通过底物特异性工程改造亮氨酸脱氢酶，实现芳香族L-同苯丙氨酸的高效合成

《International Journal of Biological Macromolecules》：Substrate specificity engineering of leucine dehydrogenase for efficient synthesis of aromatic L-homophenylalanine

本研究通过四轮空间位阻改造，成功将Bacillus subtilis LeuDH的底物特异性扩展至芳香族α-酮酸，最优突变体M3–2（L40V/A113G/V294G）对2-OPBA的催化效率提升438倍，且该策略在五种同源LeuDH中普适，实现L-HPA制备STY达215g/L·h，产率>99%ee。

　　

卢 Zhao|文音星|文和张|刘琦|唐丽春|陈娟杰|高晓|贾茜|宋幽

沈阳药科大学生命科学与生物制药科学学院，中国沈阳市沈河区文华路103号，110016

摘要

亮氨酸脱氢酶（LeuDH）催化的α-酮酸不对称还原胺化是一种合成L-氨基酸的有前景的方法。然而，其严格的底物特异性限制了其在脂肪族氨基酸合成中的应用。在这项研究中，我们对枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶（BsLeuDH）进行了底物特异性工程改造，以生产大体积芳香族L-同苯丙氨酸（L-HPA）。通过四轮迭代的空间位阻减弱口袋改造，我们获得了五种能够接受非天然前体2-氧代-4-苯基丁酸（2-OPBA）的活性突变体。最佳突变体M3–2（L40V/A113G/V294G）对2-OPBA的催化效率提高了438倍（k_cat/K_m），并且底物偏好转向了大体积芳香族α-酮酸。制备规模的合成实验证实了其生产L-HPA的潜力，实现了215.0?g/L?h的空间时间产率（STY）和超过99%的ee值。分子对接和分子动力学（MD）模拟表明，M3–2中的突变扩大了底物结合口袋并改善了构象转变效率，从而有助于2-OPBA大芳香基团的容纳和预反应态的形成。更重要的是，将M3–2突变引入五个与BsLeuDH有64%–87%同源性的LeuDH中，同样增强了其对2-OPBA的接受能力，进一步揭示了这种空间位阻减弱策略在改变LeuDH底物特异性方面的普适性。

引言

对映体纯的非天然氨基酸是具有广泛应用的生物活性分子，在制药、农化、食品和精细化工行业中具有重要意义[1]、[2]、[3]。例如，L-同苯丙氨酸（L-HPA）是合成血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂[4]、[5]、[6]和蛋白酶体抑制剂卡非佐米[8]的关键构建块。因此，已经开发了多种非天然氨基酸合成方法[9]、[10]、[11]、[12]。其中，氨基酸脱氢酶（AADH）介导的α-酮酸不对称还原胺化被认为是一种最有前景的策略（图1A），因为它具有高原子经济性和严格的立体选择性[10]、[13]、[14]、[15]、[16]，这与传统的化学催化方法不同。迄今为止，已经从细菌、真菌和宏基因组中鉴定出许多AADH，并将其分类为不同的亚类[3]、[10]、[17]、[18]。例如，苯丙氨酸脱氢酶（PheDH）、亮氨酸脱氢酶（LeuDH）和谷氨酸脱氢酶（GluDH）分别特异性催化芳香族α-酮酸、脂肪族（直链和支链）α-酮酸以及α-酮戊二酸（α-KG）的还原胺化[19]、[20]、[21]、[22]。然而，由于天然AADH的严格底物特异性，它们在非天然氨基酸的不对称合成中的应用受到了限制。

