Ceratophyllum demersum乙醇提取物通过Nrf2-Keap1和NF-κB信号通路参与减轻Aeromonas sobria对Botia rostrata的致病性

《Fish & Shellfish Immunology》：Involvement of Nrf2-Keap1 and NF-κB signaling pathways in alleviation of Aeromonas sobria pathogenicity in Botia rostrata by Ceratophyllum demersum ethanol extract

本研究探究 Ceratophyllum demersum 乙醇提取物（CE）通过调节 Keap1-Nrf2 抗氧化通路和 NF-κB 炎症通路，降低 Botia rostrata 鱼感染 Aeromonas sobria 后的死亡率及氧化应激，增强免疫应答的分子机制。

　　

印度钻石港法基尔昌德学院动物学系

摘要

本研究旨在探讨Ceratophyllum demersum乙醇提取物（CE）作为抗菌剂对抗Aeromonas sobria感染在Botia rostrata中的作用机制。健康的幼年B. rostrata雄鱼（体重：2.7±0.5克；体长：4.9±0.8厘米）被腹腔注射单剂量的96小时半数致死浓度（LD₅₀）的A. sobria悬浮液（体积：25微升），并连续30天喂食添加了C. demersum乙醇提取物的饲料（添加比例为0.4克/千克饲料）。与喂食基础饲料的鱼相比，喂食含CE饲料的鱼表现出显著较低的死亡率（P<0.05）、血清皮质醇水平（η²=0.983）、细胞因子水平[IL-1β（η²=0.872）、IL-2（η²=0.769）、IL-6（η²=0.796）、IL-10（η²=0.798）、TNF-α（η²=0.823）、IFN-γ（η²=0.726）以及鳃和肝脏中的活性氧（ROS）水平，同时核Nrf2和NF-κB蛋白表达也有所改善。此外，喂食含CE饲料的鱼还表现出显著更高的呼吸爆发活性（η²=0.983）、血清溶菌酶水平（η²=0.997）和吞噬活性（η²=0.753），以及细胞质Keap1和IκB蛋白表达水平。此外，A. sobria感染引起的鳃和肝脏组织结构变化也得到了植物提取物饲料处理的缓解。植物提取物中的主要生物活性化合物可能通过清除ROS、减轻氧化应激、恢复内源性抗氧化系统并降低促炎细胞因子水平来发挥其作用。因此，本研究结果阐明了C. demersum及其所含植物化学物质如何与宿主的关键信号通路（特别是Keap1–Nrf2抗氧化通路和NF-κB炎症通路）相互作用，从而恢复氧化还原平衡、调节细胞因子反应，进而增强鱼类的病原体抵抗力。

引言

在不同的集约化鱼类生产方法中，鱼类感染病原体是一个主要问题，这些问题可能表现为免疫抑制、死亡率增加、氧化应激和生理紊乱[1]。在感染应激反应期间，尤其是由机会性细菌引起的感染时，下丘脑-垂体-肾（HPI）轴通常会被激活。这会导致皮质醇分泌增加，从而抑制免疫反应并促进鱼类的氧化损伤[2]、[3]。细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、IL-6和IL-12在免疫反应中起中介作用[4]。这些细胞因子的激活依赖于皮质醇与其在免疫细胞上的受体结合[2]。这种相互作用加强了免疫系统和内分泌系统之间的双向信号传递。

类似kelch的ECH相关蛋白1（Keap1）-核因子红细胞2相关因子2（Keap1-Nrf2）通路调节参与氧化还原反应、应激反应和解毒的多个下游基因。它对提高鱼类的疾病抵抗力也至关重要[5]。核因子κB（NF-κB）存在于细胞质中，与κB抑制剂（IκB）结合，是一种重要的转录因子，调节参与免疫反应、细胞凋亡和细胞生长的基因。此外，细菌感染会诱导NF-κB的激活，进而调节产生细胞因子和白细胞的基因[6]。

Aeromonas sobria是一种革兰氏阴性细菌，已知在压力或不良养殖条件下会导致鱼类溃疡、出血和死亡[7]、[8]。在我们之前的研究中，感染A. sobria的Botia rostrata表现出显著的死亡率增加、ROS水平升高和先天免疫力下降，证实了其致病性和宿主的脆弱性[9]。B. rostrata（Günther, 1868）是一种具有高经济价值的山溪鱼类，因其作为观赏鱼和食用鱼的全球需求而受到关注，但其种群数量容易下降。作为一种冷水/溪流物种，它容易受到感染和压力相关疾病的侵袭，在不良养殖条件下情况会更加严重[10]。

