《Biomolecules》：Heterotopic Ossification: Molecular Drivers, Subtype-Specific Mechanisms, and Translational Therapeutic Advances
Sihong Chen and
Hui Lin
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这篇综述聚焦于异位骨化（HO）的病理机制与精准治疗，系统阐述其分子驱动因素、亚型特异性（tHO、FOP、POH）机制及关键通路（BMP、Activin A、TGF-β、Hh信号等）的交叉对话，并前瞻性地讨论了靶向ACVR1、Activin A抗体、RARγ激动剂等新型疗法，旨在构建分层、基于机制的HO管理框架，推动对异常组织再生和精准治疗的深入理解。
1. 引言
骨骼形成通常仅发生在出生前发育和出生后骨骼修复过程中。然而，在严重创伤或特定基因突变后，骨骼可能在非骨骼软组织中异常发育，这一过程被称为异位骨化（HO）。HO严重损害患者活动能力和生活质量。本综述重点关注三种主要亚型：获得性创伤性HO（tHO）、遗传性进行性骨化性纤维发育不良（FOP）和进行性骨发育异常（POH），分析其关联信号通路以探索潜在治疗靶点。
2. HO的患病率
创伤后HO是骨折患者中一个显著的并发症，发生率在12%到25%之间。在军事创伤报告中，高达60%的爆炸伤与HO相关，表明高风险。在解剖部位上，HO在髋关节置换术等外科创伤后，主要在臀中肌中显现，发生率可达约40%。脑和脊髓损伤后，有10%到20%的患者被诊断为HO，导致关节疼痛和功能障碍。
3. 异位骨化的发病机制
3.1. HO的细胞参与者和关键机制
异位骨化的病理过程涉及多种细胞类型和分子通路。炎症细胞，如巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞，启动了获得性和遗传性HO中前体细胞的分化。这些免疫细胞释放一系列细胞因子和生长因子。间充质干细胞在组织修复中起关键作用，其功能受微环境信号调节。由于异位骨化病因的异质性，多种细胞类型参与其中，主要是造血细胞、内皮细胞、纤维脂肪源性祖细胞、肌肉卫星细胞、周细胞和肌腱韧带祖细胞。
HO的发育病理过程涉及双相机制：初始的炎症和结缔组织降解，随后是骨形成。炎症在HO的发展和进展中起着核心作用。组织损伤诱导的急性炎症不仅启动HO，还通过免疫系统的激活驱动其早期进展。在FOP中，轻微的创伤和疫苗接种后引发的强烈急性炎症反应，与异位骨化的遗传变异有关。炎症不仅促进HO的起始，也影响其进展。炎症介质通过同时促进骨形成和加剧炎症发挥双重作用。
骨形成相分为三个连续阶段：纤维增殖与血管生成、软骨形成和骨形成。软组织损伤触发免疫激活和局部缺氧，作为诱发因素。在这个特定微环境中，间充质前体细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，最终导致异位骨的形成。
在HO重塑过程中，结缔组织和骨骼肌通常表现出血管周围的淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞浸润。成骨祖细胞聚集形成软骨前体结构，逐渐分化为软骨细胞，产生软骨模板。随着时间的推移，这些软骨模板成熟和肥大，最终被软骨内成骨取代，产生成熟的骨组织。在FOP中，软骨生成过程的损伤不仅导致异位骨形成，还常伴有生长板成熟缺陷、早发性骨关节炎和关节结构异常。相比之下，在POH中，骨化过程主要通过膜内成骨完成。在这个过程中，间充质细胞不经过中间软骨阶段，直接分化为成骨细胞，随后形成骨化中心。
