3B和S5B），“植物-病原体相互作用”在茎部富集，这与OsGATA16在抗病性中的作用一致。这些途径中DEGs的表达谱如图3C所示。我们进一步通过qRT-PCR验证了“二萜类化合物生物合成”途径中的三个基因（OsKSL4、OsMAS和OsCYP99A3）在过表达株中的抑制作用和在突变株中的激活作用（图3D）。在水稻原生质中进行的双荧光素酶报告基因分析显示，OsGATA16抑制这些基因的 promoter（图3E）。此外，通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析在这些基因的 promoter中也鉴定出OsGATA16的结合位点（图S6）。两周大的OsGATA16-OE lines（OE1和OE2）及其突变体（CR1和CR2）的幼苗，以及它们的野生型（分别为KT和ZH11）在生长室中生长，这些幼苗被收集用于RNA提取。水稻泛素基因被用作内部对照。E：利用OsKSL4、OsMAS和OsCYP99A3的启动子对OsGATA16进行转录调控分析。由每个启动子驱动的双荧光素酶报告基因分别与空载体（对照组）或OsGATA16效应子一起在水稻原生质中瞬时表达。数据为平均值±标准差（[D]中有3个生物学独立样本，[E]中有5个生物学独立样本）。星号表示与野生型或对照组相比具有统计学显著性差异（*，P<0.05；**，P<0.01）（Student’s t检验）。由于OsGATA16对萜类化合物代谢相关基因的调控作用，我们使用UPLC-MS/MS分析了osgata16突变体和ZH11中的萜类代谢物。主成分分析（PCA）显示，两个osgata16突变体系（CR1和CR2）在PC1和PC2上都聚集得较为紧密（图4A）。本次分析共检测到79种萜类代谢物（补充数据3）。文氏图分析确定了47种在osgata16突变体与ZH11之间以及响应稻瘟病接种后发生改变的差异代谢物（CR1-0h_vs_ZH11-0h，CR2-0h_vs_ZH11-0h）；这些代谢物被认为是osgata16突变体增强抗稻瘟病能力的关键因素（图4B；补充数据4）。在这47种差异代谢物中，有33种在这两种情况下都上调，其中25种属于萜类化合物（图4C）。有趣的是，这些上调的萜类化合物大多数属于齐墩果烷型萜类分支，而松脂酸是其核心成分。进一步分析表明，外源施用松脂酸确实可以增强水稻的抗稻瘟病能力（图S7）。相反，外源施用松脂酸会降低水稻的抗寒性（图S8），这与OsGATA16在抗寒性中的正向调控作用一致。总的来说，这些结果表明OsGATA16通过抑制萜类化合物的生物合成来降低水稻的抗稻瘟病能力。下载：下载高分辨率图像（959KB）下载：下载全尺寸图像图4. OsGATA16调节萜类化合物的生物合成。A：稻瘟病接种前（CR1-0h和CR2-0h）和接种后（ZH11-0h和ZH11-96h）的osgata16突变体的PCA。B：CR1-0h_vs_ZH11-0h、CR2-0h_vs_ZH11-0h以及ZH11-96h_vs_ZH11-0h之间差异代谢物的文氏图分析。C：33种上调代谢物的聚类热图。左侧聚类树上的颜色代表不同的萜类化合物类别。Z分数代表代谢物的标准化信号强度（单位方差缩放）。PCA，主成分分析。

