《Microbiology Spectrum》：Disruption of bacteriophage integration site promotes rapid diversification of multicellular traits in Bacillus subtilis
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本研究重新评估了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中噬菌体SPβ整合位点spsM的功能。研究发现，早期报道的spsM::kan突变株生物被膜缺陷实由未检测到的comP二次突变导致，而非spsM功能缺失。spsM::kan插入能显著提高突变率，促使调控运动性和生物被膜的关键基因(如swrA、comP)频繁发生自发突变，而标记缺失的ΔspsM株及SPβ溶原株则无此现象。该工作揭示了spsM基因座的不同破坏模式如何影响表型多样化倾向，强调了局部基因组背景在塑造细菌适应性进化中的关键作用。
细菌世界充满了惊人的可塑性和快速演化能力。以常见的土壤细菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为例，它能在短短几天内分化出形态各异的变体，展现出运动性、生物被膜形成能力和竞争互作模式的快速切换。这种快速的表型多样化不仅是实验室“驯化”过程中的常见现象，也常常导致本应基因型一致的菌株表现出不一致的表型，给科学研究带来了重复性和可解释性的挑战。先前研究表明，一种名为SPβ的温和噬菌体（原噬菌体）能整合到枯草芽孢杆菌基因组的一个特定位点——spsM基因中。spsM基因编码一种参与孢子外壳合成的多糖合酶。SPβ的整合会暂时破坏spsM基因，但在孢子形成等特定生理条件下又能被精确切除，恢复基因功能，这种机制被称为“主动溶原性(active lysogeny)”。有观点认为，SPβ整合到spsM位点可能会损害宿主的生物被膜形成，从而可能利于噬菌体在种群内的水平传播。生物被膜是细菌的一种多细胞聚集状态，被包裹在细胞外基质(ECM)中，对于环境抗性和种间互作至关重要。那么，破坏spsM位点是否真的会普遍影响枯草芽孢杆菌的多细胞性状？不同的破坏方式（如噬菌体整合、抗生素抗性基因插入、标记缺失敲除）是否会产生相同的后果？为了澄清这些问题，并为理解原噬菌体-宿主互作如何塑造细菌进化提供新见解，一个国际研究团队开展了深入探究。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：1) 采用基于CRISPR-Cas9的基因编辑和传统同源重组方法，在多种枯草芽孢杆菌天然分离株（如P9_B1、NDmed、PS-216）背景中，构建了spsM位点的不同遗传修饰株，包括标记缺失的ΔspsM敲除、spsM::kan插入突变以及SPβ溶原株。2) 通过标准化的固体培养基制备和宏观菌落培养，系统评估了不同突变株在多种培养基（LB、TSA、LBGM）上的菌落形态、生物被膜结构和表面特征，并利用图像分析软件（如ImageJ的SurfCharJ插件）和自定义的C++程序进行定量化分析。3) 利用软琼脂平板法系统测定了各菌株的泳动(swimming)和群集(swarming)运动能力。4) 通过自发突变筛选实验，对在宏观菌落边缘出现的形态变异体进行分离、纯化，并利用Sanger测序和全基因组测序(Illumina和PacBio平台)鉴定其基因型。5) 采用基于利福平抗性的波动实验(fluctuation assay)，精确估算了不同遗传背景菌株的突变率。6) 通过荧光标记菌株（GFP和mKate）的竞争共培养实验，评估了特定突变在生物被膜条件下的适应性优势。
结果
1. Emergence of new morphotype observed in B. subtilis P9_B1 with disruption of prophage integration locus spsM
研究人员首先在不同枯草芽孢杆菌分离株中重复了先前关于spsM::kan突变导致生物被膜形态变平的报道。他们发现，在临床分离株NDmed中，可以重复出spsM::kan (GM3248)菌株的平滑、无结构菌落形态。然而，在土壤分离株P9_B1中引入相同的spsM::kan突变，并未产生这种平滑形态，而是保留了典型的褶皱结构。更有趣的是，P9_B1 spsM::kan菌株在固体LB培养基上培养时，其宏观菌落边缘会频繁出现自发性的外围增生。这些增生体被分离纯化后，能稳定形成一种边缘不规则、类似棉絮状的“蓬松”(fluffy)形态，表明spsM::kan背景促进了自发突变体的出现。
2. “Fluffy” morphotype is caused by spontaneous mutation in swrA which rapidly arises in spsM::kan genetic background
对P9_B1野生型、spsM::kan及其衍生的“蓬松”突变体进行全基因组测序，发现“蓬松”表型是由swrA基因编码区第26位的一个胸腺嘧啶缺失(swrA:c.26delT)引起的。这个缺失位于一个连续8个T的同聚区，导致移码突变，从而使SwrA蛋白失活。SwrA是枯草芽孢杆菌中调控鞭毛生物合成和运动的关键转录调节因子。研究人员进一步通过构建swrA::tet敲除株，证实了swrA功能失活是导致“蓬松”菌株生物被膜形态改变（菌落更平展、褶皱更小）的原因。
3. Spontaneous mutation in swrA in the P9_B1 fluffy strain leads to loss of swarming and impaired swimming motility