3.2. HO主要亚型的机制
3.2.1. 创伤性HO（tHO）的机制
tHO是一个复杂的病理过程，核心机制涉及损伤、炎症反应和异常成骨信号通路的激活。损伤引发巨噬细胞和单核细胞等炎症细胞迁移到局部微环境中，显著提高TNF、IL-1β、TGF-β、IL-6和MCP-1等促炎细胞因子的浓度。这种炎症反应进一步促进了特定干细胞群的动员和刺激，并在局部激活了成骨信号通路。随后，这一系列顺序事件最终导致骨和软骨的形成，以及异位骨组织的沉积。肌肉损伤被认为是HO发展的关键起始因素。严重的创伤，包括骨折、爆炸伤和外科手术，经常导致大量肌肉损伤。肌肉损伤的程度与干细胞成骨潜能增加以及HO可能性增加相关。神经损伤，包括脊髓损伤和创伤性脑损伤，是HO发展的重要因素。神经损伤不仅直接诱发神经源性HO，还会破坏血脑屏障，导致各种细胞因子和成骨因子进入全身循环。这个过程放大了创伤后炎症反应，创造了有利于HO形成的微环境。
3.2.2. 进行性骨化性纤维发育不良（FOP）的机制
FOP是一种罕见的遗传病，归因于ACVR1基因的变异，其中ACVR1 R206H是一个显著的例子。FOP的病理生理基础涉及BMP信号通路失调和先天免疫系统的异常激活。研究表明，ACVR1 R206H突变诱导了一种持续的促炎症状态。这种情况独立于急性疾病发作而发生，并可能通过Toll样受体4（TLR4）信号级联进行调节。在分子水平上，脂联素和腱蛋白C与FOP基因型高度相关。FKBP1A是BMP信号通路的负调节因子。在正常情况下，FKBP12与I型受体相互作用，抑制SMAD蛋白的激活。然而，BMP与受体的结合降低了FKBP12与I型受体之间的亲和力，从而解除了对SMAD激活的抑制。因此，在FOP中，突变受体ACVR1R206H与FKBP12结合减少是HO发展的核心驱动因素。
3.2.3. 进行性骨发育异常（POH）的机制
与GNAS突变相关的HO的特征是真皮或皮下脂肪层中驻留的MSC或未分化祖细胞的异常成熟。对人间充质干细胞的研究表明，Gsα蛋白水平降低促进成骨分化，同时抑制脂肪细胞形成。在POH小鼠模型中的研究表明，增强的刺猬信号通路活性对于调节间充质祖细胞分化和成骨是必不可少的。具体来说，GNAS纯合子功能丧失突变导致这些动物中cAMP和蛋白激酶A水平降低。此外，PKA活性的降低进一步导致Hh信号传导的去抑制，从而增强成骨细胞成熟和异位骨发育。与由BMP信号失调驱动的FOP不同，POH的发病机制突出了Hh通路在遗传性HO中的独特地位。因此，通常对炎症性异位骨化有效的传统抗炎疗法，在POH中可能提供有限或没有治疗益处。
4. HO的主要信号通路和调控网络
4.1. BMP信号通路：HO的核心驱动因素
属于转化生长因子家族的BMP，是组织稳态和分化的重要信号分子，尤其是在软骨和骨骼中。BMP信号分为经典的SMAD依赖性和非经典的SMAD独立级联。在经典框架中，I型受体的激活诱导SMAD1/5/8在其COOH末端磷酸化，从而激活它们并促进它们与转录因子SMAD4的相互作用。相反，非经典SMAD途径涉及TAK1、p38 MAPK、ERK或JNK的激活，这些因子启动不同的信号通路。BMP信号通路是调节成骨和软骨形成的关键。该分子通路的异常与多种疾病相关，包括FOP和肿瘤性疾病。BMP2和BMP4水平升高，是软组织损伤后分泌的关键引发剂，当引入小鼠肌肉组织时，已被确定为启动HO的关键因素。这些因子在支持成骨细胞分化和骨诱导中至关重要。