OsGATA16的单倍型显示抗寒性和抗稻瘟病能力之间存在负相关性。我们之前在一个包含137个样本的核心集合中鉴定了五种OsGATA16单倍型，这些单倍型表现出不同的抗寒性（Zhang等人，2021年）。为了探讨OsGATA16单倍型与抗稻瘟病能力之间的联系，我们分析了这个组中的抗稻瘟病敏感性（补充数据5）。在过滤掉缺失的表型或遗传数据后，使用了131个样本和7个SNP，从而确定了四种单倍型（图5A）。与较高抗寒性（较低的冷胁迫指数）相关的Hap1和Hap3对稻瘟病的敏感性较高（较高的抗稻瘟病指数）（图5B）。相比之下，具有较低抗寒性（较高的冷胁迫指数）的Hap2则具有更强的抗稻瘟病能力（较低的抗稻瘟病指数）（图5C）。我们进一步获得了一个OsGATA16的染色体片段替代系（CSSL），该系在粳稻品种Koshihikari的遗传背景中携带了Aus品种Kasalath的6号染色体片段（从12.0 Mb到24.49 Mb）（Hap2）。与Koshihikari相比，这个CSSL表现出显著较小的病斑面积和较低的真菌生物量（图S9）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. OsGATA16单倍型的功能分析。A：131个样本中OsGATA16的单倍型分析。B和C：不同单倍型的单倍型-表型关联分析，即抗稻瘟病指数（B）和冷胁迫指数（C）。不同的字母表示通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan的多重范围检验（n = 53/51/11/16个样本分别在Hap1/2/3/4中）具有统计学显著性差异（P < 0.05）。D：OsGATA16编码区中籼稻单倍型（Hap2，93-11）和温带粳稻（Hap1，ZH11）之间的自然变异示意图。数字表示参考基因组中起始密码子下游的核苷酸位置。E：用于识别两种主要OsGATA16-CDS单倍型OsGATA16tej和OsGATA16ind的功能鉴定的双荧光素酶报告基因检测示意图。F：两种主要OsGATA16-CDS单倍型OsGATA16tej和OsGATA16ind的相对LUC活性结果。G：OsGATA16tej和OsGATA16ind之间差异转录抑制活动背后的关键变异筛选。不同的字母表示通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan的多重范围检验（n = 5在[F和G中）具有统计学显著性差异（P < 0.05）。为了识别这些表型差异背后的序列变异，我们分析了两个代表性品种中的OsGATA16基因组序列：温带粳稻ZH11（Hap1，OsGATA16tej）和籼稻9311（Hap2，OsGATA16ind），在编码区鉴定出了一个插入缺失（indel）和五个SNP（V1-V6）（图5D）。双荧光素酶检测显示OsGATA16tej比OsGATA16ind表现出更强的转录抑制活性（图5E和5F）。通过针对OsGATA16ind的个体OsGATA16tej变异进行定点突变发现，第三外显子（V5和V6）中的两个SNP赋予了更强的抑制活性（图5G）。

为了探索OsGATA16的起源和进化动态，我们分析了基于RiceVarMapV2.0（http://ricevarmap.ncpgr.cn；Zhao等人，2021年）和OryzaGenome2.1（http://viewer.shigen.info/oryzagenome21detail/index.xhtml；Kajiya-Kanegae等人，2021年）的数据集的序列变异。这两个资源分别包含了全球范围内的栽培水稻和野生水稻（Oryza rufipogon）样本。总共有十个SNP定义了十一个单倍型（表S2）。其中三个单倍型是野生水稻特有的（Hap9、Hap10、Hap11），五个仅存在于栽培水稻中（Hap1、Hap2、Hap3、Hap4、Hap8），其余三个在野生水稻和栽培水稻中都有分布（Hap5、Hap6、Hap7）（图6A）。Hap1、Hap8、Hap2和Hap4分别在温带粳稻、热带粳稻、籼稻和Aus亚群中占主导地位（图6B）。系统发育树重建和单倍型网络分析明确将这些单倍型划分为两个主要簇，对应于粳稻和籼稻亚群（图6C、6D、S10）。在籼稻和Aus亚群中占主导地位的单倍型（Hap2、Hap4）很可能源自Hap5，后者在O. rufipogon I中富集。相比之下，主要的粳稻单倍型（Hap1、Hap3、Hap7、Hap8）起源于Hap6，后者在O. rufipogon II和III中富集（图6D、S10；表S2）。野生水稻特有的单倍型Hap9起源于Hap5（籼稻和野生水稻之间的中间单倍型），而Hap10和Hap11由Hap6进化而来（粳稻和野生水稻之间的中间单倍型）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图6. OsGATA16的选择性清除和驯化。A：不同OsGATA16单倍型的亚群分布。B：不同亚群中OsGATA16单倍型的分布。C：使用NJ-Tree（Neighbor-Joining）模型（1000次自助法）从在线数据库生成的OsGATA16的系统发育树。D：OsGATA16的单倍型网络。圆圈大小与给定单倍型内的样本数量成正比。E：OsGATA16基因组区域的核苷酸多样性（Pi）。x轴表示基因组位置，绿色区间显示OsGATA16基因组区域。y轴表示平均π值。F：基于全球地图No. GS（2016）1667（来自http://bzdt.ch.mnr.gov.cn）的粳稻和籼稻中两种主要OsGATA16单倍型Hap1和Hap2的地理分布。核苷酸多样性分析显示，OsGATA16在温带粳稻（Tej，π = 0.000961）和籼稻（Ind，π = 0.0007826）中的遗传多样性明显低于野生水稻（π = 0.002394），而在该基因的侧翼区域观察到更高的多样性。这些发现表明OsGATA16在Tej和Ind组中经历了强烈的人工选择（图6E；表S3）。我们进一步计算了OsGATA16基因组区域的成对FST值，以评估水稻亚群之间的种群分化。OsGATA16位点内的FST水平显著高于侧翼序列，特别是在Tej和Ind亚群之间（表S4；图S11），表明这两个亚种之间存在显著的遗传分化。中性测试在所有检测的组中都得到了正的Tajima’s D值（所有指数 > 0），表明所有群体中的OsGATA16都经历了广泛的平衡选择（图S12）。地理分布分析显示，主要分布在粳稻相关的Hap1主要在中国的北方、韩国、日本和其他高纬度地区，而主要的籼稻相关单倍型Hap2则广泛分布在中国的南方、印度和低纬度地区（图6F）。这些发现表明，在水稻驯化过程中选择了不同的OsGATA16单倍型以适应当地的非生物胁迫（例如，低温）和生物胁迫（例如，稻瘟病）。

