源自肥大细胞外泌体的miR-329-3p通过靶向ATG10来调节自噬，从而加剧肠道缺血-再灌注损伤

《International Journal of Biological Macromolecules》：miR-329-3p derived from mast cells-exosomes exacerbates intestinal ischemia-reperfusion injury by targeting ATG10 to regulate autophagy

肠缺血再灌注损伤中激活的肠黏膜肥大细胞通过分泌含miR-329-3p的外泌体抑制ATG10自噬相关蛋白，导致自噬功能失调、细胞凋亡加剧和肠屏障破坏，揭示外泌体miRNA介导的分子机制及靶向治疗潜力。

　　

梁彦秋|盛如香|邓欢|黄定邦|徐克欣|王颖|刘德昭

中山大学第五附属医院麻醉科，中国广东省珠海市，519000

摘要

肠道黏膜肥大细胞（IMMCs）的激活和脱颗粒在肠缺血-再灌注（IIR）损伤中起着关键作用。外泌体通过介导细胞间通讯来调节各种生理和病理过程。然而，激活的肥大细胞是否通过外泌体分泌来调节IIR损伤尚不清楚。在本研究中，从假手术组和IIR模型小鼠的IMMCs中分离出外泌体，然后进行微小RNA（miRNA）高通量测序，以鉴定显著改变的miRNA，特别是miR-329-3p。首先，在体外研究了氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理的人类肥大细胞（HMC-1）来源的外泌体（OGD/R-HMC-exo）对Caco-2细胞中OGD/R诱导的损伤的影响。随后，通过生物信息学分析、细胞实验和动物研究探讨了miR-329-3p通过靶向ATG10在IIR损伤中的作用。利用5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）检测、Western blot、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、小干扰RNA（siRNA）、双荧光素酶报告基因检测和流式细胞术进行了机制研究。研究结果表明，外泌体OGD/R抑制了自噬，从而促进了凋亡，最终加剧了Caco-2细胞中的OGD/R损伤。IIR损伤后，IMMCs分泌的外泌体中miR-329-3p水平显著升高。miR-329-3p的上调下调了ATG10的表达，抑制了自噬，损害了自噬流，进而加剧了凋亡，破坏了肠道黏膜屏障的完整性，最终加重了Caco-2细胞中的IIR损伤和OGD/R损伤。这些发现为IIR损伤的预防和治疗提供了新的潜在治疗靶点和理论基础。

引言

肠缺血-再灌注（IIR）损伤是一种常见的临床病理现象，通常发生在腹主动脉瘤手术、出血性休克和急性肠系膜缺血等临床事件之后[1]，[2]。它不仅会导致肠道损伤，还会导致远端器官损伤，在严重情况下可能危及生命[3]，[4]。其根本机制在于肠道组织在缺血一段时间后无法在血液再灌注时恢复功能；相反，功能损伤和结构损伤会加重[5]。IIR损伤的病理生理学机制复杂，有效的治疗策略仍然有限[6]。许多研究表明，包括炎症反应、自噬和氧化应激在内的病理生理反应在IIR损伤中起着关键作用[3]，[7]，[8]。

自噬是维持细胞稳态的重要机制，其失调会导致多种疾病[9]，[10]。在IIR损伤中，适度的自噬激活可以减轻氧化应激和炎症反应，保护肠道屏障功能，并减轻组织损伤。相反，过度的自噬或自噬功能受损会促进细胞死亡，放大炎症和氧化损伤，从而加重组织损伤[11]，[12]，[13]。

肠道黏膜肥大细胞（IMMCs）是肠道黏膜中最活跃的免疫细胞之一。许多研究表明，IIR损伤后，IMMCs会被激活并脱颗粒，释放组胺和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等介质，从而导致肠道黏膜屏障功能障碍[14]，[15]，[16]，[17]。然而，其潜在机制仍然复杂，并与自噬密切相关，其精确的调控作用尚未完全阐明[18]，[19]。