4.1.1. tHO中BMP信号通路的响应性上调和作用
报告表明，BMP水平在炎症过程后增加，并随后分泌到受伤的软组织中。在损伤模型中，BMP相关基因的上调进一步支持了这些发现。在体外和体内，外源性激活TGF-β/BMP通路被广泛用于诱导骨化。总之，这些发现强调了BMP信号通路对HO的重要影响，为未来靶向治疗干预的研究奠定了坚实的基础。
4.1.2. FOP中BMP信号通路的响应性上调和作用
研究证实BMP信号通路在FOP的病理生理学中至关重要。根本原因在于编码ACVR1的ALK2基因中存在功能获得性突变。这种突变导致受体自身抑制的丧失、构象变化和持续对BMP配体过敏的状态，最终导致BMP-SMAD1/5/8通路的过度激活，从而驱动HO。更重要的是，ACVR1 R206H突变赋予受体一种疾病特异性功能：对另一种配体——激活素A的异常反应。激活素A是一种由免疫细胞分泌的炎症细胞因子，是TGF-β超家族的成员，通常与SMAD2/3信号传导相关。在生理条件下，激活素A通过ALK4/7和ACVR2A/B受体传递信号，但不会通过野生型ACVR1激活BMP特异性的SMAD1/5/8通路。然而，在FOP中，突变受体将激活素A误认为是BMP样激动剂。因此，当组织损伤或炎症使激活素A水平升高时，其与突变ACVR1复合物的结合导致SMAD1/5/8的强烈磷酸化，从而将这种典型的炎症细胞因子转移到成骨BMP信号级联中。这种“配体误识别”机制直接解释了FOP的临床特征，即轻微的炎症可引发严重的骨化发作。针对这一轴的治疗策略因此成为FOP药物开发的主要焦点，并在临床试验中显示出前景。
4.2. TGF-β1信号通路：炎症和骨化的调节因子
转化生长因子β1是骨微环境中的关键信号分子，尤其是在骨形成和重塑过程中。在正常的骨折愈合中，TGF-β是必需的，因为它促进间充质祖细胞的增殖和分化，刺激细胞外基质产生，并吸引成骨细胞。TGF-β在促进软骨形成、骨痂发育和增强骨强度方面也至关重要。体内研究表明，TGF-β加速骨折愈合并改善骨重塑。然而，一些研究表明，创伤或外科干预后TGF-β表达水平升高与异常异位骨形成有关，这种关联在损伤或手术部位周围尤为明显。TGF-β超家族包括几个成员，包括BMP、TGF-β、激活素和抑制素。在典型的TGF-β/BMP信号级联中，配体附着于I型和II型受体，激活SMAD作为信号转导因子。BMP激活SMAD1/5/8，而TGF-β激活SMAD2/3。这些激活的SMAD随后与SMAD4形成复合物，易位到细胞核中调节靶基因的表达。一个关键的下游靶点是RUNX2基因，它是骨形成的关键调节因子，在受异位骨化影响的组织中明显过表达。
TGF-β诱导的SMAD2/3激活增强成骨祖细胞迁移和早期分化，同时损害后期骨形成。SMAD2/3的磷酸化导致RUNX2转录抑制，而SMAD3招募HDAC4和HDAC5，进一步抑制RUNX2功能。相反，骨形成也受TGF依赖性非SMAD途径调节，其中受体结合激活TAB1-TAK1复合物，导致p38 MAPK或ERK1/2通路刺激。这种激活增强RUNX2活性并支持破骨细胞分化。TGF-β在骨代谢中充当双重调节因子，连接骨形成和骨吸收的机制。在FOP中，巨噬细胞中ACVR1信号过度激活导致TGF-β和促炎细胞因子分泌过多。靶向TGF-β的中和抗体在FOP和获得性HO实验模型中已实现HO进展的显著减少。
4.3. 激活素A信号通路：FOP的致病突变
