《Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids》：A novel algae oil-based emulsion enhances chemotherapy outcome in human cancer models
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DHA富集藻油纳米乳剂协同化疗增强肿瘤特异性疗效并诱导铁死亡。摘要：
Birgit Steiner-Zitzenbacher|Christina Karner|Andreas Uellen|Viktoria Holzer|Djenana Vejzovic|Marija Balic|Joanna Szkandera|Bernadette Liegl-Atzwanger|Beate Rinner
格拉茨医科大学病理学诊断与研究所，Neue Stiftingtalstra?e 6，8010格拉茨，奥地利
摘要
癌症治疗仍然面临治疗效果有限、与癌症相关的营养不良以及严重的毒性问题，这凸显了需要新的策略来改善治疗效果的必要性。Omega-3脂肪酸，特别是二十二碳六烯酸（DHA），具有营养和生物活性，包括抗炎作用以及增强肿瘤细胞对氧化应激和铁死亡（ferroptosis）敏感性的能力。为了提高稳定性和递送效果，Omega-3脂肪酸可以被制成纳米乳液，从而促进细胞吸收，并可能增强抗癌治疗效果。
因此，我们开发了一系列来自藻类、鱼类和橄榄油的具有特定Omega-3和Omega-9脂肪酸组成的纳米乳液。所有配方都表现出高物理化学稳定性、纳米级液滴尺寸和符合药典的质量标准。虽然纯油几乎没有任何生物活性，但纳米乳化显著提高了细胞毒性，而新型富含DHA的藻油乳液则表现出强烈的选择性抗肿瘤效果，且不会影响正常成纤维细胞。组合研究表明，这种乳液能根据肿瘤类型增强化疗效果；RNA测序显示，该乳液能够激活与铁死亡相关的通路，并抑制DNA复制和细胞周期进展。为了扩大其在肿瘤特异性靶向治疗中的转化应用，我们建立并表征了一种HER2?/ER?患者来源的乳腺癌细胞系及其对应的癌相关成纤维细胞。
总之，这些发现表明这种新型纳米乳液载体是一种选择性的、具有生物活性的DHA纳米载体，能够增强肿瘤类型的特异性治疗效果，提高选择性化疗效果，并诱导铁死亡驱动的细胞增殖抑制作用。这些结果凸显了DHA作为纳米级液滴配方中脂质成分的巨大潜力。
引言
癌症仍然是一个重大的全球健康挑战：2020年，新发病例超过1930万例，死亡人数接近1000万例[1]，不同地区的负担受人口统计、生活方式、环境暴露和医疗保健可及性等因素影响。预计到2040年，年病例数将达到2840万例，主要原因是人口老龄化和生活方式的改变[1]。在这种背景下，化疗期间的与癌症相关的营养不良——一种由全身炎症、肿瘤引起的代谢改变和治疗相关的分解代谢引起的多因素综合征——将成为更加紧迫的临床问题[2]。因此，减轻治疗相关毒性的辅助营养策略尤为重要。补充Omega-3脂肪酸（尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）是管理与癌症相关的营养不良和恶病质的有效方法，有证据表明这可以改善临床结果和生活质量[3]。富含DHA的油脂和富含Omega-3的饮食可以减少全身炎症，对抗癌症恶病质，并有助于保持骨骼肌质量和生活质量[4,5]。除了营养支持外，DHA作为一种生物活性脂质，在肿瘤学中具有治疗潜力：临床前研究表明，它可以抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡/铁死亡，并提高多种癌症类型的化疗敏感性[[6], [7], [8]]。从营养角度来看，DHA和其他Omega-3脂肪酸主要来源于海洋食物网：微藻是这些脂质的主要生产者，而大多数海洋生物（包括鱼类）自身的合成能力有限，因此它们通过饮食摄取EPA和DHA[10]。野生型和工程化的异养藻类菌株的油脂含量很高（干重的50-77%），主要是富含DHA的三酰甘油（TGs）[11]。由于DHA的疏水性和易氧化性，人们开发了各种递送系统来改善其分散性、稳定性和生物利用度。因此，已经开发了一系列纳米制剂，包括纳米乳液、纳米脂质体、聚合物纳米颗粒和固体脂质纳米颗粒，用于预防和治疗心血管疾病和癌症[12]。其中，纳米乳液特别值得关注，因为它们是动力学稳定的油水分散体，液滴直径通常在20-500纳米之间，通过表面活性剂和某些情况下的共表面活性剂进行稳定[13]。由于它们能够将酯化的PUFAs封装成胶体液滴[[14], [15], [16]]，我们选择这种方法将藻类来源的DHA制成纳米乳液进行评估，这标志着向藻类Omega-3天然酯化形式的潜在肠外应用迈出的一步。纳米乳液可以通过渗漏的血管实现被动肿瘤靶向，或者通过表面修饰或设计成对肿瘤特异性刺激作出反应来实现主动靶向[17]。