《PLOS Genetics》：Whole-genome sequencing reveals a possible molecular basis of sex determination in the dioecious wild yam Dioscorea tokoro
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本研究针对野生薯蓣Dioscorea tokoro性别决定机制不明的问题，通过构建染色体级别单倍型组装基因组、连锁分析和转录组测序，发现其遵循雄性异配（XY/XX）系统，性别决定区位于3号染色体的着丝粒周边区域，并筛选出Y染色体特异的BLH9和HSP90基因作为候选性别决定基因。该研究为理解植物性别决定的复杂进化提供了新线索。
在大自然中，绝大多数开花植物是雌雄同株的，但也有约5%的物种是雌雄异株的，即雌花和雄花分别长在不同的植株上。这种被称为“雌雄异株”（dioecy）的繁育系统，被认为是从雌雄同株的祖先中独立演化而来的，其背后的遗传控制机制多样而复杂。理解植物性别决定机制，特别是那些具有重要经济和生态价值的物种，对于揭示生命多样性的进化规律至关重要。然而，与动物相比，我们对植物性别决定分子机制的认识仍相对有限，尤其在单子叶植物中研究案例较少。薯蓣属（Dioscorea）是单子叶植物中最大的属之一，包含许多重要的块茎作物（如山药），并且其大部分物种是雌雄异株的。有趣的是，薯蓣属内不同物种似乎采用了不同的性别决定系统，包括雄性异配（XY/XX）、雌性异配（ZZ/ZW）甚至多倍体性染色体系统，暗示着该属内性别决定系统可能经历了频繁的演化转换。为了探究这些演化之谜，解析具体物种的性别决定分子基础是第一步。本研究聚焦于一种广泛分布于东亚温带地区的野生薯蓣——Dioscorea tokoro，旨在通过前沿的基因组学技术，揭开其性别决定的神秘面纱。
该研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）和Illumina测序平台，对分别来自日本和歌山（雌株，Waka1）和岩手（雄株，Kita1）的个体进行了全基因组测序，构建了染色体级别、单倍型解析的参考基因组。其次，通过“伪测交”（pseudo-testcross）策略，利用限制性位点关联DNA测序（RAD-seq）对雌雄亲本杂交产生的186个F1子代群体进行了基因分型，并构建了遗传连锁图谱。此外，研究还结合了转录组测序和小RNA测序，分析了雌雄花不同发育阶段以及非生殖器官的基因表达谱，以筛选候选基因。覆盖度分析、关联分析以及专门检测性别决定区（SDR）的SDpop和RADSex软件也被用于精确鉴定性染色体特异的基因组区域。
研究结果
1. 利用基因组组装和连锁分析重建D. tokoro的基因组序列
研究人员成功构建了雌雄个体的单倍型解析基因组，雌株单倍型1基因组包含212个重叠群，雄株单倍型1基因组包含172个重叠群，并通过连锁分析将其锚定到10条染色体上。BUSCO评估显示其完整性较高。通过转录组和同源性预测，共注释了超过2万个基因。染色体共线性分析表明，四个参考基因组之间具有高度保守性，为后续分析提供了可靠的基因组基础。
2. 连锁研究和Illumina短读段覆盖度分析鉴定出3号染色体上的X和Y特异基因组区域
通过对F1子代进行关联分析，发现性别表型与雄性亲本杂合的分子标记显著关联，且关联信号集中在3号染色体中部，而雌性亲本杂合的标记则无关联，这支持D. tokoro具有雄性异配（XY/XX）性别决定系统。覆盖度分析进一步揭示，在雌性参考基因组的3号染色体（定义为X染色体）中部，存在一段区域雄性测序深度约为雌性的一半；而在雄性参考基因组的3号染色体（定义为Y染色体）对应区域，雌性深度几乎为零。这些区域被确定为X特异（约4.8 Mb，含54个候选基因）和Y特异（约4.5 Mb，含56个候选基因）区域，其中包含22对XY同源基因对（gametologs）。
