用于检测糖尿病伤口中过氧亚硝酸盐的可激活探针的合理设计

《Dyes and Pigments》：Rational design of an activatable probe for sensing peroxynitrite in diabetic wound

糖尿病并发症的近红外荧光探针HD-ONOO通过ONOO?特异性降解实现高灵敏度检测，成功应用于小鼠血清和伤口床ONOO?动态监测及二甲双胍疗效评估。

　　

Jia Cheng|Yu Wang|Zhi-Gang Jia|Zhi-Wei Shi|Jun-Feng Duan|Kai Wang|Jiong Yan|Yang Yang

教育部伤口修复技术工程研究中心，江南大学，江南大学附属医院，无锡，214000，中国

摘要

为了解决由过氧亚硝酸盐（ONOO^?）过量产生导致的糖尿病伤口愈合障碍，我们开发了一种基于半花青素骨架的近红外（NIR）激活荧光探针HD-ONOO。该探针利用ONOO^?触发的硼酸蒎醇酯基团的降解来引发分子内电荷转移（ICT）过程，从而在750纳米处产生强烈的荧光“开启”响应。HD-ONOO表现出优异的选择性和高灵敏度，其检测限（LOD）为0.02微摩尔。除了监测RAW264.7细胞中的内源性ONOO^?波动外，该探针还能实现对糖尿病小鼠血清和皮肤伤口中ONOO^?浓度的高对比度可视化及时空定量分析。此外，该探针还成功追踪了二甲双胍（MET）给药后ONOO^?水平的下降，凸显了其在评估治疗效果方面的实用性。总体而言，这项研究确立了HD-ONOO作为糖尿病相关炎症并发症早期诊断、精准监测和治疗评估的多功能分子成像工具的地位。

引言

糖尿病（DM）是一种多因素引起的慢性代谢疾病，其特征是持续的高血糖，这会引发多种系统并发症，影响多个器官系统和稳态途径[[1], [2], [3], [4], [5]]。糖尿病还伴随着其他严重后果，如伤口愈合能力下降，这显著增加了糖尿病患者的发病率和死亡率[6,7]。这种修复缺陷通常由持续的炎症信号和异常的免疫调节维持，进而加剧了糖尿病的病理状况[8]。值得注意的是，糖尿病足溃疡的特点是愈合时间延长、易受微生物定植和感染的影响，以及需要截肢的可能性增加，这使其成为糖尿病管理中的一个主要问题[7]。鉴于这些后遗症的长期性，迫切需要开发更有效的诊断和治疗方法来应对糖尿病的广泛系统影响[[9], [10], [11], [12]]。关注组织损伤和修复缺陷的根本原因，对于改善患者预后和减少严重后果（如截肢）的发生具有重大意义。

过氧亚硝酸盐（ONOO^?）在糖尿病及其并发症的发展和进展中起着核心作用，它通过硝化关键信号分子并诱导氧化应激和炎症反应[[13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]]。针对ONOO^?的检测和干预策略（如开发特定的清除剂或调节NO/ONOO^?平衡）为糖尿病治疗提供了新的方向[[21], [22], [23], [24]]。尽管ONOO^?在这些疾病途径中起着关键作用，但在活体生物体内监测其浓度仍面临重大技术挑战。现有的传统检测技术往往受到选择性不佳和灵敏度不足等问题的限制，尤其是在糖尿病患者复杂的生理环境中。这些限制阻碍了准确评估ONOO^?浓度的潜力，从而阻碍了糖尿病精准诊断和治疗干预的发展[[25], [26], [27]]。因此，迫切需要开发新的、更灵敏的方法来体内量化ONOO^?浓度。分子成像领域的进展，特别是使用高选择性和高灵敏度的探针，为追踪生物标志物动态提供了可行的途径，从而为疾病机制和治疗反应提供了宝贵的信息[[28], [29], [30], [31], [32]]。虽然已经使用ONOO^?响应探针研究了多种炎症性疾病（如动脉粥样硬化、细胞炎症模型和癌症），但专门针对糖尿病伤口中ONOO^?浓度时空波动的研究仍然有限[[33], [34], [35], [36]]。

