离子排斥色谱中峰前移的机制

《Journal of Chromatography A》：Mechanism of Peak Fronting in Ion Exclusion Chromatography

离子排斥色谱（IEC）中动态柱容量受有机酸类型和浓度影响，芳香酸与杂芳香酸的动态柱容量显著高于脂肪族酸，且保留量与流动相中相同有机酸浓度相关，导致峰前现象。

　　

Milko Novi? | Paul R. Haddad

?aucerjeva 12, 1000 卢布尔雅那, 斯洛文尼亚

摘要

离子排斥色谱（IEC）是一种专门用于分离弱酸性分析物的技术，可以使用纯水作为洗脱剂。在这种条件下，分析物会以峰前移的形式被洗脱出来。通过对完全功能化的8%交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基质的IEC柱子从水相转化为适当的分析物形式，再回到水相的过程进行彻底研究，发现IEC柱的容量是动态的。具体来说，只有当移动相中存在一定量的相同分析物时，固定相才会保留一定量的分析物。这一特性被称为动态柱容量。此外，动态柱容量受到分析物类型和浓度的影响。研究结果表明，对于芳香族和杂芳香族有机酸而言，其动态柱容量具有线性浓度依赖性，且明显大于脂肪族有机酸。

通过严格的实验，确定了动态柱容量是决定分析物在柱子中动态保留量的主要因素。因此，会产生特征性的峰前移现象，峰从柱子的空隙体积处开始。不同浓度的分析物所产生的峰前移曲线在达到稳态浓度之前都遵循相同的曲线。

由于IEC柱对每种分析物都表现出特定的动态柱容量，因此分析物在洗脱剂中的分布情况由每种活性组分的特性决定。此外，观察到由于这一现象，相同质量的分析物（通过增加洗脱剂体积并降低分析物浓度来制备）会产生相同的色谱峰。

引言

离子排斥色谱是一种液相色谱技术，由Wheaton和Bauman于1960年首次提出[1]。该技术基于使用强阴离子或阳离子交换固定相来分离部分离子化的物质。弱酸性分析物在阳离子交换固定相上分离，而弱碱性分析物在阴离子交换固定相上分离。这两种分离方式都可以使用水作为洗脱剂。尽管离子排斥色谱的理论自问世以来不断得到完善，但其基本分离机制的解释基本保持不变。目前接受的理论主要基于Donnan排斥效应和分析物在固定相表面的疏水吸附。IEC有多种名称，反映了人们对其精确分离机制的持续探索[2]，例如离子排斥分配色谱[3]、Donnan排斥色谱[4]和离子调节分配色谱[5]。尽管研究人员努力确认实际的分离机制，但仍有一些未解决的问题。其中一个关键问题是，现有的IEC分离机制无法解释使用纯水作为洗脱剂时出现的强烈峰前移现象[3]。

峰前移是一种峰不对称的现象，即峰的前沿比尾部更宽。文献中对这一现象进行了描述和解释，通常将其归因于样品制备错误（基质效应）、柱子降解或柱子饱和/过载[6]。因此，峰前移被认为是色谱系统本身的特性，而不是分离机制的固有部分。

之前唯一尝试将IEC中的峰前移现象解释为分离机制的结果是基于选择性分析物吸附与浓度依赖性的分析物解离[7]。在由弱酸组成的分析物带的前沿和尾部部分，分析物浓度较低，因此解离程度较高，由于Donnan排斥作用，其在柱子中的移动速度比峰中心快。但从某种角度来看，这种解释存在疑问。分析物浓度的增加应该会导致峰前移曲线的斜率增加，但实际上在IEC中并非如此[8]。

在其他色谱技术中也观察到了峰前移现象。在一项研究中[8]，作者描述了在尺寸排阻色谱柱上分离胰岛素时出现的峰前移现象，并认为这是柱内二聚体形成的直接结果。Jandera等人[9]也研究了萘磺酸（NSAs）在不同RP-HPLC固定相上的浓度依赖性保留行为，并改变了移动相中的盐添加剂。这些结果表明，离子和疏水相互作用的微小变化都会显著影响保留行为，这对于预测极性和离子化合物（包括小分子和生物聚合物，如寡核苷酸）的反相色谱效果非常有用。他们得出结论，柱子过载和离子排斥效应的结合可能导致峰前移或峰尾部不对称[9]。

