新型“prime-pull”异源mRNA-ChAdOx1疫苗策略通过靶向肺组织驻留记忆T细胞增强结核病疫苗效力

《Frontiers in Immunology》：Enhancing tuberculosis vaccine efficacy with a heterologous mRNA-ChAdOx1 prime-pull strategy targeting lung-resident memory T cells

为应对卡介苗对成人肺结核保护力有限且不稳定的挑战，研究人员开展了一项利用异源mRNA-ChAdOx1疫苗平台（靶向结核分枝杆菌抗原PPE15）结合“prime-pull”（系统性启动-黏膜加强）策略的研究。结果表明，该策略，特别是BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15序贯免疫，可有效诱导肺实质内PPE15特异性CD4+/CD8+组织驻留记忆T细胞（TRM）样细胞，并在小鼠模型中实现对结核分枝杆菌（M.tb）的显著保护，为开发下一代结核病疫苗提供了新策略。

　　

结核病（Tuberculosis, TB）至今仍是全球面临的重大公共卫生威胁，每年导致上百万人死亡。目前唯一广泛使用的卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin, BCG）在儿童中能有效预防重症结核病，但对成人中最常见的肺结核保护力却有限且不稳定。为了填补这一空白，科学家们一直在不懈努力，试图开发出比卡介苗更有效的疫苗。然而，这条路充满挑战，其中一大难题是如何让疫苗诱导出的免疫细胞，特别是能够精准识别并杀灭病原体的T细胞，准确地“奔赴”并长期“驻扎”在结核病的主要战场——肺部。

传统疫苗策略，无论是同一种疫苗重复接种（同源接种），还是系统性地给予不同疫苗，往往难以在肺部深处诱导出强大的、持久的免疫“驻军”。这就像空有精兵强将，却无法有效部署到前线要塞。针对这一困境，牛津大学的研究团队提出了一种巧妙的“先遣军+向导”联合策略，并在《Frontiers in Immunology》上发表了他们的研究成果。他们的设想是：首先利用信使核糖核酸疫苗（mRNA疫苗）强大的“动员”能力，在全身（肌肉注射）启动针对结核分枝杆菌关键抗原PPE15的T细胞免疫应答，建立一支强大的“先遣军”。紧接着，利用一种经过改造的腺病毒载体疫苗（ChAdOx1）的“导向”特性，通过鼻腔黏膜给药的方式，将这支“先遣军”精准“吸引”并引导至肺部深处，使其转变为长期驻守的“卫戍部队”，即组织驻留记忆T细胞。这种结合了不同疫苗平台和不同接种途径的“prime-pull”（系统性启动-黏膜加强）策略，是否能克服现有瓶颈，显著提升疫苗的保护效力呢？

为了验证这一假说，研究人员在小鼠模型中开展了一系列系统性的实验。他们运用了多种关键的实验技术，主要包括：1）异源免疫策略：设计了不同顺序的mRNA.PPE15（肌肉注射）与ChAdOx1.PPE15（鼻腔接种）组合方案，并与同源免疫（如两次mRNA）进行对比。2）精细的免疫细胞分析：通过多色流式细胞术，结合抗原特异性肽段刺激和细胞内细胞因子染色，全面评估脾脏和肺中CD4⁺、CD8⁺T细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的能力。3）肺内免疫细胞定位技术：采用创新的血管内染色法，将静脉注射的荧光抗体标记血管内细胞，从而在后续分析中清晰地区分位于肺实质组织内（血管外，IV-）和滞留在肺血管内（IV+）的免疫细胞，这对于理解免疫细胞是否真正进入“战场”至关重要。4）抗原特异性T细胞深度表型鉴定：结合I-A(b)和H-2D(b) MHC四聚体（Tetramer）染色（用于精准识别针对PPE15特定表位的CD4⁺和CD8⁺T细胞）和表面标志物（如CXCR3, PD1, KLRG1）分析，来定义具有组织驻留记忆表型（T_RM-like）的细胞。5）保护效力评估的金标准：通过气溶胶感染让小鼠暴露于结核分枝杆菌Erdman菌株，四周后对肺和脾组织进行菌落形成单位计数，定量评估不同疫苗方案降低细菌负荷的能力。

研究人员对实验结果进行了层层剖析：

3.1 异源疫苗接种激发强大的系统性细胞免疫和抗体应答

在脾脏这个“免疫指挥中心”，无论是同源的mRNA.PPE15-mRNA.PPE15还是两种异源组合（mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15及其反向顺序），都能诱导出显著高于未免疫对照组的、能产生IFN-γ、TNF-α、IL-2等多种细胞因子的CD4⁺和CD8⁺T细胞，并产生了偏向于Th1型的PPE15特异性抗体。有意思的是，异源接种，特别是mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15顺序，还诱导了更高水平的产生IL-17的CD4⁺T细胞，而该细胞因子此前也被认为与保护相关。

