《Biologics: Targets and Therapy》：Optimization of Recombinant Human Interferon-Gamma Expression and Purification in E. coli, and Developing an Immunization Protocol for the Production of Optimal Humoral Response
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背景 重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）和单克隆抗体因其生物医学应用前景，是全球改善临床药物的有前景的生物分子。然而，大多数非洲国家缺乏成熟的生产方案。虽然弗氏完全佐剂（FCA）被广泛用于增强抗体产生，但据报道会引起不良反应。本研究旨在优化rhIFNγ的表达和
背景 重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）和单克隆抗体因其生物医学应用前景，是全球改善临床药物的有前景的生物分子。然而，大多数非洲国家缺乏成熟的生产方案。虽然弗氏完全佐剂（FCA）被广泛用于增强抗体产生，但据报道会引起不良反应。本研究旨在优化rhIFNγ的表达和纯化，并开发一种使用替代佐剂（如RIBI Immunochem（RIBI）佐剂和弗氏不完全佐剂（FIA））诱导最优体液反应的免疫接种方案，并以FCA作为标准对照。
方法学 研究人员从NCBI检索了人干扰素γ（NM000619.3）序列，并送交GenScript进行密码子优化和载体构建合成。将构建体转化至大肠杆菌BL-21，并使用IPTG诱导蛋白表达。优化了表达和纯化条件。为了评估免疫接种方案和替代FCA的佐剂，研究人员用不同浓度的rhIFNγ（25、50和100 μg）与等体积的RIBI佐剂、FIA和FCA混合，分别免疫三组雌性BALB/c小鼠。采用酶联免疫吸附试验测量各组抗体水平。
结果 该研究确定了0.6 mM IPTG、37°C、250 rpm条件下表达4小时是rhIFNγ的最佳表达条件。增加洗涤和洗脱缓冲液中的咪唑浓度提高了rhIFNγ的纯度，但降低了蛋白产量。用100 μg rhIFNγ与RIBI佐剂接种可引发充分的免疫反应，而较高浓度的FCA和FIA则增加了副作用，表明需要更低的佐剂剂量。
结论 尽管据报道FCA可产生高抗体滴度但伴有显著副作用，但本研究发现，用100 μg rhIFNγ与FCA混合免疫的小鼠，与用100 μg rhIFNγ加RIBI佐剂免疫的小鼠组之间，抗体水平无显著差异。
论文解读：重组人干扰素-γ表达纯化优化与佐剂免疫效果研究
一、 研究背景、问题与目的
重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）及其单克隆抗体是价值巨大的生物制剂，预计到2030年市场规模将达到120亿美元，在临床诊断、研究和疫苗开发中具有广泛应用。然而，非洲大陆面临着严峻的药品供应安全问题。尽管贡献了全球约18%的人口、25%的疾病负担和50%的传染病起源，但在非洲大陆使用的诊断、治疗和疫苗中，只有不到4%是在非洲本地生产的。因此，在资源有限的环境中建立简单、经济、高效的重组蛋白生产技术至关重要。
在rhIFN-γ的生产方面，其在大肠杆菌表达系统中常形成不溶性包涵体，给活性蛋白的获取带来挑战。在应用层面，使用rhIFNγ等重组蛋白免疫动物生产抗体时，通常需要使用佐剂来增强免疫原性。弗氏完全佐剂（FCA）因其高效的免疫增强能力而被广泛使用，但已知会引起注射部位炎症、肉芽肿甚至全身性问题等严重不良反应，违背动物福利伦理。动物管理和使用委员会推荐使用RIBI佐剂系统和弗氏不完全佐剂（FIA）等替代性、问题较少的佐剂。尽管存在副作用，研究人员仍倾向于使用FCA，因为它被证明能比大多数替代方法刺激产生更强的体液反应。
基于上述背景，本研究旨在解决两个核心问题：1. 开发一种适用于资源有限环境的简单、经济、高效的重组人干扰素-γ生产方法。2. 评估替代佐剂（RIBI佐剂和FIA）与FCA相比，在优化抗体产生的同时，最大限度地减少实验动物不良反应的效果。
二、 主要研究方法概述
本研究是一项基于实验室的实验性研究，在麦克雷雷大学兽医医学、动物资源和生物安全学院的生物安全与全球健康中心进行。研究采用的主要关键技术方法包括：
- 1.
分子克隆与表达优化：从NCBI获取人IFN-γ基因序列（NM000619.3），经GenScript进行密码子优化后，克隆至pET-28a(+)载体，并转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中。通过检测不同IPTG浓度、诱导时间和温度下的表达水平，优化蛋白表达条件。
- 2.
蛋白纯化与条件优化：由于目标蛋白在包涵体中表达，研究采用镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）固定化金属亲和色谱法在变性条件下（使用8M尿素）进行纯化。通过系统优化洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的咪唑浓度，以平衡蛋白纯度和产量。
- 3.
