《Frontiers in Immunology》：Integrating mechanical cues in in vitro models of immune-related fibrotic diseases
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纤维化是一种以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积和组织硬化（stiffening）为特征的病理过程，可导致器官衰竭，是多种慢性疾病常见的终末期表现。免疫系统在纤维化进程中扮演关键角色，其中多种免疫细胞通过分泌各种细胞因子和
纤维化是一种以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积和组织硬化（stiffening）为特征的病理过程，可导致器官衰竭，是多种慢性疾病常见的终末期表现。免疫系统在纤维化进程中扮演关键角色，其中多种免疫细胞通过分泌各种细胞因子和调节炎症与修复之间的平衡，参与纤维化的启动和发展。机械信号，如ECM硬度、流体剪切应力和组织粘弹性，也对纤维化进展有重要影响。纤维化组织中机械微环境的改变不仅影响成纤维细胞的活化和ECM重塑，还调节免疫细胞的募集、极化和功能，从而形成涉及机械、免疫和纤维化反应的促纤维化正反馈回路。传统模型，如二维（2D）细胞培养和动物模型，在重现这种复杂的细胞相互作用方面存在显著局限性。近年来，类器官和器官芯片（Organ-on-a-Chip, OoC）技术的进步为更好地模拟体内多细胞交互、机械微环境和免疫反应提供了强大工具，有助于理解纤维化机制和筛选抗纤维化药物。本综述总结了免疫相关纤维化疾病的病理基础、机械微环境的改变、免疫细胞与纤维化组织之间的相互作用，并重点介绍了类器官和OoC平台在涉及机械和免疫因素的纤维化研究中的应用与前景。
1. 纤维化中免疫与力学的相互作用
纤维化是一种失调的伤口愈合反应，以细胞外基质（ECM）过度沉积、进行性组织硬化并最终导致器官衰竭为特征。多种因素可触发纤维化疾病，如慢性炎症、反复感染、长期接触有毒物质、自身免疫异常或代谢紊乱。无论病因如何，最终结果都是功能性实质组织被疤痕组织替代。临床上，与纤维化相关的疾病占工业化国家所有死亡原因的大约45%，目前尚无有效治疗方法。其经济负担甚至超过许多恶性肿瘤，使得纤维化的病理机制和治疗成为持续挑战。临床上有许多疾病可导致器官纤维化，包括心脏、肺、肝脏等多个器官。在纤维化进程中，免疫反应和机械因素都至关重要。一方面，免疫系统在纤维化疾病进展中起着关键作用。另一方面，机械信号（如组织硬度、剪切应力和张力）共同调节健康组织的器官发育、形态发生和稳态。在纤维化器官中，组织的机械环境发生各种变化，包括ECM硬度和粘弹性增加，以及血流动力学力被扰乱。这些机械变化也会影响免疫反应，因为免疫细胞具有高度的机械敏感性，其功能会受到基质刚度的调节。显然，研究疾病或开发治疗方法需要可靠的体外模型。传统的体外模型，如培养皿中的细胞，存在实现多细胞共培养和复制免疫细胞在体内经历的机械微环境的困难。近年来，出现了能够精确控制机械因素并允许患者来源的免疫细胞、基质细胞和实质细胞共培养的体外模型，如类器官、器官芯片、可调水凝胶和生物支架。本综述总结了在机械背景下应用于免疫相关纤维化疾病的体外模型的最新进展。
2. 免疫相关纤维化疾病
随着纤维化进展，免疫细胞被持续募集和激活。不受控制的纤维化通常导致心脏、肺、肝脏和肾脏等器官的结构损伤和进行性功能丧失。尽管诱因多样，纤维化的发展通常始于细胞衰老和组织损伤引起的异常组织修复反应。各种免疫细胞被募集到损伤部位并被激活，形成促纤维化微环境，ECM过度沉积并交联成刚性网络，进一步加剧组织缺氧和细胞功能障碍。这两个方面相互促进，形成驱动纤维化进展的正反馈环路。
2.1 ECM沉积与重塑