在长期的驯化和育种过程中，水稻地方品种和栽培品种适应了它们的原生栖息地，在那里它们经常同时面对非生物和生物胁迫。低纬度地区的相对较高温度和湿度加剧了真菌和细菌病害的压力，使得抗病性成为一个关键性状。相比之下，高纬度地区的栽培品种倾向于优先考虑抗寒性而非抗病性（图5B、5C、6F）。对于包括OsWRKY45、OsWRKY70和OsWRKY76在内的几个WRKY转录因子，也报告了这种抗病性与抗寒性之间的权衡（Li等人，2024年；Tao等人，2011年；Yokotani等人，2013年）。在这里，我们发现OsGATA16是抗稻瘟病的负调控因子，补充了其之前作为抗寒性正调控因子的作用（Zhang等人，2021年）。单倍型分析进一步揭示了抗寒性和抗稻瘟病能力之间的权衡，这归因于编码序列中的两个非同义SNP，它们增强了OsGATA16Hap1的转录抑制活性。尽管携带OsGATA16Hap2的CSSL相对于Koshihikari表现出更强的抗稻瘟病能力（图S9），但仍需要开发携带不同OsGATA16单倍型的近等基因系（NILs）来进一步验证抗寒性和抗稻瘟病能力之间的权衡。结合在多样化遗传背景中对OsGATA16关键SNP的靶向编辑以及在NILs中积累不同的OsGATA16变异，将有助于培育具有定制抗寒性和抗稻瘟病能力的水稻品种。萜类化合物是介导植物与其他生物相互作用的关键次级代谢物（Zi等人，2014年）。在鉴定出的萜类化合物中，momilactones作为抗生素植物抗生物质，对水稻病原菌Magnaporthe oryzae具有抗性，并表现出化感作用（Kato-Noguchi，2023年）。在这里，我们还发现momilactones（包括momilactone A/B/C）在osgata16突变体和稻瘟病接种后上调（图4C）。作为一种先前已确定的OsGATA16下游靶标，OsWRKY45也被报道为萜类植物抗生物质生物合成的正调控因子（Akagi等人，2014年）。如DAP-seq结果显示，OsGATA16可以结合到萜类化合物生物合成基因的启动子上（图S6）。因此，OsGATA16通过直接调控和WRKY45介导的间接途径调节萜类植物抗生物质的生物合成。此外，作为齐墩果烷型萜类生物合成分支的核心成分，松脂酸可以增强水稻的抗稻瘟病能力，同时抑制抗寒性（图S7和S8），这很好地解释了OsGATA16在调节抗稻瘟病能力和抗寒性方面的权衡效应。然而，这种权衡背后的详细分子机制仍有待进一步研究。此外，OsGATA16单倍型在粳稻和籼稻亚群中都以中等频率出现，并且Tajima’s D值为正，表明长期的选择作用。这种模式通常保持了功能多态性，不同的单倍型在可变的环境条件下提供了适应性优势。每个亚群中存在3-4个主要单倍型，进一步表明了它们在生态适应中的不同作用，突出了OsGATA16的功能重要性及其在维持等位基因多样性方面的进化约束。