因此，它们作为活性药物成分的有效载体被广泛用于安全高效地递送药物，特别是那些水溶性较差的药物[[13], [14], [15], [18], [19]]。例如，装载紫杉醇的Clinoleic?和Intralipid?肠外营养纳米乳液在两种胶质癌细胞系中表现出浓度依赖性的细胞毒性，而不含药物的植物油载体则没有这种效果[20]。同样，基于琉璃苣油的纳米乳液配制的多西他赛在临床前研究中显示出增强的治疗效果，这归因于其中高含量的γ-亚麻酸[21]。然而，DHA由于其六个双键而极易发生脂质氧化，在膜动态和细胞代谢中起着重要作用。最近的研究表明，DHA可以增强肿瘤细胞对氧化应激的敏感性，从而增强抗癌治疗的细胞毒性[22,23]。这种效应与铁死亡密切相关，铁死亡是一种由铁依赖的脂质氧化驱动的细胞死亡形式，当抗氧化系统（如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）受损时会发生[24]。与细胞凋亡或坏死不同，铁死亡的特点是致命脂质氧化的积累，已成为治疗耐药性恶性肿瘤的有希望的治疗靶点[25]。
基于藻油的纳米乳液被评估其对细胞活力、细胞凋亡诱导和基因表达变化的影响，包括在自体透明细胞肉瘤（CCS）模型中的效果[26]。为了探索其转化潜力，我们进一步评估了其与传统化疗药物的相互作用，以确定能够增强疗效同时最小化毒性的Omega-3基组合策略。在我们的模型中，新型纳米乳液处理一致地上调了与铁死亡相关的转录程序，同时抑制了与DNA复制和细胞周期进展相关的通路，表明其在脂质氧化敏感性和增殖控制方面具有双重作用。这些发现支持了富含DHA的纳米乳液不仅具有肿瘤选择性活性，还可以作为组合疗法中的合理伴侣，从而为进一步将其发展为肿瘤学辅助剂提供了有力依据。
纳米脂质乳液的制备
用于制备这些纳米乳液的成分见表1。简要来说，将1.2% w/v的卵磷脂（Lipoid E80，含有80%的磷脂酰胆碱，Lipoid，Ludwigshafen am Rhein，德国）、0.03% w/v的油酸钠（Lipoid，Ludwigshafen am Rhein，德国）和2.5% w/v的无水甘油（KLK Emmerich，Emmerich am Rhein，德国）加入注射用水中。然后将连续相加热至50-60°C。对于分散相，使用10%（w/v）的高纯度DHA油（藻油1，AO1；DHA来源，Fermentalg?）
新型纳米乳液的设计与表征
新开发的纳米乳液旨在提供丰富的Omega-3多不饱和长链脂肪酸，基于来自不同Schizochytrium sp菌株（AOE1和AOE2）、橄榄油（OOE）、天然（FOE）和重组鱼甘油三酯（EOE）的天然高纯度油脂制备。所有用于本研究的油脂都经过了含量、氧化和环境参数的检测，以满足药典（Pharm. Eur., USP）的要求。
讨论
当前研究表明，在各种纳米乳液中，一种富含DHA的新型藻类来源纳米乳液在多种癌细胞系和自体肉瘤模型中表现出独特的效果，无论是单独使用还是与标准细胞毒性药物联合使用。
这项研究的目的是为改善治疗效果和减少化疗相关毒性奠定基础。我们的数据表明，富含DHA的乳液能够选择性地损害恶性
CRediT作者贡献声明
Birgit Steiner-Zitzenbacher：概念构思、资金获取、研究、资源提供、撰写——初稿。Christina Karner：形式分析、研究、方法学、验证、可视化、撰写——初稿。Andreas Uellen：概念构思、研究、方法学、撰写——初稿。Viktoria Holzer：研究、验证、可视化。Djenana Vejzovic：研究、验证。Marija Balic：资源提供。Joanna Szkandera：资源提供。Bernadette
资金信息
本研究得到了奥地利研究促进机构（FFG）的支持，资助编号为52597062和60546469。
CRediT作者贡献声明
Birgit Steiner-Zitzenbacher：撰写——初稿，资源提供、研究、资金获取、概念构思。Christina Karner：撰写——初稿，可视化、验证、方法学、研究、形式分析。Andreas Uellen：撰写——初稿、方法学、研究、概念构思。Viktoria Holzer：可视化、验证、研究。Djenana Vejzovic：验证、研究。Marija Balic：资源提供。Joanna Szkandera：资源提供。Bernadette
利益冲突声明
新型藻油乳液已申请专利（专利权归Fresenius Kabi所有）。
致谢
我们要感谢TAmiRNA的Magdalena Mecking在数据生成和解释方面的支持，以及Fresenius Kabi Austria GmbH的Eva Trotscha在宝贵而富有建设性的讨论中的帮助。我们还要感谢Freya Lyssy在球形石蜡包埋和切片方面的技术支持。作者们还感谢原材料供应商提供的研究样本。