外泌体是直径介于30至150纳米之间的内源性膜结合囊泡。研究表明，外泌体在细胞间信号传导中起着关键调节作用，并在各种生理和病理过程中发挥重要作用[20]。它们有助于将信号分子（如微小RNA（miRNAs）传递给受体细胞，从而调节细胞功能。miRNAs是一类进化上保守的非编码小RNA，可调节许多靶基因，影响细胞发育、增殖、分化和凋亡等基本生物过程[21]。值得注意的是，已有研究报道miR-185-5p和miR-665-3p通过靶向自噬相关基因来减轻IIR损伤[7]，[22]。然而，其他miRNAs是否参与IIR损伤的调节仍不清楚。

基于先前的研究，本研究首先证实了来自氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理的肥大细胞的外泌体会通过自噬加剧IIR损伤。随后进行了外泌体miRNA测序，以鉴定差异表达的miRNAs，并选择了miR-329-3p进行进一步研究。该研究进一步探讨并验证了miR-329-3p是否通过自噬影响IIR损伤，并阐明了其机制作用。

动物

从珠海Bestest Biotechnology有限公司购买了6-8周大的特定病原体免费（SPF）雄性C57BL/6小鼠。小鼠被饲养在温度（24-25°C）和湿度（55%）受控的环境中，遵循12小时光照/黑暗周期，可自由获取食物和水。所有动物实验均获得了中山大学第五附属医院（中国珠海）动物伦理委员会的批准（批准号00469）。所有动物实验均在该机构进行。

外泌体的分离和表征

分离和纯化的外泌体通过透射电子显微镜（TEM）、NTA和Western blot检测标记蛋白进行了表征。TEM结果显示，来自肥大细胞的外泌体具有典型的杯状膜囊泡形态（图1A）。NTA结果显示，它们的大小主要集中在130纳米左右（图1B）。Western blot结果显示，与细胞裂解液蛋白组相比，外泌体中的阳性标记蛋白...

讨论

IIR损伤的特点是发病隐匿且病理生理机制复杂，常常导致多器官功能障碍，这突显了迫切需要明确的治疗策略[33]，[34]，[35]。外泌体作为封装多种生物分子的囊泡结构，在各种病理生理过程中发挥着关键作用[20]，[36]，[37]。本研究发现，在IIR损伤期间，IMMCs分泌含有高水平miR-329-3p的外泌体。这些...

结论

总之，本研究发现，在IIR损伤期间，来自肥大细胞的外泌体上调miR-329-3p，后者抑制ATG10的表达，从而抑制自噬。这进而加剧了凋亡，损害了肠道屏障功能，最终加重了IIR损伤。针对活化肥大细胞来源的外泌体中的miR-329-3p的靶向治疗可能成为IIR损伤的新治疗途径。

缩写

ATCC
美国类型培养物收集中心
ATG10-MUT
含有突变ATG10序列的GP-miRGLO双荧光素酶质粒
ATG10-WT
含有野生型ATG10序列的GP-miRGLO双荧光素酶质粒
BCA比色酸
BMSCs
骨髓间充质干细胞
BP生物过程CC细胞成分CCK-8细胞计数试剂盒-8CM条件培养基CQ氯喹DAPI4′,6-二氨基-2-苯基吲哚DMEMDulbecco改良Eagle培养基EdU5-乙炔基-2-脱氧尿苷exo-NC组Caco-2细胞共培养

CRediT作者贡献声明

梁彦秋：撰写——原始草案、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。盛如香：可视化、验证、方法学、数据分析、数据管理。邓欢：方法学、研究。黄定邦：方法学。徐克欣：研究。王颖：监督、项目管理。刘德昭：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、项目管理、资金争取、概念化。

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

所有涉及小鼠的实验均按照中山大学第五附属医院动物伦理委员会批准的方案进行。本研究未涉及人类参与者、人类数据或人类组织。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82070542）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。