纤维化的核心病理特征是ECM的过度沉积和结构重塑。在生理状态下，来自常驻成纤维细胞的胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白等ECM的合成与降解，被基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）动态平衡。然而，在纤维化过程中，这种微妙的稳态被严重破坏。首先，ECM合成显著增加。关键的促纤维化因子——转化生长因子-β（TGF-β），通过激活经典的Smad信号通路和非经典通路（如PI3K/AKT、MAPK (ERK)和JAK/STAT）来促进成纤维细胞活化、增殖和ECM合成，从而加剧纤维化进程。此外，各种促纤维化细胞因子，包括血小板衍生生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）和白介素（IL），独立或与TGF-β协同放大促纤维化效应。同时，ECM降解受到抑制。其次，纤维化组织中ECM的组成和结构发生病理性改变。随着纤维化进展，更硬的I型胶原（Col-I）逐渐取代III型胶原（Col-III）成为ECM的主要成分。基底膜成分的改变和间质胶原的分布破坏了组织结构，影响了细胞迁移和表型转化。纤连蛋白亚型（如FN-EDA）的过度积累可以通过整合素持续激活TGF-β，形成促纤维化正反馈环路。ECM中增加的Col-I纤维在赖氨酰氧化酶（LOX）催化下发生共价交联，显著增强了ECM的硬度和稳定性，使其更耐降解。ECM的过度沉积和结构重塑也改变了组织机械微环境，驱动纤维化进展。
2.2 免疫细胞在纤维化疾病发病机制中的关键作用
器官纤维化是一个在免疫细胞密切调控下的动态修复反应。在这个过程中，中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞等先天免疫细胞首先对组织损伤作出反应。随后，树突状细胞、T细胞和B细胞等适应性免疫细胞参与组织重塑。中性粒细胞作为关键的先天免疫效应细胞，通过多种机制驱动组织和器官纤维化。巨噬细胞是先天免疫的核心组成部分，它们在响应受损组织微环境时发生表型和功能变化，在不同器官的损伤修复过程中通常表现出“早期促纤维化、晚期促修复”的作用。除了经典的M1/M2巨噬细胞分类，单细胞RNA测序技术的进步还识别出在纤维化进展中起关键作用的巨噬细胞亚群，称为疤痕相关巨噬细胞（SAMs）。自然杀伤（NK）细胞主要通过直接细胞毒作用靶向活化的成纤维细胞，发挥关键的抗纤维化作用。然而，在慢性疾病中，由于黏附和细胞毒性受损，其抗纤维化能力下降。树突状细胞（DCs）是纤维化疾病的重要参与者。由于其功能异质性，不同的DC亚群在器官中扮演不同且常常相反的角色。B细胞通过与其他细胞类型的相互作用促进纤维化，主要通过直接接触或分泌促纤维化因子（如IL-6和TGF-β）来促进ECM生成和成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。相反，某些B细胞亚群表现出保护功能。CD4+T细胞在细胞因子影响下分化为各种辅助性T（Th）和调节性T（Treg）亚群，在纤维化中发挥不同作用。CD8+T细胞在纤维化中表现出双重作用。它们通过趋化作用进入肺、肝和心脏等器官促进疾病，增强细胞毒性、炎症和成纤维细胞活化。相反，特定的亚群，如代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）中的CD8+组织驻留记忆T细胞（Trm），通过CCR5依赖性募集和诱导活化的肝星状细胞（HSCs）凋亡来改善纤维化。
2.3 纤维化微环境对免疫细胞的影响
纤维化微环境也反过来塑造免疫细胞行为。活化的成纤维细胞和受损组织细胞分泌丰富的趋化因子，在纤维化微环境内形成协调免疫细胞募集的趋化因子网络。募集后，免疫细胞的表型和功能可以被纤维化微环境的生化和/或机械信号调节。生化信号（如缺氧、趋化因子和细胞因子）已被充分理解。此外，纤维化组织机械特性（ECM硬度和粘弹性）的改变也通过机械转导途径影响免疫细胞功能，最终影响各种疾病的进展。因此，纤维化微环境通过调节免疫细胞募集、表型重编程和功能改变来重塑免疫反应。
2.4 细胞衰老驱动纤维化
细胞衰老是一种细胞周期停滞的状态，现在被认为是纤维化疾病的重要驱动因素。衰老细胞通过衰老相关分泌表型（SASP）分泌各种物质，促进炎症和纤维化发展。现有证据表明，纤维化改变了ECM的硬度，从而促进细胞衰老。使用硬度较高的纤维化基质能够促进人原代肺成纤维细胞（IMR-90）的胶原分泌，并诱导细胞衰老和分泌表型。此外，细胞衰老可以通过SASP分泌炎症因子和趋化因子来激活免疫系统，募集巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等免疫细胞。受控的SASP可以促进伤口愈合并通过免疫细胞清除衰老细胞，而慢性的SASP会导致长期炎症，加剧纤维化进展。另外，随着免疫系统衰老，免疫细胞增殖能力减弱和对刺激的敏感性降低，进一步加重肺纤维化。重要的是，衰老和纤维化形成双向恶性循环。
