解码寄生虫TGFβ拮抗剂的作用机制启发细胞特异性TGFβ调控剂的构建

《Advanced Science》：Decoding the Mechanism of Action of a Parasite TGFβ Antagonist Inspires the Creation of Cell-Type-Specific TGFβ Modulators

TGFβ信号通路调控失常与纤维化、癌症等多种疾病相关，但现有抑制剂缺乏细胞特异性，易导致全身性副作用。本文通过解析寄生虫分泌的TGFβ模拟物TGM6的拮抗机制，发现其通过结合TGFBR2和共受体LRP1诱导TGFBR2溶酶体降解，并基于其模块化结构设计了可编程的TGM嵌合体及TGFBR2纳米抗体融合蛋白，首次实现了TGFβ信号在特定共受体表达细胞中的选择性调控，为开发细胞特异性TGFβ靶向疗法奠定了新基础。

　　

论文解读

转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGFβ）是人体中一种功能多面的细胞因子，像一位“多面手”，在胚胎发育、组织修复和免疫调节等生理过程中扮演着关键角色。然而，这位“多面手”一旦失控，就可能成为疾病的“推手”，与纤维化、癌症等多种病理过程密切相关。遗憾的是，目前临床上针对TGFβ通路的抑制剂，如中和抗体或小分子激酶抑制剂，往往“不分敌我”，对所有细胞中的TGFβ信号进行“无差别攻击”。这种缺乏细胞特异性的抑制方式，虽然可能打击了疾病细胞，但也严重干扰了正常细胞的生理功能，导致心脏毒性、皮肤肿瘤等严重副作用，极大地限制了其临床应用。因此，开发能够精准靶向特定细胞类型的TGFβ调控工具，成为了领域内亟待突破的瓶颈。

有趣的是，自然界为我们提供了精妙的灵感来源。一种感染小鼠的寄生虫——Heligmosomoides polygyrus，为了在宿主体内更好地生存，进化出了一套“模仿”和“干扰”宿主免疫系统的秘密武器：TGFβ模拟物（TGFβ mimics, TGMs）。其中，TGM1能模拟TGFβ的免疫抑制作用，而TGM6则表现出拮抗活性，但两者作用的细胞类型却不同。这就像寄生虫拥有两把功能不同、靶点各异的“分子钥匙”。科学家们敏锐地意识到，解析这些天然“工具”的工作原理，或许能为设计人类疾病所需的新型、细胞特异性TGFβ调控剂提供革命性的蓝图。本研究正是基于这一思路，深入解码了TGM6的拮抗机制，并成功将其模块化设计理念应用于工程化改造，相关成果发表于《Advanced Science》。

为开展这项研究，作者团队综合运用了多种关键技术方法。在机制探索层面，他们利用X射线晶体学解析了TGM6-D3与小鼠TGFBR2胞外区的复合物结构，并通过等温滴定量热法（ITC）精确测定了二者的结合亲和力。在功能验证方面，研究采用了基于CRISPR-Cas9的基因敲除技术，构建了LRP1、Betaglycan、TGFBR2等多种共受体或受体缺陷的细胞系，以明确各组分在TGM6功能中的必要性。此外，通过放射性碘标记的配体（¹²⁵I-TGM6/¹²⁵I-TGFβ）进行细胞表面亲和力交联和免疫共沉淀，直观展示了TGM6与受体（TGFBR2）及共受体（LRP1, Betaglycan）的结合情况。在蛋白质工程方面，研究者通过结构域置换构建了TGM1/TGM6嵌合体，并利用噬菌体展示和酵母展示技术筛选获得了高亲和力的人源TGFBR2特异性纳米抗体（VHH），进而将其与靶向HER2或EGFR的affibody融合，构建了双特异性抗体。

研究结果

2.1 TGM6介导的TGFβ信号抑制在小鼠和大鼠细胞中有效，但在人细胞中无效

研究人员在多种细胞系中检测TGM6对TGFβ诱导的SMAD3/4转录活性的影响，发现TGM6能有效拮抗小鼠（如NIH3T3成纤维细胞）和大鼠细胞中的TGFβ信号，但对测试的所有人源细胞系均无效果。TGM6本身不具有TGFβ激动活性。在NIH3T3细胞中，TGM6能以剂量依赖的方式抑制TGFβ信号，且提前加入TGM6比同时或延后加入效果更佳。此外，TGM6还能阻断TGFβ诱导的小鼠NMuMG乳腺细胞发生上皮-间质转化（EMT）。这些结果确立了TGM6是啮齿类动物细胞中有效的TGFβ拮抗剂，但具有物种特异性。

