《Protein Science》：T3SS effector and regulator discovery by predicting interacting partners of T3SS chaperones in Pseudomonas aeruginosa
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为解决铜绿假单胞菌III型分泌系统（T3SS）相关蛋白谱系，特别是其伴侣蛋白互作网络尚不清楚的问题，研究人员对超15000个基因组进行系统筛选，利用结构辅助同源搜索识别T3SS伴侣蛋白，并应用AlphaFold2/3在全蛋白质组范围预测其互作伙伴。该研究鉴定出多个高置信度的候选T3SS效应蛋白与调控因子，揭示了潜在的脂蛋白、钙结合蛋白及转录调控因子等，为理解细菌毒力调控及开发新型抗菌策略提供了新靶点。
在我们身体的微观战场上，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一位臭名昭著的“机会主义”攻击者。它对免疫力低下的人群，尤其是重症监护室的患者威胁极大，能引发肺炎、血流感染等多种严重病症。其强大的致病性很大程度上归功于一个名为III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）的精巧分子“注射器”。这套系统能够将一系列被称为效应蛋白的“武器”精准注入宿主细胞内部，干扰细胞的正常功能并逃避免疫攻击。然而，要将这些不稳定的效应蛋白安全运输并准确“装填”到注射器中，离不开一类关键的“保镖”蛋白——T3SS伴侣蛋白（T3SS chaperones）。它们不仅负责稳定和运送效应蛋白，有些甚至还兼职调控整个T3SS的基因表达。
尽管在PAO1、PA14等参考菌株中已发现了一些T3SS效应蛋白和调控因子，但在由数千个分离株构成的铜绿假单胞菌泛基因组（pan-genome）中，T3SS伴侣蛋白的完整谱系及其互作伙伴（即它们保护或调控哪些蛋白）仍然是一团迷雾。传统的基于序列相似性的搜索方法往往束手无策，因为这类伴侣蛋白序列很短且高度分化。但令人振奋的是，这些蛋白在三维结构上却保持着惊人的保守性。与此同时，以AlphaFold为代表的深度学习结构预测技术取得了突破性进展，使得我们能够以前所未有的规模和精度“看见”并预测蛋白质的结构与相互作用。这为系统性地发掘细菌毒力通路中的隐藏组件打开了新的大门。
为了解开上述谜团，一项发表在《Protein Science》上的研究应运而生。研究人员构建了一个创新的计算分析流程，旨在系统性地发现铜绿假单胞菌泛基因组中T3SS伴侣蛋白的同源物，并预测它们与哪些蛋白质存在相互作用，从而识别出新的T3SS效应蛋白和调控因子。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，从NCBI数据库获取了超过15000个高质量的铜绿假单胞菌基因组组装数据，构建了泛蛋白质组（pan-proteome）数据集用于分析。其次，利用结构辅助的同源搜索方法，结合ECOD和CATH等结构分类数据库，在泛蛋白质组中识别具有保守αβα三明治折叠的T3SS I类伴侣蛋白同源物。随后，研究核心采用了基于深度学习的蛋白质结构预测工具：利用AlphaFold2生成的残基间距离图（distogram）所衍生的相互作用概率，在蛋白质组规模上大规模筛选和区分真正的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）；并对筛选出的高置信度候选复合物，使用AlphaFold3进行高分辨率的三维结构建模，以分析其相互作用界面是否符合已知的伴侣蛋白-效应蛋白相互作用模式。
研究结果
2.1 T3SS伴侣蛋白和效应蛋白在铜绿假单胞菌菌株中高度普遍
对超过15000个含有T3SS核心组件的铜绿假单胞菌基因组的分析表明，已知的T3SS伴侣蛋白和效应蛋白/调控因子广泛存在。例如，除了与exoU配对的spcU外，其他已知伴侣蛋白在超过99%的基因组中被检测到。大多数已知效应蛋白也存在于超过99%的基因组中，而exoS和exoU则分别存在于约72%和28%的基因组中，且二者倾向于不在同一基因组中共存。分析还发现，部分基因组含有伴侣蛋白（如SpcU）却缺失其已知的对应效应蛋白（如ExoU），提示这些伴侣蛋白可能还有其他作用靶点或功能。
2.2 在铜绿假单胞菌泛基因组中鉴定T3SS I类伴侣蛋白