材料与方法
所有用于GWAS的168个样本和用于单倍型分析的137个样本都在补充数据1中列出。本研究中使用了粳稻品种Zhonghua 11（ZH11）和Kitaake（KT）。OsGATA16的CRISPR/Cas9敲除突变体来自武汉Biorun Biosciences的ZH11突变体文库。KT背景下的OsGATA16过表达系是根据我们实验室之前的报道获得的（Zhang等人，2021年）。6号染色体的CSSL（跨度12.0-24.49 Mb）是通过将Aus品种Kasalath的染色体片段通过杂交和回交引入粳稻品种Koshihikari而开发的，并在我们的实验室中维持。
为了评估168样本组和137样本组中样本的抗稻瘟病能力，我们在韩国Naju的一个实验田里进行了自然诱导的稻瘟病田间试验，该地区每年都受到严重的稻瘟病影响。根据先前报道的标准方法（IRRI，2013年），研究了水稻叶枯病易感指数。通过喷雾接种法在生长室中分别评估了OsGATA16 CRISPR/Cas9敲除突变体和过表达株及其野生型植株的抗叶枯病能力（参考Li等人，2022年的研究）。具体操作如下：将Magnaporthe oryzae分离株99-20在25°C、12小时光照/12小时黑暗的光周期下培养两周。然后，通过用无菌水浸泡真菌琼脂培养物来收集孢子，并将悬浮液中的孢子浓度调整至3×10^5个分生孢子/mL，用于接种三叶期（发芽后20天）的水稻幼苗。接种7天后拍摄并计算病斑面积。同时，也使用0.02%的Tween溶液进行了空白对照接种。Magnaporthe oryzae生物量的定量分析遵循了Liu等人（2025年）的方法，通过检测受感染水稻叶片中的28S rDNA来实现。

采用Illumina HiSeq 2500测序系统平台（Illumina公司，美国加州圣地亚哥）对168个水稻样本进行了测序。平均基因组覆盖率为15倍，过滤后的读取数据与水稻参考基因组（IRGSP 1.0）进行了比对。使用plink软件进行GWAS分析时，设置了以下参数：次要等位基因频率（MAF）>5%，缺失数据<1%，杂合比例<5%（Purcell等人，2007年）。最终从原始数据中的2000万个SNP中筛选出约132万个SNP。GWAS分析使用R语言中的GAPIT包（版本3.0）进行（Wang和Zhang，2021年）。采用混合线性模型（MLM），并使用PCA（Q矩阵）和群体结构（K矩阵）作为协变量来校正GWAS结果。PCA分析由gcta软件（版本1.94）完成，系统发育树由MEGA软件（版本11）分析并通过itol软件（https://itol.embl.de/）可视化（Letunic和Bork，2024年）。由于该群体在水稻基因组中存在较高的连锁水平（LD），阈值是根据有效和独立SNP的总数来确定的。较低的LD阈值（LD<0.2）通过PLINK 1.9软件根据公式1/独立SNP数量进行筛选。位于位点峰值的SNP标记被指定为候选位点的关键SNP。为了精细定位目标区域，使用PopLDdecay软件（Zhang等人，2019年）进行了连锁不平衡（LD）衰减分析。LD块分析由LDBlockShow程序（基因组级别）完成（Dong等人，2021年）。计算了基因组中所有SNP的成对SNP标记的平均r2值，并识别出平均r2值降至最大值一半的区域作为候选区域。为了筛选候选基因，从NCBI GEO数据库中获取了水稻幼苗在JA处理下的基因表达谱数据（GSE39429）。

总RNA的提取使用Trizol试剂（Invitrogen）按照制造商的说明进行。DNA去除和逆转录反应使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Toyobo）完成。qPCR检测使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix试剂（Toyobo）并根据制造商的指示进行。分析基因的相对表达量基于2-ΔΔCt方法，以水稻UBIQITIN10作为内参基因。相关qPCR引物列表见补充数据6。

