《Pigment Cell & Melanoma Research》：Dissecting the Spectrum of Rare BRAF Mutations in Melanoma: A Nation-Wide Study by the Italian Melanoma Intergroup (IMI)
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非V600E/K BRAF突变已在黑色素瘤中被报道，但其临床意义的数据存在矛盾。本研究旨在探讨黑色素瘤中罕见BRAF突变的分布、预后作用及功能影响。研究人员回顾性评估了来自意大利黑色素瘤组（IMI）19个中心的病例，对比V600E/K突变的罕见BRAF突变的频
非V600E/K BRAF突变已在黑色素瘤中被报道，但其临床意义的数据存在矛盾。本研究旨在探讨黑色素瘤中罕见BRAF突变的分布、预后作用及功能影响。研究人员回顾性评估了来自意大利黑色素瘤组（IMI）19个中心的病例，对比V600E/K突变的罕见BRAF突变的频率、治疗反应及结局。在14,081例样本中，258例（1.8%）携带罕见BRAF突变，其中40%涉及密码子600。接受BRAF/MEK抑制剂靶向治疗后，罕见BRAF突变黑色素瘤的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）与V600E/K突变黑色素瘤相当（HR=0.85和0.89，p>0.1）。虽然靶向治疗的反应率较低（48% vs. 66%，p>0.05），但差异不显著。接受免疫治疗的病例中，OS、PFS和客观反应率不受BRAF状态影响。分子动力学模拟评估了所选BRAF变异是否以类似于V600E的方式影响BRAF结构，结果显示蛋白质构象稳定性发生不同程度破坏，导致组成性激活，尤其是在涉及密码子599–601的突变中。这些结果表明，罕见BRAF突变能够改变BRAF激酶活性，包括一组位于密码子600外但邻近的突变。能够检测罕见BRAF突变的分子方法可识别更多适合接受BRAF/MEK抑制剂治疗的黑色素瘤病例。
论文解读文章
一、研究背景与问题
黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤肿瘤，其治疗在免疫治疗和针对BRAF/MEK的靶向治疗（BRAFi/MEKi）出现后发生了革命性变化。目前指南推荐免疫治疗作为首选一线治疗，但对于不可切除或转移性BRAF突变（主要为V600E或V600K）皮肤黑色素瘤，在免疫治疗进展或禁忌时，可使用BRAFi/MEKi。因此，体细胞BRAF基因分型对晚期黑色素瘤的个体化治疗至关重要。最常见的BRAF突变是V600E和V600K，但非V600E/K BRAF变异也有报道，尽管频率较低。这些变异（如K601E、L597Q、D594G等）增加了治疗策略选择的复杂性。然而，导致靶向治疗获批的临床试验仅纳入BRAF V600E/K突变黑色素瘤病例，而对于其他BRAF突变的证据较为有限。此前关于罕见BRAF突变可靶向性的研究样本量小、异质性高，且结果不一致。因此，明确罕见BRAF突变在黑色素瘤中的频率、临床预后影响及功能效应，对于扩展靶向治疗受益人群、优化治疗决策具有重要意义。
二、研究目的与方法概述
本研究旨在通过意大利黑色素瘤组间协作（IMI）的全国性队列，确定BRAF基因外显子15中非典型变异（罕见BRAF突变）的频率，并评估其临床预后影响。同时，通过分子动力学模拟，评估这些变异是否像V600E一样导致BRAF结构不稳定，从而增强其功能分类和可靶向性判断。
研究纳入了2012年6月至2023年11月期间来自19个IMI中心的黑色素瘤病例回顾性数据，包括临床病理特征、治疗及生存信息。分子分析基于常规诊断技术（如下一代测序、Sanger测序、焦磷酸测序等）对BRAF外显子15进行分型。罕见BRAF突变病例与V600E/K突变病例在靶向治疗和免疫治疗的反应及生存方面进行比较。统计方法包括卡方检验、Fisher精确检验、Cox比例风险模型等。分子动力学模拟基于BRAF激酶结构域（残基447–722）的晶体结构（PDB ID 6PP9），对选定的罕见BRAF突变进行全原子模拟，分析其对蛋白构象灵活性的影响，重点关注激活环（A-loop）、P-环和αC螺旋等关键区域。
