《International Journal of Biological Macromolecules》：Vanillin-grafted chitosan biopolymers via nucleophilic addition–elimination: A promising bioactive biopolymer for enhanced skin wound repair
编辑推荐：
香兰素-壳聚糖接枝材料 CSV100/200 显著促进体外和体内伤口愈合，其多孔结构、低粘度及高抗氧化抗菌活性源于香兰素与壳聚糖的Schiff碱交联。
作者名单：Heba Abdelmegeed、Naiera M. Helmy、Ayman M.A. Hassan、Mohamed S. Abdel-aziz、Ahmed K. Elziaty、Samir Kamel、Zifu Li、Q. Wang、Naglaa Salem EL-Sayed
埃及吉萨国家研究中心药物与制药工业研究所天然化合物化学部门，邮编12622
摘要
提高生物材料的抗菌和抗氧化性能是开发用于生物医学应用的先进生物活性支架的核心目标。在这项研究中，我们提出了一种将香兰素结构引入壳聚糖的新方法，通过将其与乙基(Z)-2-氰基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸酯（V2）偶联，得到了一系列改性的壳聚糖生物聚合物，分别命名为CSV50、CSV100和CSV200，其取代度分别为66.8%、72.4%和74.5%。结构表征证实了V2成功接枝到壳聚糖主链上。扫描电子显微镜观察显示形成了连接紧密的多孔网络结构。这些新型改性壳聚糖生物聚合物表现出动态粘度的显著降低以及抗氧化和抗菌活性的提升。使用人成纤维细胞（HFB-4）进行的细胞相容性测试证明了其安全性，CSV100和CSV200均能加速体外伤口愈合。在雄性白化大鼠体内的伤口愈合实验中，使用CSV100或CSV200处理后，伤口面积显著减小，伤口愈合效率达到94.25%。组织学分析表明，CSV200处理组表现出最高的胶原蛋白沉积、肉芽组织形成和最小的炎症反应。总体而言，这些发现表明CSV200是一种具有优异生物活性和结构性能的伤口愈合候选材料。
引言
芳基亚胺是一类合成分子，可以通过芳醛与含有活性亚甲基的化合物在温和条件下直接缩合反应轻松制备，产率较高。由于其多功能性，芳基亚胺被广泛用于各种杂环化合物的合成，其中许多化合物具有显著的抗菌[1]、抗疟疾[2]、抗真菌[3]、抗肿瘤[6]、抗炎[7]和抗氧化[8,9]活性。
香兰素是一种从香荚兰（Vanilla planifolia）种子中提取的酚醛类化合物，该植物最初在墨西哥栽培，现在广泛种植于热带地区。化学上，香兰素被鉴定为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，广泛用于除草剂、洗涤剂、香水、化妆品、药品和食品包装材料的制造。香兰素具有很强的抗氧化和抗炎作用，能够保护细胞免受氧化应激和炎症相关疾病的侵害[10,11]，同时还表现出广谱抗菌特性，能有效抑制细菌、真菌的生长和生物膜的形成[12]。此外，香兰素还显示出抗癌潜力，可通过诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长来发挥作用，这进一步突显了其作为生物医学和制药应用中活性化合物的多功能性[13]。
通过动态席夫碱反应将香兰素功能化到壳聚糖上已成为增强聚合物抗菌活性、抗氧化能力和药物载药效率的有效策略。因此，香兰素交联壳聚糖已在多种生物医学应用中得到广泛研究，特别是在药物递送系统方面[14]。例如，通过乳液法合成了香兰素交联的壳聚糖微球，粒径范围为14.3至48.5微米，这些微球被用作小檗碱的载体，实现了91.61%–74.25%的包封效率，并具有缓释效果。将氟替卡松丙酸酯封装到香兰素偶联壳聚糖乳液中显著增强了其体外释放性能。Rafael等人[15]通过调节聚合物薄膜中香兰素与壳聚糖的交联比例，成功优化了姜黄素的包封和释放行为。在另一项相关研究中，5-氟尿嘧啶被封装到含有不同浓度氧化锌纳米粒子的香兰素交联壳聚糖纳米复合材料中，这种制剂对癌细胞系表现出选择性的细胞毒性（毒性范围为61.4%–69.2%），而对正常细胞的影响很小[16]。
香兰素和壳聚糖的结合特性赋予了材料更好的机械稳定性、生物相容性和可控的生物功能性，使其成为组织工程支架的理想候选材料。体外研究表明，香兰素-壳聚糖微球能有效支持细胞附着、生长和增殖，证实了其作为治疗递送平台的生物相容性和潜力。这些微球还表现出强烈的抗菌活性，并在体外和体内模型中促进了成骨细胞的分化、细胞外基质矿化和骨组织形成[17]。除了组织工程和药物制剂外，它们还被探索作为多功能伤口愈合材料的应用。Kenawy等人[18]使用重复冻融法制备了含有香兰素的聚乙烯醇/壳聚糖/衣康酸水凝胶膜，实现了牢固的物理交联和聚合物链缠结。生物学评估显示，这种水凝胶对HFB-4细胞具有高存活率，并对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出强抗菌活性。Suneetha等人[19]制备了基于聚乙烯醇和亚胺连接的香兰素偶联壳聚糖的水凝胶，含有较高香兰素含量的水凝胶表现出优异的皮肤成纤维细胞存活率、显著的抗氧化活性和强抗菌效果，显示出其在伤口敷料应用中的巨大潜力。