尽管在其他色谱技术中有许多类似的例子，但在后续研究中我们仅关注IEC技术。如前所述，虽然许多先前的研究提到了IEC中的峰前移现象，但很少将其视为IEC分离机制的结果。Glód[7]将使用水作为洗脱剂时的峰前移归因于分析物在柱子上分散带中的整体解离差异。目前尚未发表关于这一机制的详细研究。Zapa?a和Kaczmarski[10]将峰前移机制归因于分析物的反Langmuir行为。这种观点基于分析物质子的部分穿透Donnan膜并吸附在固定相表面的假设。然而，这种方法的难点在于难以区分分析物的质子化和解离部分，因为两者之间的质子化平衡非常迅速[11-16]。Tanaka等人[11-16]在多篇报告中提到，使用水作为洗脱剂时会出现峰前移现象，通常将其归因于疏水吸附。与其他作者不同，Mansour等人[17]认为峰前移是IEC分离机制的固有现象，并指出现有的IEC分离机制无法解释这一现象。他们还指出，分析物在IEC固定相上的吸附是存疑的，因为固定相经过功能化处理后不存在中性的吸附位点[17]。Lodi等人[18]将峰前移视为一种复杂现象，而非分离机制的固有部分，并认为“较弱的酸在溶液中可能部分离子化，形成分子形式和离子形式的混合物。当使用纯去离子水作为洗脱剂时，这种混合物会导致峰的宽化和尾部特征[18]。

在之前的出版物[34]中，我们指出IEC的保留机制尚未完全明确。尽管如此，柱子在分析物形式和洗脱剂形式之间的转换过程已经得到成功解释，特别是强调了在柱子从分析物形式转换为水形式过程中分析物浓度瞬时下降的现象。这一过程被称为“离子泵”，并证明了分析物从固定相表面被排斥到移动相内部的强度大于其被吸引的强度。

本文详细描述了选定有机酸在IEC中的峰前移行为。虽然阳离子交换剂（如AS1柱（Dionex ICE-AS1，Thermo Fisher Scientific）上阴离子分析物的保留机制尚未完全阐明，但分析物被排斥的强度大于其被吸引的强度，以及测量的动态柱容量（特定于分析物和分析物浓度）可以用来解释峰前移的形成。

试剂

为了验证使用水作为洗脱剂时导致强烈峰前移的机制，选择了每种典型有机酸组的代表性分析物。对于单质子、二质子和三质子脂肪族酸，分别选择了乙酸、草酸和柠檬酸；对于芳香族酸，选择了苯甲酸和2,6-吡啶二甲酸（PDCA）。双蒸馏水经过Milli-Q水纯化系统（Millipore，Bedford，MA）处理后用于实验。

柱子空隙体积的测定

测定IEC柱的空隙体积是一项挑战，因为用于此测量的化合物与固定相的相互作用因化合物类型而异。文献中接受了使用强矿物酸（HNO₃）作为测试物质来确定系统空隙体积的方法[35]。这种化合物不会与固定相发生相互作用，因为它完全解离，因此会被完全从固定相中排斥。

结论

离子交换色谱（IEC）的保留机制仍是一个持续研究的课题。一个需要修改或替换现有IEC分离机制的重要因素是峰前移现象，尤其是在使用水作为洗脱剂的情况下。此外，缺乏疏水吸附效应以及当前机制仅关注分析物的质子化形式的保留现象，进一步强调了重新评估IEC分离机制的必要性。

作者贡献声明

Milko Novi?：撰写初稿、可视化处理、方法设计、数据整理、概念构建。 Paul R. Haddad：审稿与编辑、方法设计、数据整理、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本手稿工作的财务利益或个人关系。