利用亚胺还原酶（IREDs）与还原胺化酶（AspRedAm）催化生物质衍生物Cyrene和Levoglucosenone的不对称胺化：通向高附加值手性胺的绿色合成新策略

《Biocatalysis and Biotransformation》：Studies on the enzymatic amination of the biomass derivatives cyrene and levoglucosenone

本研究报道了利用亚胺还原酶（IREDs）及还原胺化酶（AspRedAm）对生物质平台分子Cyrene和Levoglucosenone进行酶促还原胺化的探索。研究人员旨在开发可持续的生物催化方法，以高效、高选择性地合成具有高附加值的复杂手性胺类化合物，以解决传统化学方法在原子经济性、选择性和环保性方面的不足。结果表明，所测试的三种IREDs能高选择性地催化Cyrene生成（S）-型胺产物，而AspRedAm则表现出非选择性，可得到不易获得的（R）-型产物。该工作为利用可再生原料制备医药、农药等领域关键手性胺中间体提供了新思路，并验证了固定化生物催化剂在提升操作稳定性方面的潜力。

　　

在追求可持续发展的全球浪潮中，化学家们正努力从石油等不可再生资源转向以生物质为基础的原料。纤维素，作为地球上最丰富的可再生生物聚合物，经热解可转化为一类极具潜力的平台化合物，其中Cyrene（二氢左旋葡聚糖烯酮）和Levoglucosenone（左旋葡聚糖烯酮）是两颗耀眼的明星。它们不仅本身可作为绿色溶剂，其独特的刚性双环结构和固有手性，更使其成为合成药物、天然产物及高性能材料等复杂分子的理想“积木块”。然而，如何将这些“绿色积木”精准、高效地转化为具有特定立体构型的高价值化学品，尤其是手性胺类化合物，仍是当前合成化学面临的一大挑战。手性胺广泛存在于众多生物活性分子中，其立体构型的纯度往往直接决定了药物的疗效与安全性。传统的化学合成方法，尽管有效，但在原子经济性、步骤效率以及对环境的影响（如使用有毒试剂、产生大量废物）方面常不尽如人意。因此，开发一种高效、高选择性且环境友好的合成策略，从可再生原料直接获取光学纯手性胺，具有重要的科学意义和应用前景。正是在此背景下，一项发表在《Biocatalysis and Biotransformation》上的研究，将目光投向了生物催化这一强大工具。

本研究探索了利用亚胺还原酶（Imine Reductases, IREDs）和一种特殊的还原胺化酶（AspRedAm）来催化Cyrene和Levoglucosenone与两种功能化胺（烯丙胺和丙炔胺）的不对称还原胺化反应。研究的目标是评估这些酶对生物质衍生底物的催化性能与立体选择性，并将其与传统的化学还原方法进行对比。更为重要的是，研究团队进一步将关键酶AspRedAm与辅酶再生酶葡萄糖脱氢酶（Glucose Dehydrogenase, BmGDH）共同固定在活化琼脂糖载体上，制备了一种非均相生物催化剂，并系统考察了其储存稳定性和操作稳定性，为潜在的规模化应用奠定了基础。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：1. 酶的重组表达与纯化：在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中重组表达并纯化了三种IREDs（分别来自Cystobacter ferrugineus, Penicillium camemberti, Streptomyces rimosus）、还原胺化酶AspRedAm（来自Aspergillus oryzae）以及来自Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶（BmGDH）。2. 酶活性测定：采用基于NADPH在340 nm处吸光度变化的紫外-可见分光光度法，分别测定了AspRedAm和BmGDH的酶活。3. 酶的固定化：通过将琼脂糖活化制备成乙醛基琼脂糖（glyoxyl-agarose），将AspRedAm与BmGDH共价共固定于此载体上。4. 化学与酶促合成及产物分析：进行了克级规模的化学还原胺化（以NaBH₄为还原剂）和酶促合成实验。产物的结构、纯度及反应转化率通过薄层色谱（TLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、核磁共振（包括¹H NMR, ¹³C NMR, COSY, HSQC, NOESY）等多种分析技术进行表征与鉴定。

结果

1. 酶促还原胺化反应的选择性评估

研究首先在分析规模上测试了三种IREDs（IRED23, IRED63, IRED85）和AspRedAm对Cyrene底物的催化性能。气相色谱分析结果表明，无论是使用烯丙胺还是丙炔胺作为胺供体，三种IREDs都表现出与化学还原（NaBH₄）相同的高选择性，主要生成同一种立体异构体。与之形成鲜明对比的是，AspRedAm对两种胺供体均未显示出立体选择性，生成了近乎等量的两种非对映异构体（epimer）混合物。这一关键发现意味着AspRedAm能够合成出通过化学还原或IREDs催化难以大量获得的另一种构型的产物。

