通过调节NF-κB信号通路和肺部炎症中的巨噬细胞极化，设计含有甘草素的壳聚糖纳米凝胶以用于肺部免疫调节

《International Journal of Biological Macromolecules》：Engineering of glycyrrhizin-loaded chitosan nanogel for pulmonary immunomodulation via regulation of NF-κB signaling and macrophage polarization in lung inflammatory

甘草酸负载壳聚糖纳米凝胶通过抑制NF-κB信号通路和调节巨噬细胞极化显著改善急性肺损伤炎症反应，其分子动力学模拟证实结构稳定性，体外显示高效胞摄取和抗炎活性，体内实验证实降低MPO活性并改善病理损伤，为慢性肺炎症治疗提供新策略。

　　

刘彦军|马赫尔·阿卜杜勒拉扎克·阿尔-哈基姆|亚西尔·卡西姆·阿尔马吉迪|艾哈迈德·亚辛

中国张家口河北北方大学

摘要

急性肺损伤涉及过度炎症、中性粒细胞浸润和巨噬细胞极化的受损，这突显了有效免疫调节疗法的必要性。在这里，我们开发了一种载有甘草苷的壳聚糖纳米凝胶（GlyU@CS），作为靶向调节肺部炎症的生物相容性大分子平台。分子动力学模拟验证了该纳米凝胶在生理条件下的结构稳定性。理化分析证实了其纳米级尺寸（57 nm）、正电荷（+24.8 ± 1.7 mV）、非晶结构以及高效的甘草苷负载能力。体外黏附实验显示与黏蛋白之间存在强烈的静电相互作用，表现为流体动力学直径的增加（145.3 → 257 nm）和ζ电位的降低（+24 → +8.7 mV），同时具有显著的流变协同效应，共同表明了黏液保留能力的增强。细胞研究表明其溶血作用极小（<2%），吸收效率高，并且与游离甘草苷相比，细胞内活性氧（ROS）显著减少。在LPS刺激的小鼠细胞中，GlyU@CS显著抑制了促炎细胞因子的表达（无论是mRNA水平还是蛋白质水平）。在LPS诱导的急性肺损伤模型中，该纳米凝胶显著减轻了炎症，包括MPO活性从2.5 mU/mg降至1 mU/mg，中性粒细胞浸润减少，以及明显的组织病理学改善。从机制上讲，纳米凝胶通过抑制NF-κB信号通路、减少COX-2和iNOS活性以及恢复IκB-α来发挥强烈的抗炎作用。流式细胞术进一步证实巨噬细胞极化从促炎型M1向抗炎型M2转变了7.5倍。总体而言，GlyU@CS作为一个强大的免疫调节系统，结合了黏附递送与炎症和巨噬细胞极化的分子调控，展示了基于壳聚糖的纳米凝胶在治疗急性肺炎症疾病方面的潜力。

引言

炎症性肺疾病，包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘和急性肺损伤，是全球主要的健康负担，每年导致数百万人住院，并显著影响患者的生活质量[1]。这些疾病的特征是持续的气道炎症、过多的黏液产生、氧化应激、上皮损伤以及先天性和适应性免疫反应的失调。尽管皮质类固醇和靶向生物制剂仍是当前治疗的核心，但其长期使用常常受到全身不良反应、高成本、患者依从性差以及无法恢复免疫稳态的限制。因此，迫切需要新的治疗策略，不仅能够抑制过度炎症，还能促进黏膜愈合、增强局部药物吸收，并在慢性治疗期间支持患者的持续依从性[2]。

中医（TCM）提供了丰富的植物药资源，这些资源几个世纪以来一直被用于呼吸系统疾病的管理。在整体治疗理念的指导下，许多中药在分子和细胞水平上表现出多效生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗病毒和免疫调节作用。其中，甘草苷（GlyU）已被广泛用于肺部和上呼吸道疾病[3]。经典医学文献如《神农本草经》以及现代药理学研究将甘草苷描述为具有“补气”、解毒、止咳、清除黏液和增强多种草药配方的协同作用的药物[4]。植物化学研究鉴定了关键的生物活性成分，包括甘草苷、甘草素和黄酮类化合物，它们能够抑制促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α，TNF-α），抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，调节氧化应激，并影响巨噬细胞和树突状细胞的极化[5]、[6]。这些特性使甘草苷成为解决与慢性肺疾病相关的炎症和免疫失衡问题的有希望的候选物质。

尽管甘草苷具有治疗潜力，但其临床转化仍受到制剂相关限制的阻碍。传统的口服剂型，如煎剂或粉末，通常由于黄酮类成分的水溶性差、味道过甜或苦涩而影响长期依从性，以及由于在胃肠道中的快速降解或代谢而导致不良的药代动力学[7]。此外，极性和两亲性植物化学物质的黏膜屏障渗透性有限，限制了生物利用度，特别是在需要长期给药的慢性疾病中，导致治疗效果不稳定。