2.2 小鼠与人TGFBR2胞外区的三个氨基酸差异是决定TGM6物种特异性的关键因素

功能实验表明，破坏TGM6与TGFBR2相互作用的关键氨基酸突变（TGM6-mut）会使其完全丧失拮抗活性，证明TGM6-TGFBR2结合对其功能至关重要。通过在小鼠TGFBR2敲除的NIH3T3细胞中诱导表达小鼠或人TGFBR2，发现只有小鼠TGFBR2能恢复细胞对TGM6的响应。ITC结合实验证实，TGM6-D3结构域与小鼠TGFBR2的亲和力（K_D= 15 nM）比与人TGFBR2的亲和力（K_D= 604 nM）高约40倍。X射线晶体学解析了TGM6-D3与小鼠TGFBR2的复合物结构，并通过对比此前已解析的人源复合物结构，发现两者整体结构高度相似。深入分析界面发现，三个非保守的氨基酸残基（小鼠TGFBR2的Leu47, Ala75, Glu141对应人源的Phe47, Ser75, Asp141）是导致结合差异的主因，其中第47位残基（Leu/Phe）是主要决定因素。将人源TGFBR2的这三个残基突变成小鼠对应序列（获得hTGFBR2-3M），可使其结合TGM6-D3的亲和力提升至接近小鼠TGFBR2的水平；反之，将小鼠TGFBR2对应残基人源化（获得mTGFBR2-3M）则大幅降低其亲和力。

2.3 TGM6与TGFBR2和Betaglycan结合，并与TGFβ竞争结合TGFBR2

为寻找TGM6的共受体，研究者用放射性碘标记的TGM6对NIH3T3细胞进行亲和力交联。免疫共沉淀结果显示，TGM6能特异性结合TGFBR2和III型受体Betaglycan，但不结合其他TGFβ超家族I型或II型受体。此外，还发现了一个约600 kDa的未知TGM6-蛋白复合物。竞争实验表明，TGM6能以剂量依赖的方式抑制放射性标记的TGFβ与细胞表面的TGFBR2（及间接与TGFBR1）结合，但不影响TGFβ与Betaglycan的结合，这与TGM6作为TGFβ竞争性拮抗剂的功能一致。

2.4 Betaglycan抑制TGM6对TGFβ信号的拮抗作用

为了解Betaglycan的功能，研究者在NIH3T3细胞中敲除了Betaglycan。结果发现，与野生型细胞相比，Betaglycan缺陷细胞中TGM6抑制TGFβ诱导的SMAD2磷酸化和转录报告基因活性的能力显著增强。这表明Betaglycan是TGM6功能的负调控因子。结构域缺失实验进一步表明，Betaglycan的N端孤儿结构域和C端透明带结构域对于其抑制TGM6功能都是必需的。

2.5 鉴定低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）为TGM6共受体，是其发挥拮抗功能的关键决定因素

通过生物素化TGM6下拉结合质谱分析，研究人员从NIH3T3细胞中鉴定出TGFBR2和LRP1为TGM6的结合蛋白。LRP1是一个约600 kDa的跨膜蛋白，与之前观察到的约600 kDa的TGM6-蛋白复合物大小相符。在NIH3T3和NM18细胞中敲除LRP1，可完全废除TGM6对TGFβ诱导的SMAD2磷酸化、转录报告基因活性以及EMT的抑制作用。因此，LRP1是TGM6发挥细胞特异性拮抗功能所必需的共受体。

2.6 TGM6通过不同结构域分别与LRP1和TGFBR2相互作用，且TGM6与Betaglycan的结合依赖于TGFBR2

通过在不同受体敲除细胞中进行亲和力交联实验，并结合使用TGM6截短体（D3或D4/5），研究人员明确了TGM6与各受体的结合模式：TGM6-D3结构域负责结合TGFBR2和Betaglycan，而TGM6-D4/5结构域负责结合LRP1。TGM6与LRP1的结合不依赖于TGFBR2或Betaglycan；然而，TGM6与Betaglycan的结合则完全依赖于TGFBR2的存在。有趣的是，在Betaglycan缺陷的细胞中，高浓度的TGM6-D3截短体也能表现出对TGFβ信号的微弱拮抗作用，这提示在缺乏负调控因子Betaglycan的情况下，单纯的TGM6-D3与TGFBR2的结合足以产生一定的竞争性抑制。

2.7 TGM6 D4/5通过其LDLaIV簇与LRP1相互作用

通过构建一系列LRP1缺失突变体，研究者将TGM6-D4/5的结合位点定位在LRP1的第四个配体结合结构域内的LDLaIV簇上。在LRP1缺陷细胞中重新表达LRP1 D4结构域或单独的LDLaIV簇（连有跨膜区），能够部分或完全恢复TGM6的拮抗功能。相反，可溶性的LRP1 LDLaIV簇（小鼠或人源）可以作为“诱饵”，以剂量依赖的方式中和TGM6的活性。AlphaFold3结构预测也支持TGM6-D3和D4/5分别独立结合mTGFBR2和mLPR1-LDLaIV的模型。

2.8 TGM6通过诱导LRP1依赖的TGFBR2溶酶体降解来拮抗TGFβ信号

机制上，除了与TGFβ竞争结合受体，TGM6还引发了新的下游事件。用TGM6处理NIH3T3和NM18细胞，可导致TGFBR2（而非TGFBR1）蛋白水平的下降，且这一过程依赖于LRP1。溶酶体抑制剂Bafilomycin A1能有效阻止TGM6引起的TGFBR2下调，并几乎完全逆转TGM6对TGFβ信号的抑制，而蛋白酶体抑制剂则无此效果。这表明TGM6通过促进TGFBR2的溶酶体降解来增强其拮抗效应。当TGM6处理时间延长（如6小时），其抑制效果比短期处理（30分钟）更强，这与降解机制需要一定时间相吻合。