3. 纤维化疾病中机械信号的显著改变
3.1 组织硬度
纤维化疾病导致受影响器官的硬度显著增加。硬度是与生理功能密切相关的关键机械特性，通常用杨氏模量来表征。在纤维化器官中，通过多种测量技术在多个尺度上观察到硬度增加。在ECM和细胞水平，原子力显微镜（AFM）纳米压痕通常用于量化由于纤维化导致的细胞和ECM硬化。在组织水平，使用AFM纳米压痕、流变测量、磁共振弹性成像、剪切波弹性成像和超声弹性成像等技术来评估纤维化组织的硬度。硬度增加不仅是纤维化严重程度的指标，还会损害正常的生理功能。
3.2 血流动力学
纤维化疾病显著改变受影响器官内的血流。血液流动通过提供营养物质和氧气，并对细胞施加各种机械力（如流体剪切应力和血压）来发挥至关重要的生理作用。因此，纤维化引起的血流变化会深刻影响营养和氧气的输送以及局部机械微环境。由于血管结构、生理学和其他相关因素的根本差异，纤维化的血流动力学后果及其最佳测量技术因器官而异。目前研究肝脏血流的技术包括血管造影、多普勒超声和4D血流MRI。在心脏，血流变化主要使用组织学切片染色和血管造影等技术评估。评估纤维化肺血流的常用方法包括组织病理学染色和相位对比MRI。具体来说，肝脏具有独特的双重血液供应，纤维化严重损害肝脏血液灌注。心脏主要依靠冠状动脉供血，心脏纤维化导致冠状动脉微血管密度中位数减少27%，进一步加剧心肌缺血和纤维化。在肺中，肺动脉和肺静脉是肺循环的主要血管，纤维化患者中，超过三分之二的小肺静脉和微静脉至少出现中度管腔狭窄，表明纤维化导致肺血流严重受损。
3.3 粘弹性
纤维化显著改变器官的粘弹性特性。粘弹性是反映组织在负载下动态行为的基本机械特性，通常用储能模量E′（代表弹性分量）、损耗模量E′′（代表粘性分量）和损耗因子tan δ = E′′/E′来表征。研究粘弹性的主要方法是基于AFM的微流变学。纤维化通常导致器官的弹性和粘性增加。例如，小鼠纤维化肝组织的总硬度高于正常肝组织。在小鼠心脏中，在接近生理心率的加载频率下，心脏纤维化区域的弹性模量高于健康区域，其损耗因子约为健康组织的两倍，表明纤维化区域粘性能量损失显著增加，泵血机械效率降低。同样，在小鼠肺中，纤维化组织的储能模量和损耗模量也高于正常肺组织。
4. 机械信号调节细胞行为和纤维化进展
组织特异性机械微环境随着纤维化进展而发生动态变化，涉及基质硬度和粘弹性、间质流体压力和剪切应力以及张力的改变。这些机械变化主要由ECM过度沉积、重塑和肌成纤维细胞的收缩活动引起。值得注意的是，这些机械改变不仅是纤维化发展的结果，而且在调节纤维化中发挥重要作用。它们与生化因素共同影响组织内的细胞行为和命运。
4.1 成纤维细胞
成纤维细胞的活化及其ECM分泌是纤维化进展的核心。组织损伤发生时，局部释放损伤相关分子模式（DAMPs），激活包括TGF-β、TLR4/NF-κB和PDGFR自磷酸化级联在内的信号通路，诱导静息成纤维细胞上调α-SMA、纤连蛋白和PDGFRβ等分子的表达，获得增殖和迁移能力。在此过程中，组织机械微环境通过多种机制参与调节。首先，细胞膜上典型的机械感受器蛋白整合素将ECM连接到细胞骨架，形成细胞机械信号网络。ECM的过度沉积和交联增加了基质硬度，促进整合素在细胞膜上聚集，激活粘着斑激酶FAK和下游RhoA/ROCK通路，增强肌球蛋白II的收缩力，形成应力纤维。健康组织的粘弹性可以减少成纤维细胞铺展和粘着斑，抑制成纤维细胞活化。除了这种经典的整合素黏附依赖性机械转导模式外，机械微环境还动态调节核孔形态。其次，机械敏感离子通道Piezo1响应细胞微环境中的各种机械变化，如拉伸力、流体剪切应力和压力。拉伸通过Piezo1介导的ERK磷酸化和Ca2+内流促进成纤维细胞活化和ECM沉积。此外，具有超生理间质流的炎症条件激活TGFβ1，促进成纤维细胞活化、定向排列和基质重塑。值得注意的是，在纤维化进展过程中，肌成纤维细胞通过收缩胶原纤维将力传递给邻近的成纤维细胞，激活其转化为肌成纤维细胞。
4.2 其他细胞