运动性实验表明，P9_B1野生型和spsM::kan菌株具有相似的泳动和群集运动能力。而所有携带swrA突变（无论是自发的c.26delT还是人工敲除）的菌株，其群集运动能力完全丧失，泳动能力也显著受损。这证实了swrA的失活直接导致了运动性缺陷，进一步解释了“蓬松”表型与运动性丧失的关联。
4. Flat morphotype in B. subtilis NDmed spsM::kan (GM3248) is associated with spontaneous mutation in comP
为什么相同的spsM::kan突变在NDmed和P9_B1中产生了不同的表型？为了探究原因，研究人员对NDmed的一系列菌株进行了全基因组测序和分析。结果发现，先前报道中表现出平坦生物被膜形态的NDmed spsM::kan (GM3248)菌株，其基因组中存在一个独特的自发突变：comP基因第1222位的T>A替换(comP:c.1222T>A)。该突变引入了一个提前终止密码子，很可能导致ComP蛋白截短失活。ComP是ComQXPA群体感应系统的组氨酸激酶受体，参与调控表面活性素(surfactin)等次级代谢产物的合成。当研究人员在NDmed spsM::kan (GM3248)菌株中通过额外引入一个IPTG诱导的comP基因拷贝进行回补时，其野生型菌落形态得以恢复。相反，单纯回补spsM基因则无效。这些结果表明，NDmed spsM::kan (GM3248)菌株的平坦表型并非由spsM破坏直接引起，而是由其携带的自发comP突变导致。
5. Complete deletion and spontaneous mutation of comP lead to altered colony biofilm morphology and impaired swarming motility
进一步的研究表明，comP的完全敲除(comP::ery)和自发的点突变(comP:c.1222T>A)都会导致群集运动能力下降，并且运动前沿缺乏表面活性素产生的可见光晕。然而，这两种comP失活方式导致的宏观菌落形态有所不同，提示点突变和完全敲除可能通过不同的分子机制影响下游表型。
6. The spsM::kan permanent gene disruption increases mutation rates, which results in mutations affecting motility and biofilm morphology
为了探究spsM::kan背景为何如此频繁地出现自发突变，研究人员进行了系统的自发突变筛选和突变率测定。在P9_B1菌株中，spsM::kan和spsM::kan amyE::spsM（spsM回补株）中频繁观察到形态变异体，而野生型中几乎没有。对变异体测序发现，突变主要集中在swrA和comP两个基因。更重要的是，利福平波动实验显示，P9_B1 spsM::kan菌株的突变率显著高于野生型。然而，标记缺失的ΔspsM敲除株的突变率与野生型无显著差异，SPβ溶原株的突变率也仅略高于（但不显著）野生型。这表明，突变率的升高并非由于spsM功能的普遍丧失，而是特异性地与spsM::kan抗生素抗性基因盒在原生基因座的插入有关。
7. Spontaneous point mutation in swrA provides a competitive advantage to strains with disrupted spsM in laboratory biofilm-promoting conditions
最后，研究人员通过荧光标记菌株的竞争实验探讨了swrA突变的选择优势。在促进生物被膜形成的LBGM培养基上，spsM::kan swrA::tet双突变株在与其亲本spsM::kan菌株竞争时表现出明显的适应性优势。携带自发swrA点突变的“蓬松”菌株也显示出轻微的优势。然而，在普通LB培养基上未观察到这种优势。这表明，在实验室常用的、利于生物被膜形成的条件下，swrA功能的失活能够赋予细菌一定的生长优势，这或许解释了为何该突变在spsM::kan背景中会被反复筛选出来。
结论与讨论
本研究系统阐明了枯草芽孢杆菌spsM基因座的不同破坏模式对其多细胞性状多样化的差异化影响。主要结论如下：首先，早期研究中将NDmed菌株的生物被膜缺陷归因于spsM破坏，而本工作通过全基因组测序证实，该表型实际上是由一个未被检测到的自发comP突变引起。spsM功能本身的丧失（无论是通过标记缺失敲除还是噬菌体整合）并未对生物被膜形态或运动性产生可检测的普遍影响。其次，也是更重要的发现是，spsM::kan（即用卡那霉素抗性基因盒插入破坏spsM）会特异性地导致细菌全基因组突变率显著升高。这种升高的突变供给，结合固体培养基上菌落边缘的强选择压力，共同驱动了调控基因（如swrA和comP）中具有大表型效应的突变被反复产生和选择。这些突变通常导致运动性丧失和生物被膜结构简化，这与实验室条件下细菌“驯化”的常见路径一致。最后，SPβ噬菌体整合虽然同样破坏spsM，但并未引起可检测的突变率升高，表明噬菌体整合与抗生素盒插入在遗传和表型后果上存在本质区别。
这项研究的意义重大。在实践层面，它强调了在菌株构建和表型分析过程中进行常规基因组验证（如下一代测序）的必要性，以排除未被察觉的二次突变干扰。在理论层面，它深化了我们对原噬菌体-宿主互作复杂性的理解，表明局部基因组环境（如特定基因座的破坏方式）和实验操作本身都能显著影响细菌适应性变异的出现。该工作发表于《Microbiology Spectrum》，为理解微生物适应性、遗传操作的安全考量以及原噬菌体在细菌进化中的角色提供了新的、更细致的视角。