2.9 TGM6以顺式（cis）方式而非反式（trans）方式发挥作用

通过将表达绿色荧光报告基因的LRP1⁺细胞与表达红色荧光报告基因的LRP1^-细胞进行共培养实验，发现TGM6只能抑制与其共存的LRP1⁺细胞中的TGFβ信号，而对相邻的LRP1^-细胞无影响。这表明TGM6的模块化结构并未赋予其在相邻细胞间“搭桥”的能力，其作用严格局限于同时表达TGFBR2和LRP1的同一细胞表面，即顺式作用模式。

2.10 设计TGM6-TGM1嵌合体以改变细胞类型特异性和功能

基于TGMs的模块化特性，研究人员进行了蛋白质工程改造。将TGM6的D4/5替换为TGM1的D4/5（靶向CD44），所得的嵌合体（TGM6-D3/TGM1-D4/5）将其拮抗活性从依赖LRP1的细胞转换到了依赖CD44的细胞。相反，将TGM1的D1/2结构域（负责结合TGFBR1）融合到TGM6的N端，成功将TGM6拮抗剂转变成了一个有效的TGFβ激动剂（TGM1-D1/2-TGM6）。更进一步，将TGM6-D3与一个靶向人表皮生长因子受体2（HER2）的affibody融合（zHER2-TGM6-D3），则构建出了仅在HER2过表达细胞中有效拮抗TGFβ信号（包括抑制EMT）的新型调控蛋白。

2.11 设计基于TGFBR2纳米抗体（VHH）的融合蛋白用于细胞特异性靶向TGFβ信号

为了使设计理念适用于人类治疗，研究者通过噬菌体和酵母展示技术筛选获得了高亲和力（87 pM）的人源TGFBR2特异性纳米抗体（VHH）。该VHH单独作用时不能抑制TGFβ信号。然而，当将其与TGM1-D4/5或靶向HER2/EGFR的affibody融合，构建成双特异性抗体（BsAbs）后，这些融合蛋白能够在CD44⁺、HER2⁺或EGFR⁺的特定人类细胞中，有效且选择性地抑制TGFβ诱导的SMAD信号和EMT。机制上，这些BsAbs通过其affibody部分靶向并富集于特定细胞表面，从而局部增强其TGFBR2-VHH部分与TGFβ竞争结合TGFBR2的能力，实现细胞特异性拮抗，但并不引起TGFBR2的降解。

结论与讨论

本研究系统阐明了寄生虫来源的TGFβ拮抗剂TGM6的精确作用机制。其核心在于TGM6作为一个模块化蛋白，其D3结构域以高亲和力结合小鼠TGFBR2（物种特异性由三个关键氨基酸残基决定），而D4/5结构域则结合共受体LRP1。LRP1的结合不仅增强了TGM6在靶细胞上的亲合力，更关键的是介导了TGFBR2的溶酶体降解，从而在竞争性抑制之外提供了另一重强大的拮抗机制。而另一个共受体Betaglycan则发挥负向调控作用。这种多受体、多机制的精细调控，共同决定了TGM6细胞选择性的生物学效应。

更重要的是，这项工作超越了单纯的机制解析，实现了从“理解自然”到“改造自然、设计工具”的跨越。研究人员充分利用TGMs的模块化设计原理，通过结构域交换或与特定靶向单元（如affibody、纳米抗体）融合，成功改造了TGM6的细胞靶向性和功能（激动/拮抗），并最终创造出完全不包含寄生虫蛋白序列、完全人源化的TGFBR2纳米抗体双特异性抗体。这些新型“可编程”制剂能够仅在表达特定共受体（如CD44、HER2、EGFR）的细胞中精确调控TGFβ信号，首次实现了对TGFβ这一高度多效性细胞因子的细胞选择性药理干预。

该研究的重大意义在于：

1. 1.
   机制创新性：首次完整揭示了TGM6通过结合TGFBR2和LRP1诱导受体降解的双重拮抗机制，并发现了Betaglycan的负调控角色，深化了对TGFβ信号调控复杂性的理解。
2. 2.
   工具开创性：建立了一套基于模块化设计和双特异性抗体策略的通用平台，用于开发细胞类型特异性的TGFβ信号调控剂，为靶向这一重要通路提供了全新的方法论。
3. 3.
   转化前瞻性：所设计的TGFBR2-VHH双特异性抗体展示出应用于人类疾病的巨大潜力。这种细胞特异性靶向策略有望克服当前TGFβ抑制剂因缺乏选择性而导致的严重全身毒副作用，为治疗癌症、纤维化等TGFβ信号失调相关疾病开辟了新的、更安全的药物开发途径。

总之，这项研究不仅解码了一种奇特的天然免疫调节蛋白的作用密码，更将自然界的智慧转化为能够“指哪打哪”的精准医学新工具，为未来开发下一代细胞特异性靶向疗法奠定了坚实的理论和实践基础。