《Fish & Shellfish Immunology》：Long-term protective efficacy and distinct immune responses of live and inactivated vaccines against cryptocaryoniasis in orange-spotted grouper (Epinephelus coioides)
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弧菌虫病活疫苗与灭活疫苗免疫机制研究显示，活疫苗在橙斑鲈鱼中诱导出更持久的保护（≥20周）和快速寄生虫清除（24-48小时），伴随黏膜IgM升高及协调的先天性免疫响应，而灭活疫苗仅短暂激活炎症信号且适应性免疫较弱。转录组分析揭示两者免疫路径差异。
张海|吴慧成|车顺丽|洪宇豪|李彦伟|丹雪明|莫泽全
广东省、香港和澳门地区海洋生物资源保护与开发联合实验室，华南农业大学海洋科学学院岭南现代农业实验室，中国广州
摘要
隐孢子虫病仍然是海洋水产养殖中的一个主要限制因素，而疫苗接种是控制该病的一种有前景的策略。然而，活疫苗和灭活疫苗对隐孢子虫（Cryptocaryon irritans）的不同保护效果的免疫机制尚未得到充分阐明。在这项研究中，我们比较了活疫苗和灭活疫苗在Epinephelus coioides中诱导的长期保护作用和宿主免疫反应。活疫苗至少提供了20周的持续保护，而灭活疫苗仅在12周时显示出可测量的效果。虽然在感染后24小时内各组之间的寄生虫负荷相似，但只有接种活疫苗的鱼在24-48小时内表现出寄生虫数量的快速减少，这与黏膜IgM水平的升高相吻合。转录组分析进一步表明，活疫苗与一种协调的免疫反应相关，其特征是早期黏膜抗体激活和持续的先天效应反应，而灭活疫苗主要诱导短暂的炎症信号传导，适应性免疫反应有限。总体而言，这些发现阐明了活疫苗和灭活疫苗引发的不同的免疫机制，为有效疫苗的设计提供了理论框架。
引言
Cryptocaryon irritans是一种广泛存在的纤毛虫寄生虫，感染海洋硬骨鱼类，并是隐孢子虫病的致病因子，这对海洋水产养殖构成了重大限制。受感染的鱼类会出现严重的上皮损伤和行为异常，导致高死亡率及巨大的经济损失[1]、[2]、[3]。Epinephelus coioides是一种具有经济价值的海洋养殖物种，在海笼中广泛养殖，特别容易感染隐孢子虫病，反复爆发继续造成严重的生产损失[4]、[5]、[6]。早期研究表明，C. irritans感染可以诱导获得性免疫，为疫苗开发奠定了基础[7]。因此，疫苗接种已成为控制隐孢子虫病的一种有前景的策略[8]、[9]、[10]。然而，尽管取得了一些进展，疫苗诱导的保护作用的免疫机制仍不清楚，这限制了有效疫苗的优化和应用。
针对C. irritans的活疫苗通常是通过将鱼类暴露于非致命剂量的滋养体（theronts）来制备的，因为传统的减毒或选择低毒力菌株是不可行的[2]、[11]。这些疫苗能够模拟自然感染，通常能诱导强烈而广泛的免疫反应[12]、[13]、[14]。在E. coioides中，活疫苗可在血清和黏液中诱导高水平的特异性IgM，并实现高达95%的寄生虫减少率[15]、[16]。相比之下，灭活疫苗通过物理或化学方法制备，具有安全性、稳定性和生产简便性的优势，但通常需要佐剂来增强免疫原性[4]、[13]、[17]、[18]、[19]。在E. coioides中腹腔注射活疫苗可以触发血清IgM的产生、补体激活以及免疫相关基因的上调[9]、[11]、[20]、[21]、[22]。然而，其保护效果通常低于活疫苗，报道的寄生虫减少率约为60%[23]、[24]。总体而言，这些观察结果表明，活疫苗和灭活疫苗可能对C. irritans诱导不同的免疫机制[25]，但疫苗介导的保护作用背后的机制，特别是特异性IgM反应的抗寄生虫作用，仍不够明确，这限制了隐孢子虫病疫苗的优化和评估。
为了进一步了解这些差异，本研究系统地比较了活疫苗和灭活疫苗在E. coioides中的保护效果和免疫机制。我们评估了保护持续时间，检查了组织病理学变化，并评估了疫苗对滋养体发育的影响。分析了感染后72小时内鳃组织中的寄生虫负荷动态以及血清和黏液中的特异性IgM水平，以阐明抗寄生虫免疫反应。此外，还进行了转录组测序，以识别与疫苗诱导的免疫相关的差异表达基因。总体而言，这项工作提供了关于活疫苗和灭活疫苗如何保护石斑鱼免受隐孢子虫病侵害的机制见解，并为开发更有效的抗寄生虫疫苗提供了理论基础。
部分摘录
鱼类饲养和隐孢子虫繁殖
用于C. irritans繁殖的健康Trachinotus ovatus（563 ± 8.39克）和用于疫苗接种及感染试验的Epinephelus coioides（28 ± 4.24克）来自中国广东的一家商业养殖场。鱼类在28 ± 1°C的流水系统中饲养（200升），并在实验前适应两周。适应期间，鱼类每天喂食两次商业颗粒饲料，并每三天转移至消毒过的池塘中，以防止自然感染C. irritans。
免疫剂量和疫苗安全性评估
为了确定活疫苗的适当免疫剂量，进行了初步的感染实验。如图1所示，每条鱼感染20,000或15,000个滋养体的鱼在感染后10天内全部死亡，而每条鱼感染10,000或5,000个滋养体的鱼在整个观察期间存活。基于这些数据，选择每条鱼10,000个滋养体作为活疫苗的免疫剂量，以确保足够的免疫反应
讨论
感染C. irritans的鱼类可以发展出对再感染的保护性免疫，这支持了疫苗接种作为控制隐孢子虫病关键策略的潜力[23]、[32]。尽管活疫苗和灭活疫苗都显示出不同程度的保护效果，但其背后的免疫机制仍不够明确，阻碍了疫苗配方和接种策略的优化[2]。为了澄清这些差异，我们采用了综合方法
结论
本研究表明，针对C. irritans的活疫苗和灭活疫苗在Epinephelus coioides中引发了不同的免疫机制。活疫苗在初次免疫后至少提供了20周的持续保护，并在感染后24-48小时内实现了快速的寄生虫清除，这与早期黏膜IgM反应和先天效应途径的协调激活有关。即使在之后，通过持续的先天免疫刺激，也保持了长期保护
CRediT作者贡献声明
张海：撰写原始草稿，进行研究。吴慧成：进行研究，制定方法。车顺丽：进行研究。洪宇豪：数据管理。李彦伟：概念构思，项目管理，监督。丹雪明：概念构思，项目管理，监督，撰写-审稿与编辑。莫泽全：概念构思，进行研究，制定方法，资源管理，撰写-审稿与编辑。
数据可用性
本研究中生成和分析的原始RNA-seq数据集已存入NCBI SRA数据库，BioProject访问号为PRJNA1422430。致谢
本研究得到了国家自然科学基金（42576089）、广东省基础与应用基础研究基金（2026A1515012211）以及广东省海洋经济发展专项基金（资助编号GDNRC [2024] 26）的支持。
