通过机器学习优化的PNA/SWCNT混合电化学平台，用于特异性定量检测蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）

《Bioelectrochemistry》：PNA/SWCNT hybrid electrochemical platform optimized by machine learning for species-specific quantification of Bacillus cereus

本研究开发了一种基于机器学习优化的PNA-碳纳米管复合电化学生物传感器，实现对巴氏杆菌（Bacillus cereus）的高灵敏检测（检测限0.3 ng/μL），并成功应用于复杂基质（饮用水和牛奶）中，展现出优异的稳定性和特异性。

　　

Kittiya Sakdaphetsiri | Tirayut Vilaivan | Joseph Wang | Nadnudda Rodthongkum | Wiwittawin Sukmas

泰国曼谷朱拉隆功大学理学院物理系

摘要

快速检测食源性病原体对公共卫生至关重要。本文报道了一种基于机器学习（ML）优化的肽核酸（PNA）电化学生物传感器，该传感器能够灵敏且特异性地检测Bacillus cereus。该生物传感器平台通过将碳纳米管（SWCNT-COOH）功能化到丝网印刷碳电极上来提高导电性和探针负载能力。随后，将一种与motB基因互补的特异性PNA探针固定化以捕获目标DNA。一项关键创新是使用ML模型系统地优化了关键制造和操作参数，包括SWCNT浓度、PNA密度和施加电位，从而大幅简化了开发过程。在优化条件下，该生物传感器通过铁氰化物电流信号（< />）的浓度依赖性降低来检测目标DNA，检测时间为180秒。其检测限（LOD）低至0.3 ng/μL，稳定性优异（持续两周），并在复杂样品中表现出可靠性能：在饮用水中的回收率为78–105%，在牛奶中的回收率为90–111%。这项工作建立了一种稳健的、由ML指导的生物传感策略，结合了PNA的亲和力和纳米材料的增强转导能力，为食品安全监测提供了一个强大且实用的平台。

引言

Bacillus cereus是一种普遍存在的革兰氏阳性、能形成孢子的细菌，可在多种环境中繁殖，包括土壤和各种食品基质，如谷物、蔬菜、乳制品和加工食品[1]、[2]、[3]。它在食品加工和储存过程中的持久性主要归因于其适应性代谢和热稳定毒素的分泌[2]、[4]。这些特性不仅使食品安全管理变得复杂，还带来了重大的公共卫生风险，表现为腹泻和呕吐综合征[4]、[5]、[6]、[7]。因此，食品和农业领域迫切需要能够高灵敏度、快速且物种特异性地检测B. cereus的检测系统[8]、[9]、[10]、[11]。 尽管现有检测技术很重要，但仍存在局限性。基于培养的检测方法（如在琼脂平板上计数菌落）仍然是“金标准”，但它们劳动强度大且需要几天时间才能得出明确结论[12]、[13]、[14]。分子方法（包括PCR和qPCR）提供了更高的速度和准确性；然而，它们需要专用设备、专业人员，并且常常难以区分B. cereus与其密切相关的其他芽孢杆菌物种[6]、[15]。在这种情况下，电化学生物传感器通过结合高灵敏度和低成本以及便携式、实时分析的潜力，提供了一个有前景的替代方案[14]、[16]、[17]。此外，为了准确评估关键分析参数（如PNA与motB基因的杂交效率以及无PCR格式下的内在检测限），将传感步骤与细胞裂解和DNA提取协议相关的固有变异性分离出来至关重要。通过直接在复杂的实际样品中检测未扩增的基因组DNA，我们解决了电化学生物传感中最具挑战性的问题之一。这一成就证明了该平台的实际应用价值。这种方法使用基因组DNA在复杂样品中验证传感器性能，为完整系统集成奠定了基础，这是电化学诊断领域中一种成熟且被广泛接受的方法[18]、[19]。 电极表面的结构对生物传感器的性能至关重要。碳纳米管（CNTs）由于其优异的导电性、高有效表面积和促进快速电子转移的能力而成为首选的电极修饰剂[20]。特别是，用羧基（SWCNT-COOH）进行功能化可以提高分散性和化学稳定性，同时为生物分子的共价固定提供坚固的支架，从而提高检测平台的灵敏度和耐用性[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。除了换能器外，生物识别元件的选择对特异性也至关重要[26]。肽核酸（PNAs）是一种具有中性肽样骨架的合成DNA类似物，与天然寡核苷酸相比具有显著优势，包括更高的杂交亲和力和更好的酶稳定性。值得注意的是，引入吡咯烷环作为构象约束导致了吡咯烷基PNAs的发展，这类PNAs表现出卓越的单碱基错配识别能力[6]、[15]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。这种精确性对于检测B. cereus至关重要，因为相关物种之间的遗传同源性常常会导致假阳性结果。 在这项工作中，我们将先前用于定性纸基检测的motB靶向吡咯烷基PNA探针与SWCNT-COOH修饰的平台结合，创建了一种定量电化学生物传感器。这种协同作用将PNA的高特异性与纳米材料的高表面积带来的信号放大效果相结合[26]。生物传感器开发中的一个关键挑战是制造和分析参数的优化，这一传统上资源密集的过程依赖于试错。机器学习（ML）通过从有限的实验数据集中提取预测性见解，实现了数据驱动的优化[32]、[33]、[34]。在这里，我们使用ML模型来导航复杂的参数空间，包括SWCNT和PNA浓度、杂交时间和施加电位，大大缩短了开发时间和试剂消耗，同时提高了分析性能。 我们提出了一种基于PNA的电化学生物传感器，用于定量检测乳制品和饮用水中的B. cereus，并通过ML辅助设计进行了优化。motB基因衍生的PNA探针的创新性在于采用了无标记格式，并使用了[Fe(CN)₆^3?/4-氧化还原报告剂。通过将ML与超灵敏的分子识别技术结合，我们提高了食品行业便携式生物传感的可行性。我们的结果不仅展示了一种新的传感架构，还推进了用于稳健病原体监测的核酸-纳米材料混合系统的发展。

