高剂量Griffithsin卡拉胶快速崩解阴道栓剂用于预防HIV、HSV-2和HPV的临床前评价

《Microbiology Spectrum》：Preclinical evaluation of high-dose Griffithsin carrageenan fast-dissolving insert for HIV, HSV-2, and HPV prevention

　　

Griffithsin (GRFT)是一种抗病毒凝集素，可阻断人类免疫缺陷病毒(HIV)进入。当与卡拉胶(CG)结合时，GRFT对2型单纯疱疹病毒(HSV-2)和人乳头瘤病毒(HPV)具有很强的活性。研究人员对一种含有3毫克GRFT(相当于临床剂量的3倍)的高剂量阴道快速崩解栓剂(FDI)进行了临床前评估，并将其与1毫克制剂进行了比较。研究包括FDI崩解(猕猴、兔)；GRFT的药代动力学、药效学及炎症反应(猕猴)；毒性(大鼠)；和免疫原性(猕猴、大鼠)。崩解时间因物种而异，强调了在人类中评估此参数的重要性。在猕猴中，施用3毫克GRFT/CG FDI后12小时，宫颈阴道灌洗液(CVL)中的GRFT浓度超过了与体内功效相关的水平。在施用3毫克剂量后24小时和施用1毫克剂量后12小时收集的CVL中检测到强效的抗HIV-1BaL活性。两种GRFT剂量施用后4小时，CVL抑制了HSV-2，在12小时抑制了HPV。GRFT/CG FDI未引起炎症反应，也未改变阴道pH值。在大鼠中，每日重复给药高达临床剂量10倍未发现安全性问题。尽管在猕猴和大鼠中产生了抗药物抗体(ADAs)，但未检测到系统性的GRFT，表明ADAs不太可能改变药代动力学。总体而言，施用3毫克GRFT/CG FDI后的CVL GRFT浓度和抗HIV活性表明，与1毫克FDI相比，针对HIV-1的保护窗口更长——至少12小时，且两种制剂均显示出抗HSV-2和HPV的活性。这些发现支持继续开发GRFT/CG FDI。

一、 研究背景、问题与研究目的

性传播感染(STI)是全球重大健康负担，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)和人乳头瘤病毒(HPV)。尽管暴露前预防(PrEP)是HIV预防的基石，但目前尚无获批的产品能够同时提供针对多种性传播病原体的广谱保护。开发能够同时预防HIV和其他性传播病原体(如HSV和HPV)的多用途预防技术(MPT)存在迫切需求。为解决这一未满足的需求，Population Council正在开发一种由用户控制、按需使用的MPT产品——阴道Griffithsin (GRFT)快速崩解栓剂(FDI)，用于预防HIV、HSV-2和HPV。GRFT是一种强效抗病毒凝集素，能在皮摩尔浓度下阻断HIV进入，并对HSV-2和HPV也具有活性，与卡拉胶(CG)联用可增强对后两种病毒的活性。先前研究表明，1毫克GRFT/CG FDI在猕猴模型中显示出保护作用。本研究旨在对相当于先前测试临床凝胶剂量3倍(3毫克)的GRFT/CG FDI进行临床前评估，并与相当于1倍临床剂量(1毫克)的FDI进行比较，以评估其崩解特性、药代动力学、安全性、免疫原性及体外抗病毒活性，从而支持其进一步开发和临床试验。

二、 关键技术方法

本研究采用多物种、多模型的综合临床前评估策略。主要技术方法包括：1. 体内崩解研究：在印度恒河猴和新西兰白兔中，通过阴道镜观察评估1毫克和3毫克GRFT/CG FDI的阴道内崩解时间进程。2. 药代动力学与药效学评估：在恒河猴模型中，通过单次和重复给药，系统收集不同时间点的血浆和宫颈阴道灌洗液样本，使用经过验证的电化学发光免疫分析法测定GRFT浓度，并评估其与体外抗病毒活性的关系。3. 安全性评价：在恒河猴中，通过检测CVL中细胞因子(IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10)水平和阴道pH值变化，评估制剂的局部炎症反应；在大鼠中，进行了为期28天的符合GLP规范的重复剂量毒性研究，使用高达临床剂量10倍的GRFT/CG凝胶，全面评估死亡率、临床体征、体重、食物消耗、临床病理学、组织病理学等指标。4. 免疫原性分析：在猕猴和大鼠中，通过桥接电化学发光法检测重复给药后血浆/血清中抗GRFT抗药物抗体(ADA)的产生情况。5. 体外抗病毒活性测定：利用从给药后猕猴CVL中获取的样本，在细胞模型上评价其对HIV-1_BaL、HSV-2 (G株)和HPV PsV-16的抑制活性。