在水培条件下生长两周的水稻幼苗被用于总RNA的提取。每个品系的8株幼苗分别取根或茎部样本，每个样本重复三次。RNA-seq文库的构建和测序由OE biotech公司使用MGISEQ-2000平台完成。生成的读段经过清洗后比对到参考基因组。归一化后，使用FPKM值分析转录本的丰度。差异表达分析使用DESeq R包（Varet等人，2016年）进行。计算出的P值使用Benjamini方法进行调整，以控制假发现率。DESeq检测出的P值调整后<0.05的基因被确定为差异表达基因。差异表达基因的基因本体（GO）富集分析通过在线工具agriGO v2.0（Tian等人，2017年）进行。FDR（调整后的P值）小于0.05的GO术语被定义为显著富集的信号。KEGG分析通过在线平台（http://bioinfo.sibs.ac.cn/）完成。

对于瞬时转录激活实验，构建了含有萤火虫LUC基因（fLUC）的载体，该基因受到目标启动子（ATG上游2 kb）的控制，包括OsKSL4、OsMAS和OsCYP99A3，这些基因位于pGreenII 0800-LUC载体中（Hellens等人，2005年）。作为内部对照，使用了Renilla LUC基因（rLUC），该基因受到CaMV 35S启动子的控制，也位于pGreenII 0800-LUC载体中。OsGATA16的全长编码序列被克隆到pCAMBIA2300-35S:OCS载体中作为效应子。根据先前描述的方法（Bart等人，2006年；Zhang等人，2011年），将不同的载体组合转染到水稻原生质中。培养18小时后，使用双萤光素报告试剂盒（Promega，E1960）和GloMax 20/20发光计（Promega）测量LUC活性。结果以萤火虫LUC（fLUC）与Renilla LUC（rLUC）活性的比值表示。

为了比较不同OsGATA16等位基因的转录激活或抑制活性，分别从温带粳品种ZH11（Hap1）和籼品种93-11（Hap2）中克隆OsGATA16的编码序列（分别称为OsGATA16tej和OsGATA16ind），并将其与GAL4 DNA结合结构域融合到35S:GAL4DB载体中生成相应的效应子载体。通过定向突变（overlap-extension PCR）对OsGATA16ind（Hap2）的六个个别变异体（V1-V6）进行突变鉴定。生成的扩增子被克隆到35S:GAL4DB载体中以构建相应的效应子质粒。报告基因、参考基因和不同效应子载体被转染到水稻原生质中，然后按照上述方法测量LUC活性。构建相关载体所使用的引物列表见补充数据6。

为了鉴定OsGATA16的结合靶点，武汉GeneRead生物科技有限公司进行了DAP-seq分析。简而言之，组织样本在液氮中研磨成粉末。使用CTAB裂解和酚/氯仿/异戊醇纯化方法提取基因组DNA，然后使用Covaris M220将DNA片段切割至约200 bp长度，并使用library kit（NDM607，Vazyme）与测序接头连接。OsGATA16编码序列被克隆到pFN19K HaloTag T7 SP6 Flexi载体中。使用TNT SP6 Coupled Wheat Germ Extract System（Promega）表达HaloTag-OsGATA16融合蛋白，并使用Magne HaloTag Beads捕获。蛋白结合的珠子在旋转状态下与接头连接的DNA片段孵育1小时。经过三次洗涤去除未结合的DNA后，将珠子在98°C下加热10分钟以释放结合的片段。上清液使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix（Roche）进行PCR扩增。纯化的PCR文库在MGI T7平台上使用PE150模式进行测序。原始读段使用Trimmomatic（v0.39）去除接头和低质量碱基，然后使用Bowtie2（v2.4.5）与参考基因组比对。使用Picard MarkDuplicates去除PCR重复序列。使用MACS2（v2.1.1）进行峰值检测。q值<0.05的峰值通过ChIPseeker（v1.32.0）与邻近的基因组特征进行注释。归一化的DAP-seq信号转换为bigWig格式，并使用Integrative Genomics Viewer（v2.8.0）进行可视化。