三、研究结果
3.1 罕见BRAF突变的类型、频率及患者特征
在14,081例黑色素瘤中，共识别出258例（1.8%）携带罕见BRAF突变，占所有BRAF突变的4%。其中40.3%位于密码子V600，最常见的是V600R（24.03%），其次为K601E（21.71%）和V600D（7.36%）。与V600E/K组相比，罕见BRAF突变患者诊断时年龄更大（中位年龄65.5岁 vs. 59岁），但死亡率较低（31% vs. 57%）。
3.2 基于分子分析技术的罕见BRAF突变检出率
下一代测序（NGS）是检出率最高的方法（2.95%），其次为Sanger测序（2.15%）。许多中心在实际工作中采用两步策略：先使用针对V600的检测，若为野生型，再使用NGS或Sanger进行广泛检测，以提高罕见突变的检出。
3.3 靶向治疗的反应
40例罕见BRAF突变黑色素瘤接受了靶向治疗。其总体缓解率（ORR）为48%，低于V600E/K组的66%，但差异不显著（p>0.1）。中位总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）在两组间也无显著差异（OS：11个月 vs. 15个月，PFS：10个月 vs. 10.5个月）。多变量分析校正治疗线数后，结果保持一致。
3.4 免疫治疗的反应与生存
108例患者（70例罕见BRAF，38例V600E/K）接受了免疫检查点抑制剂治疗。两组的ORR无显著差异（31% vs. 30%）。虽然罕见BRAF组的OS和PFS在数值上更长，但多变量分析校正治疗线数和年龄后，差异不再显著。
3.5 分子动力学模拟
模拟结果显示，密码子599-601是一个热点区域，此处的变异可通过不同机制破坏BRAF的失活构象。在600或601位点引入带负电荷的氨基酸（如天冬氨酸D、谷氨酸E）会显著增加A-loop的灵活性，类似于生理性磷酸化（T599p）效应，促进激酶激活。而引入庞大或带正电荷的氨基酸（如精氨酸R、组氨酸H）则破坏效应较弱。位于密码子594-597的远端变异（如D594G）对构象稳定性的影响较小，且该位点属于DFG基序，其突变可能导致激酶活性丧失。这些发现从结构层面解释了不同罕见BRAF突变对蛋白功能影响的异质性。
四、讨论与结论
本研究表明，在意大利全国性队列中，罕见BRAF突变黑色素瘤接受靶向治疗后的生存结局与V600E/K突变患者相当，支持了针对涉及密码子600的罕见突变使用BRAF/MEK抑制剂的可行性。然而，由于密码子600外罕见突变病例数少，本研究未能就其疗效得出明确结论。分子动力学模拟提示，位于599-601区域的罕见突变可能通过破坏A-loop稳定性而组成性激活BRAF，这为部分非V600突变对靶向治疗敏感提供了结构生物学依据。同时，研究也证实了使用NGS等广谱检测方法对识别罕见突变、扩展潜在受益人群的重要性。
研究结论翻译：
“靶向治疗与BRAF和MEK抑制剂是黑色素瘤系统性治疗的支柱之一。BRAF和MEK抑制剂治疗被批准用于可操作的BRAF突变。然而，关于可操作性的可靠数据仅适用于V600E和V600K突变。实际上，尽管已有涉及密码子600及其他外显子15密码子的其他变异的报道，但它们出现频率低，且检验其对黑色素瘤表型及治疗反应影响的研究稀少且常提供矛盾结果。此处，通过收集来自19个意大利中心的数据，我们发现约2%的黑色素瘤病例存在罕见BRAF变异，这考虑了所使用的不同技术。当应用NGS（金标准技术，因其特异性，最重要的是敏感性）时，检出率在1.98%至6.35%之间。我们未观察到携带罕见体细胞致病性BRAF变异的黑色素瘤病例与携带V600E和V600K变异的病例在治疗反应和预后方面存在任何显著差异。总体而言，我们的结果证实了先前关于靶向治疗在治疗携带罕见BRAF变异的黑色素瘤中相较于V600E/K突变黑色素瘤的疗效的发现。考虑到特定罕见突变的可操作性，可进行V600之外的BRAF测序，以识别更多适合靶向治疗的黑色素瘤病例。进一步研究，包括特定变异的体外研究，对于确定每个变异在黑色素瘤行为及对现有疗法敏感性中的作用至关重要。”
（全文完）