基于已知T3SS I类伴侣蛋白共有的保守三维折叠（αβα三明治），研究人员通过结构分类方法，在泛蛋白质组中不仅成功定位了所有5个已知的伴侣蛋白（如SpcU、SpcS、ExsC等），还额外发现了3个具有相同折叠的蛋白簇：DUF3156、YflI和YbjN。然而，后三者同样广泛存在于不含有T3SS的P. paraeruginosa菌株中，暗示它们虽然结构与T3SS伴侣蛋白同源，但功能可能已经分化。
2.3 AlphaFold2能够识别T3SS伴侣蛋白的相互作用伙伴
研究团队建立了一个评估体系，以7对已知的铜绿假单胞菌T3SS伴侣蛋白-效应蛋白/调控因子对作为阳性对照，以伴侣蛋白与必需基因的配对作为阴性对照。结果表明，从AlphaFold2预测的距离图中计算得到的相互作用概率，能有效区分真假相互作用。在信号噪声比低至1:500的情况下，该方法仍能保持良好的区分能力。基于此，研究对约15.7万对蛋白质进行了大规模筛选，并以相互作用概率大于0.95作为阈值，初步筛选出180个候选相互作用对。
2.4 T3SS伴侣蛋白与效应蛋白之间存在保守的相互作用模式
通过对已知实验结构的分析，发现典型的I类伴侣蛋白-效应蛋白相互作用界面通常涉及伴侣蛋白N端的β链与效应蛋白N端未折叠区域的β链配对，以及伴侣蛋白β片层上的疏水残基与效应蛋白的相互作用。利用AlphaFold3对候选复合物进行建模后，研究人员将“伴侣蛋白N端β链是否参与相互作用”作为一个重要的结构筛选标准。结合AlphaFold2的相互作用概率和AlphaFold3的界面模式分析，最终确定了44个高置信度的预测相互作用对。
2.5 预测的新型T3SS效应蛋白或调控因子
在高置信度的预测结果中，包含了一些可能具有新颖功能的蛋白。例如：
- 1.
LbcA：预测与伴侣蛋白SpcU强烈相互作用。LbcA是蛋白酶CtpA的支架蛋白，而CtpA已被证明对T3SS功能至关重要，此预测可能将CtpA的蛋白质量控制功能与T3SS联系起来。
- 2.
EatR：一个σ54依赖的转录调控因子，预测与SpcU相互作用。EatR调控乙醇胺代谢相关基因，而乙醇胺是宿主组织中丰富的营养物质，此相互作用可能帮助细菌在感染环境中适应并利用宿主养分。
- 3.
短肽蛋白：预测发现了几个可能与T3SS相关的小蛋白，包括一个仅51个残基、标注为“二氢嘧啶酶”的片段，以及一个含有真核生物典型的钙离子结合结构域（EF-hand domain）的蛋白。后者可能与感知感染过程中钙离子浓度变化、从而调控T3SS活性有关。
2.6 涉及T3SS伴侣蛋白同源物的高置信度相互作用
对于三个结构同源但功能可能已分化的蛋白（DUF3156, YflI/BacA, YbjN），研究也预测了它们的高置信度相互作用伙伴，揭示了其潜在的非经典功能：
- 1.
DUF3156与VapD：预测DUF3156与毒素蛋白VapD强烈相互作用，且相互作用界面与已知的VapD-抗毒素（VapW）复合物界面重叠，提示DUF3156可能作为VapD的非同源抗毒素发挥作用。
- 2.
BacA (YflI) 与 BacB：预测这两个位于同一操纵子的蛋白相互结合，这与它们共同参与生物被膜形成和毒力的已知功能一致。
- 3.
YbjN与一个假设蛋白：预测YbjN与一个功能未知的蛋白相互作用，可能揭示了YbjN在调控运动性和环境应激中新的作用机制。
研究结论与意义
本研究成功展示了一种可扩展、可解释的计算生物学策略，它将基因组尺度的结构筛查与基于深度学习的互作预测相结合，用于绘制细菌病原体中伴侣蛋白-效应蛋白网络。研究不仅证实了AlphaFold2在蛋白质组规模上识别真实蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的能力，即使信噪比极低，也拓展了人们对铜绿假单胞菌T3SS系统的认知边界。
具体而言，该研究通过系统性的计算分析，鉴定出多个全新的、高置信度的候选T3SS效应蛋白和调控因子，包括推定的脂蛋白、钙结合蛋白和转录调控因子，它们可能参与宿主适应、T3SS调控和毒力调节。同时，发现了DUF3156、YflI（BacA）和YbjN等T3SS伴侣蛋白同源物，它们可能扮演着非经典的抗毒素或毒力调控角色，显示了蛋白结构折叠在进化过程中的功能可塑性。
这些发现极大地丰富了铜绿假单胞菌毒力通路的知识体系，为后续实验验证提供了明确的方向和靶点。通过揭示T3SS这一关键毒力装置的新组件和调控节点，该研究为开发针对细菌感染的新型抗菌疗法（如阻断关键蛋白质-蛋白质相互作用）奠定了重要的理论基础。此外，研究所建立的分析流程具有普适性，可推广至其他人类病原体，用于系统性发掘其毒力相关蛋白互作网络，对于理解和应对细菌感染性疾病具有重要的科学意义和应用前景。