在过去十年中，用于检测ONOO^?的荧光探针的发展取得了显著进展，从传统的可见光荧光团转向了先进的近红外（NIR）和比率传感平台[[37], [38], [39], [40], [41], [42]]。尽管早期的探针为ONOO^?生物学提供了基础性见解，但它们通常受到组织穿透深度有限、易受背景自荧光干扰以及与其他活性氧（ROS）交叉反应的影响。最近的研究越来越多地关注NIR发射骨架（如半花青素和二氰亚甲基-4H-吡喃），以促进成像并减少光损伤。尽管取得了这些技术进步，但仍然缺乏专门针对糖尿病伤口复杂的高氧化应激微环境的分子工具。大多数现有探针缺乏在糖尿病愈合的长期炎症阶段捕捉短暂ONOO^?波动所需的超高灵敏度和强光稳定性。

与之前报道的ONOO^?荧光探针[S1–S19]相比，我们设计并表征了一种中性粒细胞ONOO^?特异性荧光探针HD-ONOO，以克服上述限制（表S3）。HD-ONOO最初是通过有机化学方法合成的。HD-ONOO的NIR发射特性可以最小化背景自荧光，减少光子散射，并实现NIR发射（高达750纳米），这对于非侵入性和高分辨率的ONOO^?波动成像至关重要。全面的体外实验进一步验证了HD-ONOO对ONOO^?的高选择性、强大的生理稳定性和良好的生物相容性，支持其在体内成像中的应用。使用HD-ONOO作为成像剂，我们有效地可视化和量化了糖尿病小鼠模型中糖尿病伤口和血清中的动态ONOO^?浓度。这项工作建立了一个多功能且生物相容的传感平台，用于多情境下检测ONOO^?浓度，提供了关于糖尿病并发症中ONOO^?驱动病理的新机制见解，并为先进的诊断和治疗开发奠定了基础（图1）。

材料

本研究中使用的所有化学品、氨基酸和试剂均来自Sigma-Aldrich（美国）和Aladdin Reagents（中国）。吲哚（目录号1018212）购自Leyan（上海，中国）。DAPI溶液（5ug/ml）（C0066，北京Solarbio科技有限公司）。细胞培养皿/平板、圆形盖玻片、20毫米玻璃底培养皿和离心管均来自NEST Biotechnology有限公司（无锡，中国）。核磁共振（NMR）光谱（¹H和¹³C）数据...

HD-ONOO的合成、表征和响应性测试

本研究报道了基于半花青素骨架的激活探针HD-ONOO，用于精确检测ONOO^?。其成功合成通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS分析得到证实（图S1，图S2-S6）。该探针通过ONOO^?特异性反应机制发挥作用，触发荧光响应：HD-ONOO中的硼酸蒎醇酯基团发生降解，释放出荧光报告基团HD（图S7）。

结论

本研究成功开发并验证了基于半花青素骨架的NIR荧光探针HD-ONOO，它通过硼酸蒎醇酯基团的特异性降解实现ONOO^?的检测。凭借其在750纳米处的发射和0.02微摩尔的优异检测限，该探针在成像糖尿病小鼠伤口和血清方面表现出优异的组织穿透性和灵敏度，同时有效量化了二甲双胍（MET）的治疗效果。

CRediT作者贡献声明

Jia Cheng：资金获取、数据分析、概念化。Yu Wang：写作 – 审稿与编辑、可视化、研究、数据分析。Zhi-Gang Jia：写作 – 审稿与编辑、可视化、资金获取、数据分析。Zhi-Wei Shi：写作 – 初稿撰写、可视化、监督、资金获取、数据分析。Jun-Feng Duan：写作 – 审稿与编辑、可视化、研究、数据分析。Kai Wang：写作 – 初稿撰写...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号82402924）的支持。作者感谢Scientific Compass公司的Xin Ma女士（网址：www.shiyanjia.com）在共聚焦分析方面提供的宝贵帮助。