FOP是由BMP受体ACVR1（ALK2）的获得性突变引起的，R206H变体是主要突变。尽管FOP和tHO共享类似的信号通路，但它们在生理上有所不同。激活素属于TGF-β超家族，是先天免疫细胞释放的细胞因子，例如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞在软组织损伤后释放。激活素A通常通过I型受体和II型受体激活信号。这些受体被激活时，磷酸化SMAD2/3，产生下游效应。尽管激活素A与野生型ALK2结合，但它不能诱导SMAD1/5的磷酸化，也不能抑制BMP信号传导。然而，ALK2中的突变增强了对BMP配体的反应，并且即使在无配体情况下也能维持活性。最近的研究表明，激活素A通常激活SMAD2/3，但可以通过突变的ALK2激活SMAD1/5。值得注意的是，ACVR1中的精氨酸到组氨酸的替代导致激活素A附着于II型和I型受体复合物时下游信号异常上调，产生类似于BMP结合SMAD1/5/8诱导的信号。除了获得对激活素A的异常反应性外，ACVR1 R206H突变体对其典型BMP配体的调节功能也发生了根本性转变。在生理条件下，野生型ACVR1通过与BMPR1A或BMPR1B竞争它们共享的II型受体BMPR2，在BMP通路中充当稳态调节因子。这种竞争抑制了BMPR1A/B介导的BMP信号传导和成骨分化。然而，在FOP中，ACVR1R206H突变体完全丧失了这种竞争性抑制功能。研究表明，当与BMPR1A或BMPR1B共表达时，突变体反而协同增强BMP信号输出。这表明ACVR1R206H的功能失调是双重的：一方面，它获得了误识别和响应激活素A的能力；另一方面，它与BMP通路中其他关键I型受体的相互作用模式从正常的“竞争性抑制”逆转为“协同激活”。这种功能转变进一步破坏了细胞内BMP信号传导的平衡，并可能构成驱动FOP中HO的关键机制。
研究表明，各种稳定表达ALK2R206H的细胞系，包括来自FOP患者的诱导多能干细胞、HEK293T细胞、人类脱落乳牙干细胞和FOP小鼠模型的胚胎干细胞，在暴露于激活素A时获得了激活SMAD1/5信号传导的能力。BMP通常通过I型受体ALK2传递信号，而激活素A通过结合ALK4/7诱导SMAD2/3磷酸化。尽管激活素A能够与ALK2相互作用，但它通常不会触发SMAD1/5磷酸化，反而会抑制BMP信号传导。然而，在FOP中，激活素A通过突变的ALK2激活SMAD1/5磷酸化，导致HO形成。激活素A水平在炎症期间迅速上升，其效应受与卵泡抑素等天然抑制剂的相互作用以及组织水平的扩散梯度调节。激活素A与细胞水平的II型受体ACVR2A和ACVR2B以及I型受体ALK4或ALK7相互作用导致SMAD2/3磷酸化。这种信号传导调节靶基因表达，影响细胞反应。此外，激活素A由巨噬细胞和其他反应性免疫细胞在炎症期间分泌，触发促炎细胞因子的分泌，包括IL-1β和TNF，以及肥大细胞募集，这是HO初始阶段的关键机制。在FOP小鼠模型中系统性抗体给药有效抑制了约70%的HO。人类突变ACVR1R206H在小鼠模型中的引入导致了类似FOP的表型，强调了ACVR1失调在FOP发展中的关键作用。因此，靶向ACVR1或其下游信号通路的治疗策略已成为FOP研究的焦点。
4.4. 视黄酸信号通路：软骨形成的抑制性调节