植物来源的产品和植物化学物质已成为水产养殖中传统抗菌剂和合成免疫刺激剂的可持续替代品。它们可以同时发挥抗菌、抗氧化和免疫调节作用，同时对环境和人类健康的风险较低[11]、[12]。富含生物活性化合物的药用植物可以调节免疫系统，保护鱼类免受致病因子和环境压力的影响，是抗生素的安全环保替代品[13]。来自药用植物的多酚化合物（包括槲皮素和芦丁）可以增强白细胞和吞噬活性，改善鱼类的生理状态，并显著提高其对抗A. hydrophila感染的存活率[14]、[15]。天然衍生物如绿原酸与益生菌一起使用时，可以通过提高溶菌酶和免疫球蛋白水平来增强免疫反应[16]。富含酚类的葡萄籽和 Cornelian 樱桃提取物通过促进抗体产生、黏液酶和免疫基因来增强体液和黏膜免疫力，从而对抗Aeromonas感染[17]、[18]。通过饲料或浸泡处理口服植物提取物可以增强先天防御能力（例如，提高吞噬和呼吸爆发活性、增加溶菌酶水平），并减轻病原体引起的应激和鱼类死亡率[19]。Ceratophyllum demersum是一种广泛分布的水生大型植物，长期以来一直用于水族贸易，并被认为具有抗氧化和抗菌特性。先前的研究在其提取物中检测到了酚类、黄酮类、其他植物化学物质和生物活性化合物，这些成分有助于抗菌和自由基清除[20]。我们之前的研究表明，C. demersum的乙醇提取物（CE）在体外对A. sobria的抗菌活性最强，优于甲醇和己烷提取物，并且通过饲料强化CE可以降低B. rostrata的死亡率、血清皮质醇和组织ROS水平，同时改善其先天免疫参数，无论是在预防还是治疗阶段[21]。

尽管已经证明了CE的急性毒性筛选、溶剂优化以及其在体内减轻A. sobria感染的效果，但C. demersum生物活性成分如何缓解A. sobria感染的分子和细胞机制尚未明确。具体来说，关于C. demersum及其所含植物化学物质如何与宿主的关键信号通路（特别是Keap1–Nrf2抗氧化通路和NF-κB炎症通路）相互作用，以恢复氧化还原平衡、调节细胞因子反应并提高病原体抵抗力的机制尚不清楚。

因此，本研究的主要目的是阐明C. demersum乙醇提取物在B. rostrata中对抗A. sobria感染的保护作用所涉及的功能机制。

实验部分

细菌菌株的获取

本研究遵循了《美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南》（US National Institute of Health Publication No. 85-23，1996年修订版）的规定，并获得了加尔各答大学动物伦理委员会的批准（注册号：885/GO/Re/S/05/CPCSEA），该委员会隶属于印度环境和森林部的“实验室动物控制和监督委员会”（CPCSEA）。

细菌菌株

死亡率和发病率

喂食基础饲料（GS4）的细菌感染鱼类的累积死亡率最高（56.66±0.22%）。而喂食添加了植物提取物的饲料（GS3）的细菌感染鱼类的累积死亡率显著较低（6.66±0.23%）。在这两组细菌感染的鱼类中，死亡率都在实验的前7天内出现。然而，未接受细菌注射的对照组鱼类（即未感染组）没有出现死亡现象

讨论

草药制剂及其衍生物被用于缓解所有生物体的疾病和压力状况[29]。草药的重要性在于其成本效益、可生物降解性和对目标生物体和水生环境的低损害性。植物化学物质是由初级植物代谢物合成的[30]。这些代谢物作为治疗或预防剂具有巨大潜力

结论

本研究发现Aeromonas sobria感染会导致Botia rostrata的氧化应激、免疫稳态紊乱以及鳃和肝脏组织结构的改变。喂食对照饲料（GS4）的鱼类试图通过最大限度地激活Nrf2-Keap1信号通路来对抗病原体引起的过度ROS生成，但由于内源性抗氧化剂池迅速耗尽，这些组的SOD、CAT和GSH水平降低。此外，这些组的鱼类还表现出

作者声明

Mainak Mukherjee：研究设计、方法论、数据管理、初稿撰写Anindita Dhara：研究设计、方法论、数据管理Subhadeep Ghosh：数据管理Suman Bhusan Chakraborty：概念提出、监督、资源提供、审稿和编辑。

利益冲突声明

无

致谢

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。作者衷心感谢加尔各答大学动物学系主任提供的必要基础设施支持，包括DST-FIST和RUSA 2.0项目的资助。