水稻幼苗中的萜类代谢物的鉴定和定量由武汉Metware生物技术有限公司完成。具体操作如下：收集接种叶枯病前后的水稻幼苗，并在冻干机（Scientz-100F）中真空冻干。然后将样品研磨成粉末，取50 mg加入1200 μL预冷的-20°C 70%甲醇水溶液中进行提取。每隔30秒涡旋样品一次，共6次。离心后（旋转速度12000 rpm，3分钟），吸取上清液，样品通过微孔膜（0.22 μm孔径）过滤，储存用于UPLC-MS/MS分析。UPLC条件如下：柱子为Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）；移动相A为含有0.1%甲酸的纯水，移动相B为含有0.1%甲酸的乙腈。样品测量使用梯度程序进行，起始条件为95% A，5% B。9分钟内逐渐增加到5% A，95% B；随后调整为5% A，95% B并保持1分钟；流速设置为每分钟0.35 mL；柱子烘箱温度设为40°C；进样量为2 μL。流出液连接到ESI-triple quadrupole-linear ion trap（QTRAP）-MS。ESI源的操作参数如下：源温度550°C；离子喷枪电压为正离子模式5500 V/负离子模式-4500 V；离子源气体I、气体II和 Curtain气体分别设置为50、60和25 psi；碰撞激活解离设置为高值。MQQ扫描作为MRM实验进行，碰撞气体（氮气）设置为中等。对于每个时期流出的特定代谢物，分别进行DP（去聚类势）和CE（碰撞能量）的优化。

为了比较不同OsGATA16等位基因的转录激活或抑制活性，从温带粳品种ZH11（Hap1）和籼品种93-11（Hap2）中克隆OsGATA16的编码序列（分别命名为OsGATA16tej和OsGATA16ind），并将它们与GAL4 DNA结合结构域融合到35S:GAL4DB载体中生成相应的效应子载体。为了确定编码序列中的关键功能变异，通过对OsGATA16ind（Hap2）进行定点突变（V1-V6）生成六个变异体。相应的扩增子被克隆到35S:GAL4DB载体中以构建效应子质粒。报告基因、参考基因和不同效应子载体被转染到水稻原生质中，然后按照上述方法测量LUC活性。构建相关载体所使用的引物列表见补充数据6。

武汉GeneRead生物科技有限公司进行了DAP-seq分析。简要流程如下：组织样本在液氮中研磨成粉末。通过CTAB裂解和酚/氯仿/异戊醇纯化提取基因组DNA，然后使用Covaris M220将其切割至约200 bp长度，并使用library kit（NDM607，Vazyme）与测序接头连接。OsGATA16编码序列被克隆到pFN19K HaloTag T7 SP6 Flexi载体中。使用TNT SP6 Coupled Wheat Germ Extract System（Promega）表达HaloTag-OsGATA16融合蛋白，并用Magne HaloTag Beads捕获。蛋白结合的珠子与接头连接的DNA片段孵育1小时后，旋转洗涤三次以去除未结合的DNA。随后在98°C下加热10分钟以释放结合的片段。上清液使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix（Roche）进行PCR扩增。纯化的PCR文库在MGI T7平台上使用PE150模式进行测序。原始读段使用Trimmomatic（v0.39）去除接头和低质量碱基，然后使用Bowtie2（v2.4.5）与参考基因组比对。使用Picard MarkDuplicates去除PCR重复序列。峰值调用使用MACS2（v2.1.1）完成。q值<0.05的峰值通过ChIPseeker（v1.32.0）与附近的基因组特征进行注释。归一化的DAP-seq信号转换为bigWig格式，并使用Integrate Genomics Viewer（v2.8.0）进行可视化。

叶枯病易感指数的研究基于先前报道的标准方法（IRRI，2013年）。通过喷雾接种法在生长室中分别评估了OsGATA16 CRISPR/Cas9敲除突变体和过表达株及其野生型植株的抗叶枯病能力（参考Li等人，2022年的研究）。具体操作如下：将Magnaporthe oryzae分离株99-20在25°C、12小时光照/12小时黑暗的光周期下培养两周。然后，通过用无菌水浸泡真菌琼脂培养物来收集孢子，并将悬浮液中的孢子浓度调整至3×10^5个分生孢子/mL，用于接种三叶期（发芽后20天）的水稻幼苗。接种7天后拍摄并计算病斑面积。同时，也使用0.02%的Tween溶液进行了空白对照接种。Magnaporthe oryzae生物量的定量分析遵循了Liu等人（2025年）的方法，通过检测受感染水稻叶片中的28S rDNA来实现。鲍帅张、苏迪李、雷张、嘉伟赵、维维邹、宇欣涂：负责调查工作。宾胡、成才楚、星林杜：负责资源协调及写作审查与编辑工作。温 Zhu 江和 Soon-Wook Kwon：负责概念构思、资金筹集、资源协调及监督工作。志华张：负责概念构思、监督工作以及写作审查与编辑工作。