近年来，计算策略和AI驱动工具的显著进步催生了多种工程策略，包括结构引导的重设计、蛋白质语言模型（PLMs）和从头设计[23]。这些方法极大地促进了AADH底物特异性的重新编程（图1B），产生了多种用于合成非天然氨基酸的工程突变体。通过改造底物结合口袋，郑、曾和杨的团队提高了GluDH对极性取代底物2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基]-丁酸（PPO）的接受能力[24]、[25]、[26]、[27]。同样，吴及其同事重新设计了BbPheDH以高效生产L-HPA[28]。穆、郑和罗的团队开发了一系列LeuDH突变体来合成脂肪族非天然氨基酸，如L-叔-亮氨酸和L-2-氨基丁酸[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。然而，这些研究仅限于将AADH适应于结构相似的非天然底物。从根本上改变AADH原始底物特异性的工程案例（例如，从脂肪族到芳香族或从非极性到极性）极为罕见。以L-HPA的不对称合成为例，大多数现有的生物催化剂都来源于具有芳香族底物偏好的PheDH，包括BsPheDH[34]、RsPheDH[7]、BbPheDH_{V309G/L306V/V144G}[28]和TiPheDH_W14[5]。相比之下，从偏好脂肪族的GluDH或LeuDH开发的工程生物催化剂仍然非常稀少[3]、[8]、[35]。此外，获得的突变体对L-HPA的前手性酮酸2-氧代-4-苯基丁酸（2-OPBA）的催化活性较低（表S1），与野生型酶对其天然底物的活性相比。因此，需要进一步的底物特异性工程改造，以扩展实际可用的AADH工具箱用于非天然氨基酸合成，并阐明AADH底物识别的分子机制。

在这项研究中，我们对枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶（BsLeuDH）进行了底物特异性工程改造——这种酶优先接受脂肪族底物——用于芳香族L-HPA的生物催化合成（图1C）。在结构洞察的指导下，我们精确调节了远端底物结合口袋残基（L40、A113、E114、T134、V291、V294）的空间位阻。经过四轮“小而聪明”的突变库筛选，获得了优越的突变体M3–2（L40V/V294G/A113G），其对2-OPBA的催化效率提高了438倍（k_cat/K_m）。分子对接和分子动力学（MD）模拟进一步阐明了突变体M3–2对2-OPBA催化性能提升的结构和动态机制。随后，为了验证这种空间位阻减弱策略的普适性，我们将M3–2突变引入了五个其他与BsLeuDH有64%–87%同源性的LeuDH同源物中。所有变体对2-OPBA的活性都有显著提高（50–1926倍）。最后，通过系统条件优化和共表达技术，使用共表达BsLeuDH-M3–2和BsGDH的全细胞生物催化剂从2-OPBA制备了L-HPA，实现了215.0?g/L?h的空间时间产率（STY）。

材料

所有化学试剂和HPLC溶剂均购自Bidepharm（中国天津）、Leyan（中国上海）和Energy Chemical。本研究中使用的宿主菌株大肠杆菌 BL21（DE3）和表达质粒pET28a（+）、pET-Duet-1均为实验室保存的。生化试剂，包括DNA纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、Pfu DNA聚合酶和限制性内切酶，购自Tiangen（中国北京）、Sangon Biotech（中国上海）和Novizan（中国南京）。

对接和突变位点鉴定

考虑到目标底物2-OPBA同时含有长脂肪链和苯环，我们选择了之前表征过的枯草芽孢杆菌的LeuDH（BsLeuDH）[36]、[40]作为工程候选菌，利用其已知的底物广谱性和可控的底物结合口袋。此外，为了更好地指导BsLeuDH对2-OPBA的不对称还原胺化工程，预测了BsLeuDH与NADH复合物的三维结构

结论

总结来说，我们通过精确调节BsLeuDH底物结合口袋内的空间位阻，成功将其底物特异性从偏好脂肪族底物转变为偏好大体积芳香族底物，对2-OPBA的催化效率提高了438倍（k_cat/K_m），起始水平接近零。利用优化的BsLeuDH-M3–2突变体，实现了高效的L-HPA制备，空间时间产率为215.0?g·L^?1·h^?1，ee值超过99%。

CRediT作者贡献声明

卢 Zhao：撰写——原始草稿、可视化、软件开发、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。文音星：撰写——审稿与编辑。文和张：监督。刘琦：验证。唐丽春：资源提供。陈娟杰：可视化。高晓：软件开发。贾茜：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。宋幽：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32271328）的支持。