《Fish & Shellfish Immunology》：Post traumatic response of coelomocytes in the common sea star Echinaster sepositus
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本文针对海星等无脊椎动物创伤后修复过程中免疫与再生之间的关联机制尚不明确的问题，研究人员以普通海星Echinaster sepositus为模型，开展了体腔细胞（coelomocytes）在腕部截肢后的细胞与生化响应研究。研究发现，创伤后早期体腔细胞的溶菌酶样活性、活性氧（ROS）生成及同种异体移植炎症因子1（AIF-1）蛋白表达均显著上调。该研究揭示了体腔细胞在协调早期免疫防御与启动组织修复中的关键作用，为理解免疫系统在无脊椎动物再生过程中的演化与功能提供了新见解。
在生命科学的奇妙世界里，再生能力一直是一个令人着迷的课题。从能重新长出整条尾巴的蝾螈，到被切成两段后能各自长成完整个体的涡虫，自然界充满了强大的自我修复案例。然而，与这些“再生高手”相比，人类等高等脊椎动物的再生能力却相当有限。那么，动物王国中普遍存在的再生现象，其背后是否存在着某种共通的、古老的生物学机制？特别是，当身体受伤时，第一时间赶到“事故现场”的免疫系统，除了负责“消毒杀菌”，是否也在暗中指挥着后续的“重建工程”？这个问题，在脊椎动物中已有些许线索，但在与我们亲缘关系更远的无脊椎动物中，尤其是具有强大再生能力的棘皮动物（如海星、海参）中，却仍是一个待解之谜。普通海星Echinaster sepositus，作为一种能够再生失去腕部的海洋生物，为科学家探索免疫与再生之间的古老对话提供了一个绝佳模型。近期，一项针对E. sepositus的研究在《Fish & Shellfish Immunology》上发表，深入探究了其体内循环的免疫细胞——体腔细胞（coelomocytes）在应对创伤性截肢后的动态变化，为我们理解再生过程的初始步骤打开了新的窗口。
为了回答上述科学问题，研究团队开展了一系列实验。他们采集了成年E. sepositus个体，通过手术截除其腕部远端三分之一来模拟创伤。随后，在截肢后即刻（T0）、24小时（T24）、48小时（T48）和1周（1w）等多个时间点，采集海星体腔液中的体腔细胞进行分析。研究所采用的关键技术方法主要包括：通过细胞化学染色（吉姆萨染色、中性红染色、DOPA氧化酶染色、PAS染色）对体腔细胞进行形态学和细胞化学表征；通过溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）琼脂扩散法检测细胞裂解液中的溶菌酶样活性；使用荧光探针DCFH-DA在荧光显微镜下检测活性氧（ROS）的生成；通过实时定量PCR（qPCR）技术分析炎症相关基因aif-1的mRNA表达水平；并利用免疫细胞化学技术，使用抗人AIF-1抗体检测体腔细胞中AIF-1蛋白的表达与定位。此外，研究还通过生物信息学方法对E. sepositus的aif-1转录本进行了组装和系统发育分析。
研究结果
3.1. E. sepositus的体腔细胞
在健康动物中观察到的体腔细胞在数量和类型上存在个体差异，但所有个体均拥有变形细胞（amoebocytes）、白色球形细胞（white spherulocytes）和颤动细胞（vibratile cells）。部分个体还存在大量有色球形细胞（coloured spherulocytes）。大部分细胞（67.6 ± 14%）含有可被吉姆萨溶液染成异染性的颗粒，并呈PAS（过碘酸希夫）反应阳性，表明含有多糖。多数细胞（66.0 ± 14.2%）胞质内含有能被中性红染色的溶酶体。L-DOPA（3,4-二羟-L-苯丙氨酸）细胞化学检测显示，变形细胞和球形细胞均能产生深色色素，呈阳性反应。
3.2. 截肢后E. sepositus体腔细胞的形态和代谢变化
3.2.1. 粘附与溶菌酶样活性
截肢后即刻（T0）采集的体腔细胞在悬浮时呈圆形，但在提供合适支撑物时，大部分细胞表现出粘附特性，形态发生改变，形成长长的突起并附着在基质上。而在截肢后24小时（T24）采集的细胞，其粘附特性显著降低，许多细胞保持原始圆形，即使部分细胞显示出激活的丝状伪足形态，也未能附着。