三、 研究结果

1. 3和1毫克GRFT/CG FDI在猕猴体内表现出不同的崩解特征

猕猴体内崩解研究显示，1毫克FDI崩解速度快于3毫克FDI。1毫克FDI在20分钟(n=2)或60分钟(n=4)内溶解或变为无定形。3毫克FDI仅在两只动物中完全溶解(分别于40和80分钟)，其余四只动物的FDI体积减小，处于溶解过程中。

2. 3毫克GRFT/CG FDI在猕猴体内释放更高浓度GRFT且持续时间更长

药代动力学分析显示，与1毫克FDI相比，施用3毫克GRFT/CG FDI后CVL中检测到更高的GRFT浓度。施用3毫克FDI后1-12小时，CVL中的GRFT浓度高于与对抗高剂量SHIV162P3攻击效力相关的浓度水平。在FDI施用后的所有时间点(1, 4, 8, 12, 24, 48, 72小时)，血浆GRFT浓度均低于定量下限。

3. CVL中的GRFT在体外可有效抑制HIV-1_BaL、HSV-2和HPV感染

体外抗病毒实验表明，3毫克GRFT/CG FDI组在给药后长达24小时收集的CVL可减少细胞实验中的HIV感染，而1毫克FDI组在给药后长达12小时的时间点可减少感染。两组对HPV PsV16和HSV-2的抑制分别可持续至给药后12小时和4小时。抗病毒活性与CVL中GRFT浓度相关。

4. FDI释放GRFT不引起炎症且不改变猕猴阴道pH值

安全性评估显示，与施用安慰剂FDI或给药前一周采集的基线样本相比，施用GRFT/CG FDI后24小时，CVL中细胞因子(IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10)浓度未发生改变。同样，在施用GRFT/CG FDI或安慰剂FDI后1-72小时，也未观察到阴道pH值变化。

5. GRFT/CG FDI在猕猴体内诱导抗GRFT抗体

免疫原性分析表明，重复暴露于GRFT在猕猴中诱导了ADA反应。在1毫克和3毫克GRFT/CG FDI组中，分别有三只和四只动物检测到ADA，且3毫克组在后期时间点检测到更高的信号。由于未在血浆中检测到可定量的GRFT，ADA的存在不太可能改变药代动力学或系统安全性特征。

6. 3毫克GRFT/CG FDI在兔体内快速崩解

兔体内崩解研究显示，给药20分钟后，三只动物的FDI完全崩解；在另一组中，给药10分钟后，三只动物阴道内约剩余50%的FDI。观察到的阴道发红区域可能由给药操作过程中的创伤导致。

7. 高剂量GRFT在大鼠体内安全

在大鼠28天重复剂量毒性研究中，给予相当于临床剂量6倍和10倍的GRFT/CG凝胶(0.3或0.5毫克/天)后，未观察到毒性证据，且血清中未检测到GRFT。治疗结束时，在两只动物(一只接受3毫克/毫升，另一只接受5毫克/毫升治疗)的血清中观察到ADA。

四、 讨论与结论

讨论总结：

猕猴数据显示，施用3毫克GRFT/CG FDI后，CVL中GRFT浓度高于与1毫克GRFT/CG FDI保护作用相关的水平，表明3毫克制剂可能提供更长(至少12小时)的抗HIV-1保护窗口。体外抗HIV-1_BaL活性结果也支持这一观点。两种剂量的FDI均对HSV-2和HPV PsV 16表现出强效活性。与1毫克FDI结果相似，高剂量GRFT/CG FDI在猕猴和大鼠中均未导致可检测的血浆GRFT浓度，表明GRFT无或仅有极微系统吸收。在猕猴中未引起炎症反应、未改变阴道pH值，以及在大鼠高达10倍临床剂量的28天研究中未发现安全性问题，这些都进一步支持了GRFT的安全性。尽管重复暴露诱导了ADA反应，但由于无系统暴露，ADA不太可能改变药代动力学或安全性。FDI崩解研究在兔和猕猴中结果有差异，兔体内崩解迅速(20分钟内)，而猕猴体内高剂量FDI崩解时间较长(>1小时)，这反映了物种间生殖道解剖和生理环境的差异，最终需在人体研究中确认。与抗逆转录病毒药物相比，GRFT具有若干关键优势：极强的抗HIV活性(包括对耐药株)、抗HSV-2和HPV活性、阴道给药后系统吸收极少、有望成为非处方药。但其作为蛋白质生物制剂，存在免疫原性和生产成本较高的潜在劣势。

研究结论翻译：

总体而言，我们之前发表的GRFT/CG FDI安全性和有效性研究、使用GRFT阴道凝胶的1期临床试验数据以及本文中提出的表明安全性和抗HIV体外保护窗口延长以及对HSV和HPV具有活性的数据，都支持进一步开发和临床测试高剂量阴道GRFT/CG FDI用于预防HIV、HSV和HPV。