类视黄醇源自维生素A的代谢，包括视黄醇、视黄酯和视黄酸等亲脂性化合物，在胚胎生长以及组织和器官功能的维持中发挥关键作用。脊椎动物基因组编码三种RAR基因和三种RXR基因，每种在组织和发育阶段表现出不同且动态的表达模式。视黄醇主要是无活性的，通过STRAT6转运蛋白被细胞吸收，并由细胞质中的RDH和RALDH酶促转化为活性代谢物全反式视黄酸。尽管含量较低，活性类视黄醇如9-顺式和13-顺式RA在特定组织类型中生成。细胞类视黄醇结合蛋白有助于将类视黄醇转运到细胞核中，使它们能够调节RAR和RXR的转录活性。研究表明，类视黄醇和RAR对出生前骨骼形成和出生后骨骼生长都至关重要，影响细胞增殖、分化、存活和形态发生等关键过程。调节软骨形成对HO至关重要，因为这个病理过程依赖于软骨形成。一个关键问题是凝聚的间充质细胞如何被导向软骨形成，而不是其他分化途径，如纤维形成或脂肪形成。证据表明，这种定向是由涉及SOX5/6/9基因家族以及BMP和TGFβ超家族成员介导的信号通路驱动的。研究表明，生长板缺乏内源性活性类视黄醇，这表明RAR通常作为无配体抑制因子发挥作用，以维持生长板活性。在HO中，异位组织块首先表现出纤维增生特征，然后转变为软骨形成和软骨内骨化。
来自使用RARE-LacZ报告基因小鼠研究的证据表明，在软骨形成和软骨发育过程中，肢体间充质凝聚缺乏活性类视黄醇信号传导，但在邻近的祖细胞中高度活跃，有助于肌生成和纤维形成。Maurizio Pacifici的研究表明，抑制类视黄醇信号传导可增强软骨形成和生长板活性，无配体RAR作为抑制因子发挥作用。结合生化分析证实，早期间充质凝聚、成熟软骨组织和生长板表现出低水平的内源性类视黄醇。此外，Underhill的研究小组证明，无配体RAR对软骨形成至关重要，通过详细的细胞和分子研究调节关键的软骨生成基因和信号分子。作者观察到，早期前骨骼祖细胞最初表达RARα，但随着它们承诺软骨形成和分化，它们转换为表达RARγ。这种转换与RALDH2和CRABP水平的显著降低以及CYP26表达的增加有关。总之，这些研究证实软骨形成需要活性类视黄醇信号的显著减少或缺失，当ATRA结合RAR时，基因转录启动，而在其不存在时，基因表达被抑制。因此，如果要促进异位骨形成，应通过（i）从早期软骨形成祖细胞中去除内源性视黄酸和载体蛋白，（ii）通过未连接的RAR抑制抗软骨形成通路，以及（iii）促进促软骨形成通路的表达和功能来实现。
4.5. 刺猬（Hh）信号通路：HO的核心整合因子
Hh信号通路代表了一个保守的系统，对胚胎发生、器官稳态、组织修复和损伤后再生至关重要。对该通路的破坏可导致肌肉骨骼组织稳态受损。Hh信号级联由Hh蛋白协调，其激活涉及一个复杂的多步骤过程。在该通路的关键配体中，印度刺猬和声波刺猬尤为重要，因为它们对肌肉骨骼系统的正常发育不可或缺。
Hh信号激活发生在配体与跨膜受体Patched 1结合时。这种结合事件解除了PTCH1对Smoothened的抑制影响，SMO是一种特异性定位于初级纤毛内的细胞表面蛋白。初级纤毛从哺乳动物细胞的顶表面突出，是多个信号级联的重要枢纽。在正常情况下，没有Hh配体时，PTCH1主动抑制SMO功能。相反，配体与PTCH1结合诱导SMO激活。这种激活导致抑制因子Sufu的降解，进而通过GLI-Kruppel家族转录因子启动下游信号传导。Gli1主要作为转录激活因子发挥作用，而Gli3主要是转录抑制因子。Gli2则表现出环境依赖性功能，根据特定细胞环境能够激活或抑制转录。IHH对成骨细胞分化至关重要。成骨细胞最初出现在软骨区域附近，特别是靠近肥大和预肥大软骨细胞。在这些软骨细胞内，IHH信号传导激活转录因子Gli2，从而上调ALP和OCN活性。这表明，IHH通过Gli2激活驱动成骨细胞分化。因此，IHH在肥大软骨细胞中的高表达对这一过程至关重要。
先前的研究表明，在间充质和神经