化学和材料

丝网印刷碳电极（SPE）购自泰国Quasense有限公司。COOH功能化的SWCNTs纯度>90%，CAS# 99685–96-8，购自美国德克萨斯州休斯顿的US Research Nanomaterials公司。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆）、亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆）和磷酸盐缓冲盐水片剂购自美国圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。

表面形态和EIS表征

基于PNA的生物传感器的制造是实现特异性捕获目标B. cereus DNA的关键步骤。商用丝网印刷碳电极（SPE）通过滴涂法用SWCNT-COOH进行了修饰。-COOH基团首先用EDC/NHS活化，然后通过酰胺键形成固定PNA。电极的表面形态使用激光扫描显微镜（LSCM）（图1。（A-C））和扫描电子显微镜（SEM）进行了研究。

结论

本文介绍了一种通过机器学习优化的电化学生物传感器，用于快速且特异性地检测Bacillus cereus。该平台将单壁碳纳米管（SWCNTs）与肽核酸（PNA）探针结合在丝网印刷电极上，利用它们的协同效应实现了更高的导电性和出色的核酸亲和力。这种设计产生了高度敏感的检测方法，检测限低至0.3 ng/μL，能够覆盖该病原体的检测范围。

CRediT作者贡献声明

Kittiya Sakdaphetsiri：撰写——原始草稿、可视化、方法论、概念化。 Tirayut Vilaivan：撰写——审阅与编辑。 Joseph Wang：撰写——审阅与编辑。 Nadnudda Rodthongkum：撰写——审阅与编辑、概念化、监督。 Wiwittawin Sukmas：撰写——审阅与编辑、监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

Kittiya Sakdaphetsiri博士和Wiwittawin Sukmas博士感谢Second Century Fund (C2F) 和朱拉隆功大学提供的博士后奖学金支持。作者还要感谢朱拉隆功大学理学院微生物学系的Tanapat Palaga教授在制备全基因组DNA方面的指导和帮助。这项Quick Win研究项目得到了Ratchadapisek Sompoch Fund, Chulalongkorn University的支持。