3.2 异源疫苗接种激发强大的肺部细胞免疫

研究的关键在于肺部“前线”的免疫情况。流式细胞术分析发现，mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案诱导了最高频率的产生IFN-γ的肺CD4⁺T细胞。通过血管内染色进一步定位发现，单用ChAdOx1.PPE15鼻腔免疫或采用mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15序贯免疫，所诱导的抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞主要位于肺实质内（IV-）。而反向顺序（ChAdOx1.PPE15-mRNA.PPE15）的细胞在实质和血管中分布较均衡，同源mRNA免疫诱导的T细胞则绝大多数局限于肺血管中（IV+）。这表明，先mRNA全身启动，再经ChAdOx1黏膜加强的策略，能最有效地将免疫细胞“拉”进肺组织。

3.3 异源疫苗接种富集肺实质中PPE15特异性肺组织驻留T细胞表型

为了更精确地识别这些进入肺部的T细胞的身份，研究人员使用了PPE15特异性MHC四聚体结合血管内染色进行追踪。结果证实，mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案在肺实质中诱导了数量最多的PPE15特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞。这些细胞高表达归巢受体CXCR3和抑制性受体PD1，但不表达终末分化标志物KLRG1（即表型为CXCR3⁺PD1⁺KLRG1^-），这正是之前研究中与抗结核保护相关的组织驻留记忆T细胞（T_RM）的典型特征。相反，在肺血管中，同源mRNA免疫组有大量抗原特异性T细胞，但它们大多表达CX3CR1和KLRG1，属于终末分化表型，迁移和功能可能受限。

3.4 异源疫苗接种后肺和脾中对结核分枝杆菌的增强保护

功能需要实效验证。在结核分枝杆菌攻击实验中，所有疫苗方案相比未免疫组都一定程度上降低了肺部细菌负荷。但仅在mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15组，肺和脾的菌落数都出现了显著下降。这表明，该方案能提供更全面的系统性保护。

3.5 BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15诱导强大的系统性CD4⁺和CD8⁺T细胞应答

考虑到卡介苗是全球广泛使用的现实，研究的另一重点是评估新方案作为卡介苗加强针的潜力。先用卡介苗初免小鼠，再用不同方案加强。结果显示，所有含PPE15的加强方案都增强了脾脏中针对PPE15的T细胞应答，其中BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案诱导的CD8⁺T细胞反应最为强烈。

3.6 BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15诱导强大的肺部CD4⁺和CD8⁺T细胞应答

在肺部，BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案同样表现突出，诱导了最高水平的、定植于肺实质内的产生IFN-γ的CD8⁺T细胞。

3.7 BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15疫苗接种富集肺实质中PPE15特异性肺组织驻留T细胞表型

表型分析再次确认，作为卡介苗加强针，BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案在肺实质中诱导了数量最多的、具有T_RM样表型（CXCR3⁺KLRG1^-和 CXCR3⁺PD1⁺）的PPE15特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞。

3.8 BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15显著提高卡介苗效力

最终的攻毒保护实验给出了决定性证据：在卡介苗初免的基础上，用BCG-mRNA.PPE15-ChAdOx1.PPE15方案加强，相比单用卡介苗，能使肺部和脾脏的细菌负荷进一步显著降低（分别降低约0.6 log₁₀和0.83 log₁₀），保护效果优于其他所有测试方案。而此前单独使用mRNA.PPE15加强卡介苗并未显示出增效作用。

总结与讨论部分，本研究有力地证明，一种结合了肌肉注射mRNA启动和鼻腔接种ChAdOx1加强的异源“prime-pull”策略，在诱导强大的全身免疫的同时，能特别有效地将抗原特异性T细胞导向并保留在肺实质，富集具有保护性表型（CXCR3⁺PD1⁺KLRG1^-）的T_RM样细胞。这种免疫细胞的精确定位和表型优化，很可能是其提供卓越保护力的关键机制。尤为重要的是，该策略在作为现有卡介苗免疫程序的加强针时，展现出了显著的增效作用，这对于在卡介苗广泛接种的地区实际应用具有重大意义。研究也揭示了免疫顺序的重要性，先mRNA后ChAdOx1的方案优于反向顺序，突出了“先系统动员，后黏膜引导”的逻辑优势。此外，同源mRNA疫苗虽能激发强烈的全身反应，但诱导的T细胞多滞留于肺血管且呈终末分化表型（KLRG1⁺），这或许解释了其单独使用时保护力有限的原因。这项工作不仅为结核病疫苗开发提供了一种极具前景的新策略，证实了异源平台与异源接种途径联用的价值，也为通过操控免疫细胞的组织归巢和驻留来设计更有效的黏膜疫苗提供了重要概念依据。未来的研究将集中于评估该策略保护的持久性，并探索与其他抗原联用或优化接种间隔，以推动其向临床转化。