动物免疫与抗体反应评估：使用雌性BALB/c小鼠建立动物模型。将纯化后的rhIFNγ蛋白以三种不同剂量（25、50、100 μg）分别与FCA、RIBI佐剂或FIA等体积混合，免疫不同组别的小鼠。设立PBS对照组。按不同时间间隔进行加强免疫，并定期采集血清。
- 4.
免疫学检测与分析：采用间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中抗rhIFNγ抗体的水平（效价）。通过GraphPad软件进行统计分析，比较不同佐剂和剂量组间抗体反应的差异。
三、 研究结果
1. 成功构建表达载体与筛选高表达菌落
经密码子优化后，人IFN-γ基因的密码子适应指数（CAI）从约0.63提高至约0.92，GC含量从39%提升至44.71%。转化后，通过SDS-PAGE和抗-His标签的Western blot验证，成功筛选出表达量最高的菌落（菌落4）用于后续研究。
2. 确定重组人干扰素-γ表达的最佳条件
研究确定rhIFNγ的最佳表达条件为：使用0.6 mM IPTG诱导，在37°C、250 rpm的摇床中培养4小时。在此条件下蛋白表达量最高，延长诱导时间或降低诱导温度（20°C过夜）均导致产量下降。
3. 确定重组人干扰素-γ的表达形式
SDS-PAGE分析显示，rhIFNγ主要在大肠杆菌的包涵体中以不溶性形式表达，因此确定后续纯化应在变性条件下进行。
4. 确定重组人干扰素-γ纯化的最佳条件
研究人员评估了多种纯化方案。结果发现，单纯改变pH进行洗脱的变性纯化方案产量高但纯度低。在洗涤缓冲液中增加咪唑浓度（最高至60 mM）可以提高蛋白纯度，但会降低蛋白产量。在洗脱缓冲液中测试不同咪唑浓度（100-700 mM）对蛋白产量无显著影响。最终优化的方案是：使用含60 mM咪唑的洗涤缓冲液和含400 mM咪唑的洗脱缓冲液进行大规模纯化，透析后最终蛋白产量为1640 ± 123 μg/mL，经SDS-PAGE和Western blot验证获得了纯化的目标蛋白。
5. 各组抗体浓度分析
所有测试的佐剂均能引发免疫反应，而对照组无此反应。抗体反应强度因剂量和佐剂类型而异。统计分析表明，加强免疫次数和抗原浓度对抗体水平有显著影响。
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弗氏完全佐剂（FCA）组：在整个研究期间产生的相对抗体水平最高，100 μg剂量组抗体滴度最高，其次为50 μg和25 μg组。但该组小鼠出现了肿胀、疼痛、形成肿块和注射部位疤痕等明显的局部不良反应。
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RIBI佐剂组：100 μg剂量产生的抗体水平最高。重要的是，在两次加强免疫后，用100 μg rhIFNγ混合RIBI佐剂免疫的小鼠，与用100 μg rhIFNγ混合FCA免疫的小鼠相比，产生的相对抗体水平无统计学显著差异。且该组未观察到不良反应。
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弗氏不完全佐剂（FIA）组：产生的初始免疫反应较弱，但经过多次加强免疫后，抗体水平显著提高。100 μg剂量组抗体水平最高。
总体而言，在所用剂量下，FCA产生的抗体反应最高，其次是RIBI，然后是FIA。100 μg剂量产生的抗体反应性最高，其次是50 μg，然后是25 μg。
四、 讨论与结论
在讨论部分，研究人员对本研究的发现进行了深入分析。密码子优化通过适应大肠杆菌的密码子偏好，有效提高了rhIFNγ的表达水平。研究确定的表达条件与相关文献报道一致。目标蛋白在包涵体中表达是高水平表达的常见结果，通过变性纯化和复性策略可以有效处理。在纯化中，咪唑浓度的优化是平衡纯度和产量的关键，低浓度洗涤可去除非特异性杂质，高浓度洗脱可有效回收目标蛋白，这与标准的固定化金属亲和色谱操作指南相符。
关于佐剂评价，结果证实了佐剂选择强烈影响抗体反应的强度和不良反应的发生。FCA虽然免疫增强效果最强，但其伴随的严重炎症反应限制了其常规使用。FIA免疫原性较低，但通过多次加强免疫可显著提高抗体水平，是关注动物福利时的一个可行替代方案。本研究的核心发现是，RIBI佐剂在两次加强免疫后，引发的抗体反应水平与FCA相当，且副作用显著更少。这表明RIBI佐剂在安全性和高效免疫原性之间取得了良好平衡，是高质量抗体生产中一个更优的选择。
基于以上研究，研究结论如下：该研究表明，蛋白表达产量受时间、温度影响，且咪唑在纯化中可作为竞争性洗脱剂去除污染物。尽管有报道称FCA可产生最高的抗体滴度，但同时伴有轻度至重度副作用，但在本研究中，用100 μg rhIFNγ与FCA混合免疫的小鼠组，与用100 μg rhIFNγ与RIBI佐剂混合免疫的小鼠组之间，所产生的相对抗体水平无显著差异。