通过纳米纤维素和氧化铜/银纳米颗粒增强壳聚糖-聚乙烯醇膜，并结合香兰素交联，开发出了多功能伤口敷料材料。这些材料具有生物降解性和高细胞存活率（92.30%），同时对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表现出强杀菌活性，抑菌圈分别为16.8±0.7毫米和9.2±0.1毫米[20]。体内评估进一步证实了其出色的伤口愈合性能。
尽管香兰素具有显著的生物活性，但它仅含有一个能够与壳聚糖形成席夫碱键的醛基团，这一结构限制了其生成稳定、机械强度高的三维支架的能力。因此，目前香兰素的应用主要限于微球和水凝胶的交联，而这些材料的机械强度相对较低。为了解决这一问题，Gao等人[21]创新了一种多功能水凝胶，该水凝胶包含壳聚糖、香兰素接枝的聚（丙烯酸-羟乙基甲基丙烯酸酯）和聚[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵。这种混合水凝胶在多种环境条件下表现出优异的自修复能力、强机械粘附性、抗膨胀性和高电导率，使其可作为可穿戴应变传感器使用。
在这项工作中，我们假设通过芳基亚胺连接剂将香兰素结构引入壳聚糖主链（通过亲核加成-消除反应实现），将得到一种结构稳定、多功能性的生物聚合物，具有增强的治疗潜力。这种化学策略旨在克服传统席夫碱偶联方法的固有局限性，从而开发出兼具热稳定性、抗氧化和抗菌活性、细胞相容性和伤口愈合效果的生物活性支架。为了验证这一假设，系统地对其化学组成、结构特征、表面形态和热稳定性进行了表征，并进行了抗菌、抗氧化、细胞毒性以及体外和体内伤口愈合测试。
材料
壳聚糖（CS，分子量400 kDa）购自Alpha Aeser，脱乙酰度为85%。盐酸（36%）和三乙胺（TEA，99%，合成级）购自Merck。乙基氰基乙酸酯（98%）和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛（V1，97%）购自Alpha Aromatic。2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和2,2-二苯基-1-(2,4,6-三硝基苯)肼（DPPH）以及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma。
化学过程
香兰素通过与乙基氰基乙酸酯的Knoevenagel缩合反应合成乙基-2-氰基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸酯（V2）[35]。V2的合成通过FTIR（补充材料图S1）和13C NMR（补充材料图S2）得到验证。所得到的α,β-不饱和产物（V2）进一步与壳聚糖链上的自由氨基进行了一锅法偶联和交联反应[36,37,38]。
结论
香兰素醛与乙基氰基乙酸酯的Knoevenagel缩合成功生成了含有香兰素结构的α,β-不饱和酮（V2），随后将其接枝到壳聚糖上形成新的改性生物聚合物。偶联反应通过酰胺键形成进行，涉及V2的氰基团与壳聚糖主链上的自由氨基的亲核加成，随后发生亲核消除-取代反应。
局限性与未来工作
- 当前研究未测定材料的流变行为或粘附强度，未来的研究将量化流变参数，并探索将其制备成独立薄膜或与生物相容性聚合物（如PVA）的复合材料。
- 细胞相容性仅在中人成纤维细胞（HFB-4）中进行了测试，未来评估将包括角质形成细胞、内皮细胞和免疫细胞，以更好地反映组织的复杂性。
- 当前研究主要关注急性伤口愈合效果。
CRediT作者贡献声明
Heba Abdelmegeed：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、方法学设计、实验实施。
Naiera M. Helmy：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、方法学设计、实验实施。
Ayman M.A. Hassan：撰写、审稿与编辑、数据验证、方法学设计、实验实施、概念构思。
Mohamed S. Abdel-aziz：撰写、审稿与编辑、数据验证、方法学设计、实验实施。
Ahmed K. Elziaty：撰写
伦理批准
细胞实验遵循当地伦理委员会批准的方案进行，具体批准编号为（04130524），由吉萨国家研究中心医学研究伦理委员会颁发。
所有体内实验均严格遵循埃及吉萨国家研究中心医学研究伦理委员会批准的伦理指南（批准编号04130524）进行。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写过程中，作者使用了Copilot工具进行文本校对。所有由该工具生成的内容均经过作者的审核和编辑，作者对最终发表的文章版本负全责。
关于利益冲突的声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