3. X和Y特异区域可能位于着丝粒周边区域
序列比对点图显示X和Y染色体之间没有大的倒位。X和Y特异区域位于基因密度低、重复序列（特别是Ty3长末端重复序列）密度高的基因组区域，这与着丝粒周边区域的特征相符。连锁距离与物理距离的关系分析未发现该区域重组率有特别剧烈的降低，表明其非重组区域（NRY）可能仅限于着丝粒附近的小范围。同义位点分歧度（dS）分析显示，XY同源基因对的dS中位数（0.019）远低于D. tokoro与同属其他物种（D. rotundata, D. alata）间的分歧度，且未检测到明显的演化层级（evolutionary strata），提示D. tokoro当前的性别决定系统可能相对年轻。种间比较发现，D. tokoro的性染色体与同样具有XY/XX系统的D. alata的性染色体（6号染色体）存在共线性，但与具有ZZ/ZW系统的D. rotundata的性染色体（11号染色体）无共线性，支持了薯蓣属内性别决定系统存在转换的假说。
4. Y特异基因BLH9和HSP90在雄花早期发育阶段特异性高表达
对位于Y特异区域的56个蛋白编码基因和1个初级miRNA进行表达分析，筛选出在雄花发育早期（花序阶段S0, S1, S2）相对于雌花和非生殖器官显著高表达的基因。其中，BLH9（与拟南芥AtBLH9同源，编码同源异型盒蛋白）和HSP90（与拟南芥HSP90.4同源，编码分子伴侣）被确定为最主要的候选性别决定基因。PCR验证证实这两个基因是Y染色体特异的。BLH9可能通过抑制心皮发育相关基因（如AGAMOUS）来抑制雌性发育，而HSP90可能通过与BES1/BZR1等蛋白互作，在花粉发育中起重要作用。
5. BLH9与AtBLH9功能相似，在拟南芥中可抑制果实发育
由于薯蓣遗传转化困难，研究通过在拟南芥中过表达BLH9和AtBLH9来探究其功能。系统发育分析显示D. tokoro BLH9与拟南芥AtBLH9亲缘关系最近。表型分析发现，过表达BLH9的拟南芥植株果实长度显著短于对照，而过表达AtBLH9的植株则表现出花序高度降低、果实变短以及节间长度不规则等表型。这表明D. tokoro的BLH9与AtBLH9共享部分功能，可能在抑制雌性器官（如果实）发育中发挥作用。
研究结论与讨论
本研究通过构建高质量基因组、遗传连锁和转录组分析，首次在野生薯蓣D. tokoro中系统揭示了其性别决定的分子基础。研究确认该物种具有雄性异配（XY/XX）系统，其性别决定区（SDR）位于3号染色体的着丝粒周边区域，这可能是由于该区域固有的重组抑制促进了性染色体的初始分化。更重要的是，研究鉴定出两个Y染色体特异的候选基因——BLH9和HSP90，它们在雄花发育早期特异性高表达，分别可能参与抑制雌性发育和促进雄性发育，符合性别决定演化的“双因子模型”。
这项研究的意义重大。首先，它增进了我们对植物性别决定机制多样性，特别是在单子叶植物中机制的理解。其次，D. tokoro相对“年轻”的性染色体（基于较低的dS值）与薯蓣属内多种性别决定系统并存的现象，为研究性染色体和性别决定系统的快速演化与转换提供了绝佳模型。研究提出的BLH9和HSP90作为候选基因，为未来在薯蓣属乃至其他植物中验证性别决定基因功能提供了新线索。最后，对性染色体结构、演化历史及候选基因的解析，不仅有助于理解植物性别决定的进化，也可能为相关作物的遗传育种（如控制性别以提高产量或品质）提供理论依据。这项研究成果已发表在《PLOS Genetics》期刊上。