纳米医学提供了克服这些挑战的有希望的策略，特别是通过纳米级药物递送系统。纳米凝胶是一种三维交联的聚合物网络，具有纳米级尺寸和高水分含量，能够通过物理包裹、静电相互作用或氢键稳定亲水、疏水性和两亲性治疗剂[8]、[9]。当被设计成黏附剂型时，纳米凝胶可以通过加入阳离子聚合物（如壳聚糖及其衍生物）附着在呼吸系统或胃肠道黏膜的黏液层上。这种延长的黏膜驻留时间可以对抗快速的黏液纤毛清除，增强局部吸收，并实现持续和可控的药物释放。此外，黏附性纳米凝胶可以根据pH值、温度或酶刺激进行设计，从而实现定位释放，同时最小化脱靶效应[10]。在这些系统中，壳聚糖/β-甘油磷酸酯（CS/β-GP）纳米凝胶因其良好的流变特性、生物相容性和在生理温度下的热敏凝胶化而受到越来越多的关注[11]。这些制剂可以作为低粘度溶液给药，并在接触黏膜时发生原位凝胶化，形成稳定的药物库，控制封装货物的逐步释放。对于黄酮类和皂苷等天然化合物，纳米凝胶封装可以保护易降解的植物化学物质免受酸性或酶的破坏，提高溶解度，改善味道，并在长时间内维持治疗浓度[12]。与此概念一致，载有没食子酸的壳聚糖纳米凝胶表现出强烈的黏附性、pH响应性膨胀和持续释放，使其适合将生物活性化合物递送到发炎的肺组织中[13]。

因此，将甘草苷与基于壳聚糖的纳米凝胶结合是一种合理且多功能的治疗策略，用于炎症性肺疾病。除了作为保护性载体外，纳米凝胶平台还能有效掩盖甘草的强烈味道，提高适口性并支持长期依从性。封装还可以减缓甘草苷的初始快速释放，从而持续抑制炎症介质（如TNF-α），同时减少全身性副作用，包括高血糖或类盐皮质激素并发症[14]。

从免疫学角度来看，这种纳米植物疗法方法既解决了炎症症状，也解决了慢性肺疾病背后的免疫功能障碍。通过下调TNF-α和下游NF-κB信号通路，GlyU@CS纳米凝胶可以减少过多的中性粒细胞和巨噬细胞募集，减轻黏膜水肿，限制黏液过度分泌，同时促进抗炎细胞因子（如IL-10）的产生，并重新平衡Th1/Th2和Th17/Treg反应[15]。这些效应在黏膜/免疫界面处实现的较高和持续的局部浓度得到了增强，特别是在支气管和远端气道中，那里的上皮/免疫相互作用驱动疾病进展。总体而言，将中药来源的甘草苷与先进的纳米凝胶递送系统相结合，代表了一种协同且具有临床相关性的策略，满足了炎症性肺疾病管理中的关键未满足需求，包括免疫调节、控制释放、增强黏附性和改善患者依从性[16]。在本研究中，开发了用于肺部递送甘草苷的黏附性GlyU@CS纳米凝胶，旨在克服游离植物化学物质的制剂和生物利用度限制。分子动力学模拟用于阐明纳米凝胶网络内的分子间相互作用和释放机制，指导合理的配方设计。随后进行了全面的体外和体内评估，以评估黏附行为、控制释放、生物相容性和在肺炎症小鼠模型中的抗炎效果。

材料

壳聚糖（CS；分子量：150 kDa）、β-甘油磷酸酯（β-GP）、甲酸和MTT购自Sigma-Aldrich。甘草苷（根据HPLC标准纯度为98%或更高）购自上海Tauto Biotech有限公司（中国上海）。HPLC级乙腈和甲醇购自Honeywell Burdick & Jackson（韩国蔚山）。使用Milli-Q梯度去离子水系统（Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）获得超纯去离子水。所有其他化学品和溶剂均为分析级

结果与讨论

DLS测量结果显示（图2a-d），载有甘草苷的CS纳米凝胶的平均流体动力学直径为149.3 ± 4.6 nm，PDI为0.12 ± 0.01；而游离纳米凝胶的PDI为0.11 ± 0.02，平均流体动力学直径为142.1 ± 5.3 nm。小尺寸分布反映了颗粒的均匀形成和高胶体稳定性，这些尺寸适用于生物医学应用[23]、[24]。游离和GlyU@CS纳米表面的电荷均为+26.4 ± 1.3 mV

结论

在本研究中，成功开发了一种黏附性的基于壳聚糖的纳米凝胶，以增强甘草苷治疗急性肺炎症的效果。分子动力学模拟和理化表征证实了其结构稳定性、强烈的分子间相互作用以及甘草苷在壳聚糖基质内的高效封装，从而实现了持续释放。该纳米凝胶系统表现出良好的血液相容性和高细胞相容性，并且

CRediT作者贡献声明

刘彦军：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理，概念构思。马赫尔·阿卜杜勒拉扎克·阿尔-哈基姆：方法学，研究，资金获取，正式分析。亚西尔·卡西姆·阿尔马吉迪：撰写——审阅与编辑，验证，监督，软件。艾哈迈德·亚辛：监督，软件，资源，项目管理。

伦理批准

本研究中的所有实验均遵循相关指南和规定进行，或符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。所有参与者（包括患者和参与研究的儿童的父母或法定监护人）均获得了知情同意。研究团队声明仅使用ChatGPT Pro来提高手稿的写作质量和语言清晰度，而

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作部分得到了Al-Nahrain大学和河北北方大学的资助。

数据和材料的可用性

作者确认支持本研究结果的数据在文章中可供查阅。