2. 产物结构鉴定与绝对构型确定

为了明确产物的结构，研究团队首先对化学还原得到的主要产物进行了克级制备和全面的波谱分析。通过一维和二维核磁共振技术（¹H NMR, ¹³C NMR, COSY, HSQC, NOESY），并结合对耦合常数和γ-效应（gamma effect）的分析，成功确定了主要产物的绝对构型。分析显示，化学还原及三种IREDs催化的主要产物中，新引入的氨基处于平伏键位置，并且与含氧桥键呈顺式（cis）关系，从而将其绝对构型确定为（S）-型，对应的化合物分别命名为5a（烯丙胺产物）和6a（丙炔胺产物）。

3. 非优势构型产物的分离与鉴定

为了获取并鉴定由AspRedAm产生的另一种非优势构型产物，研究人员对AspRedAm催化的反应进行了放大。对于烯丙胺产物，通过用Boc酸酐对粗产物混合物进行衍生化，成功分离并纯化得到了两种非对映异构体的Boc保护产物7a和7b，并通过NMR和质谱（ESI-MS）进行了确证。对于丙炔胺产物，则通过快速柱色谱法直接分离得到了两种纯净的非对映异构体6a和6b，其¹H NMR谱图清晰显示了二者的差异。

1H NMR谱图对比：顶部为AspRedAm催化Cyrene与丙炔胺反应的粗产物混合物谱图，中部和下部分别为分离纯化后的产物6a和6b的谱图，显示了二者在特定化学位移处的信号差异。">

4. 对Levoglucosenone的催化尝试

当研究将底物从Cyrene替换为另一个平台分子Levoglucosenone时，在所有测试的酶（三种IREDs和AspRedAm）催化下，均未观察到产物生成。这一结果突显了这些生物催化剂对底物结构的特异性，也表明对于不同结构的生物质衍生物，可能需要筛选或改造适配的酶才能实现高效转化。

5. 固定化生物催化剂的性能研究

为了提高酶的稳定性和可回收性，研究将AspRedAm与BmGDH共同固定在乙醛基琼脂糖上。性能评估显示，这种固定化生物催化剂在4°C储存21天后，仍能保持超过99%的初始活性，展现了优异的储存稳定性。在操作稳定性测试中，固定化催化剂可连续重复使用于Cyrene与烯丙胺的反应中。在前6个反应循环中，转化率均接近100%；随着使用次数增加，活性逐渐下降，至第11个循环时转化率降至约50%。这一结果证明了固定化策略在实现生物催化剂循环利用、降低过程成本方面的有效性。

结论与讨论

本研究系统评估了三种IREDs和还原胺化酶AspRedAm在催化生物质衍生平台化合物Cyrene不对称胺化反应中的性能。核心结论在于明确了不同酶类的催化特性：三种IREDs能够高立体选择性地催化反应，专一性地生成（S）-构型的手性胺产物（5a, 6a）；而AspRedAm则表现出独特的非选择性催化能力，能够以相近的比例获得两种非对映异构体，从而为合成不易通过化学方法或IREDs获得的（R）-构型产物（5b, 6b）提供了高效的生物催化途径。这一发现扩展了利用生物催化手段从同一可再生底物获取不同立体构型产物的工具箱。

然而，研究也揭示了生物催化剂的底物局限性，相同的酶体系未能催化另一个重要平台分子Levoglucosenone的胺化反应，这指明了未来研究需要针对不同底物结构进行酶库筛选或蛋白质工程改造的方向。

本研究的重要意义在于将生物催化这一绿色合成工具成功地应用于特定生物质平台分子的价值提升。它不仅提供了一种原子经济性高、步骤简洁、条件温和（水相缓冲液，30°C）的方法来合成具有高附加值的手性胺，而且通过固定化技术增强了催化剂的实用性能。所获得的含双键或三键的功能化手性胺产物，为进一步的化学修饰（如点击化学、聚合反应）提供了便利，有望作为关键中间体用于医药、农用化学品及功能材料等领域。这项工作为基于可再生资源的精细化学品可持续制造提供了新的思路和实验依据，是开发生物炼制下游高值化路线的有益探索。研究成果也呼应了其所属的意大利PRIN SUST-CARB项目的核心目标，即开发高效、可持续的方法将生物基基础原料转化为复杂的高附加值化学品。