除了成纤维细胞，还有其他几种类型的细胞感知生物力学和生化信号参与纤维化。拉伸力导致肺泡上皮细胞衰老，通过旁分泌信号促进成纤维细胞活化和肺上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）。肺泡II型上皮细胞在坚硬基质上通过整合素-FAK-RhoA/ROCK通路和YAP核转位抑制E-钙粘蛋白表达并上调Snail/Twist转录因子，驱动EMT。内皮细胞对机械信号高度敏感。组织硬度增加和血流压力及剪切应力的改变破坏了VE-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物，增加了血管通透性，促进了炎症渗出。同时，Piezo1通道激活触发钙调神经磷酸酶-NFAT和整合素-FAK-MRTF通路，诱导内皮-间质转化（EndMT）。在组织纤维化过程中，基质硬度增加激活YAP信号通路，诱导周细胞向成纤维细胞转化并增强其侵袭性。在纤维化过程中，组织机械微环境发生变化，这些变化包括肌成纤维细胞收缩、基质重塑、局部血流动力学改变和炎症引起的间质流体压力增加。它们改变了组织驻留细胞的微环境。这些细胞感知和传递机械信号，然后通过下游信号通路，表现出迁移、转化、异常分泌和凋亡抵抗等行为，调节纤维化进展。
5. 当前体外模型
5.1 传统纤维化模型
有效的抗纤维化疗法的开发依赖于可靠的疾病模型。传统的纤维化模型，如动物模型、二维（2D）细胞培养和精确切割组织切片，已使用多年并具有许多优势。然而，传统模型也存在明显的局限性。例如，小鼠模型仅部分重现人类疾病，种间差异导致许多候选药物在临床试验中失败。2D培养无法模拟体内3D结构、多细胞交互和生物力学线索。人精确切割组织切片通常限于终末期病变组织，且该平台存在通量低、存活时间短和批次间差异的问题。
5.2 类器官和器官芯片
5.2.1 类器官
类器官是源自干细胞或患者组织的3D自组装结构，在模拟ECM的基质中培养。它们复制了组织结构的关键方面，并允许个性化疾病建模和高通量药物筛选。肺类器官可以准确模拟特发性肺纤维化的病理特征。肝类器官可以实现多细胞共培养。心脏类器官可以在体外实现生理性收缩。通过应用病理刺激，这些类器官可以转化为疾病模型。尽管前景广阔，类器官仍面临几个显著的限制。当前技术通常产生的类器官成熟度不足、生理尺寸有限、结构复杂性降低。多细胞共培养系统仍然不发达，常常无法模拟体内真实的细胞-细胞相互作用。此外，类器官难以重现关键的生理线索，如生物力学力，这对于逼真的组织发育和疾病建模至关重要。进一步的挑战包括可重复性有限和缺乏标准化方案，阻碍了更广泛的应用和验证。
5.2.2 器官芯片
器官芯片是一种微加工细胞培养系统，利用微制造技术复制人体器官的关键解剖结构、组织界面和功能单元。这些平台能够在灌注下实现精确的多细胞共培养，允许在受控条件下传递生化和物理刺激，是用于实时监测和生物力学研究的强大工具。肺芯片实现了组织（肺泡-毛细血管界面）的关键功能界面并模拟生理呼吸。肝芯片能够方便地施加各种外部刺激，有利于模拟多种类型的肝纤维化疾病。心脏芯片可以集成传感器用于功能读数，用于监测纤维化的病理特征。事实上，器官芯片仍然面临一些挑战。它通常涉及微流控和微加工技术，入门门槛高且操作复杂。器官芯片内的3D结构不是自形成的，因此与体内条件不同。从器官芯片获得的数据难以分析。器官芯片制造主要依靠手工制造，导致稳定性、可扩展性和标准化问题。
6. 讨论与未来展望
严重纤维化是多种慢性疾病常见的终末期表现，导致器官衰竭，并在机制理解和治疗干预方面构成持续挑战。虽然纤维化传统上与持续炎症、反复损伤、遗传易感性和代谢失调相关，但越来越清楚的是，其发病机制超出了单纯的胶原沉积和成纤维细胞活化。免疫系统现在被认为是纤维化进展的关键贡献者。传统的体外模型提供了基础性的见解，但存在关键的局限性。类器官和器官芯片系统的最新进展为克服这些限制提供了有希望的途径。未来的迭代应努力整合免疫、神经和血管成分，以更好地模拟体内条件。多器官微生理系统（例如，“人体芯片”）可以进一步阐明系统性纤维化疾病中的器官间交互作用。在标准化、规模化、自动化这些平台方面仍然存在重大障碍。将先进技术（如自动化培养、高内涵成像和机器学习辅助数据分析）整合到体外模型中，对于实现对纤维化机制和药物反应的大规模、可重复性研究至关重要。值得注意的是，在大多数模型中，相关机械线索的整合仍然处于初级阶段。未来的研究应整合多模态机械刺激，以更好地模拟病理生理微环境。机械转导在免疫-纤维化交互作用中的调节机制值得深入研究。对于临床转化，在这些工程系统中使用患者来源的细胞也将增强个性化疾病建模和治疗筛选。总之，通过生物学、工程学和免疫学的融合，在下一代体外模型中整合机械和免疫线索，具有揭示复杂机制驱动的组织纤维化的巨大潜力。