细胞裂解液的溶菌酶样活性在损伤后第一天显著增加（p<0.01），裂解圈平均直径从T0的7.54 ± 0.3 mm（相当于0.79 mg mL-1的鸡蛋清溶菌酶）增加到T24的9.25 ± 0.5 mm。在随后几天，裂解圈直径下降，T48时为6.20 ± 0.70 mm，截肢后一周（1w）时为4.70 ± 0.01 mm。
3.2.2. 活性氧（ROS）
使用DCFH-DA染色并通过荧光显微镜计数阳性细胞来评估ROS的产生。细胞荧光优先位于核周/核区0.05。">。在截肢后最初24小时（T24）内，ROS的产生（44.5 ± 4.2%的阳性体腔细胞）与T0相比略有增加。随后，在接下来的时间点，阳性体腔细胞呈不显著（p>0.05）的下降趋势：T48时为35.5 ± 4.3%，1周时为20.1 ± 11.9%。
3.4. E. sepositus体腔细胞中aif-1相关mRNA表达分析
通过qRT-PCR对截肢后T0至1周体腔细胞中提取的RNA进行定量表达分析。在最初的48小时内，E. sepositus aif-1相关转录本水平未发现显著变化，尽管在T48时观察到相对于T0略有增加的趋势。相比之下，在1周后记录到mRNA水平显著、统计学意义上的降低（相对于0小时的100%，降至17%）-ΔCt平均值，并用18S RNA作为内参进行标准化，然后在图中表示为相对于T0平均值（100%）的百分比。** p<0.01。">。此外，通过RT-PCR获得了一个227 bp的扩增子，经测序证实为来自E. sepositus的推定aif-1相关mRNA的部分cDNA。
3.5. E. sepositus aif-1转录本组装
该部分mRNA序列与E. sepositus第19号染色体上的三个相邻区域对齐，表明查询序列中存在三个外显子。通过生物信息学分析，从E. sepositus转录组数据中从头组装了转录本，并从中鉴定出一个推定的aif-1转录本（转录本513）。该转录本全长为2174 nt，其编码区（由ORFfinder识别）跨越nt 281-736，编码一个151个氨基酸的蛋白质。该基因被命名为E. sepositus aif-1。
3.6. E. sepositus AIF-1的鉴定、系统发育和比较分析
通过多序列比对，将预测的E. sepositus AIF-1序列与大量来自棘皮动物的（直系同源）AIF-1型蛋白序列进行比较。结果显示，推定的E. sepositus AIF-1包含在海星AIF-1型蛋白簇中，与Echinaster spinulosus的AIF-1序列同源性最高（86.09%）。
3.7. E. sepositus体腔细胞中AIF-1蛋白的表达
体腔细胞对抗人AIF-1抗体免疫染色有反应，显示阳性颗粒。在T0时，阳性细胞百分比为15.0 ± 3.0%。在截肢后24小时（T24），表达AIF-1蛋白的阳性细胞数量增加至27.1 ± 2.0%，在48小时（T48）达到峰值70.0 ± 9.0%。随后几天，呈现AIF-1阳性颗粒的体腔细胞数量减少，在1周后（1w）显著下降至27.8 ± 16.2%。
研究结论与意义
本研究系统揭示了普通海星E. sepositus在腕部截肢后，其循环体腔细胞所经历的一系列复杂的细胞与生化响应。研究发现，创伤后早期，体腔细胞的多种免疫功能被迅速激活：其溶菌酶样活性在第一天显著增强，这有助于抵御可能从伤口入侵的病原菌；活性氧（ROS）的产生在损伤后24-48小时内维持在较高水平，这不仅参与抗菌防御，也可能作为信号分子参与再生过程的启动；同时，作为一种关键的炎症相关蛋白，同种异体移植炎症因子1（AIF-1）在体腔细胞中的表达在损伤后48小时达到峰值，表明体腔细胞处于高度的炎症/激活状态。有趣的是，aif-1的mRNA水平在早期变化不显著，而在1周后大幅下降，但蛋白质水平却在早期显著升高，这提示可能存在转录后或翻译水平的调控机制，使得AIF-1蛋白在转录本变化不大时依然能在激活的体腔细胞中积累。
这些发现共同描绘了一幅清晰的图景：在E. sepositus遭受创伤后，其体腔细胞作为先天性免疫系统的核心效应细胞，迅速从“巡逻”状态进入“战时”状态。它们首先通过增强抗菌物质（如溶菌酶）的产生和释放氧化自由基（ROS）来构建一道快速的化学防线，清除病原并创造不利于感染的微环境。同时，细胞内部炎症相关通路（如通过AIF-1表达体现）被激活，这可能不仅关乎免疫防御，也可能通过释放细胞因子等方式，与受损组织进行通信，为后续的组织清理、支架形成和细胞增殖等再生步骤铺平道路。随后，随着急性炎症期的消退和再生过程的推进，这些高强度的免疫活动（如ROS产生、AIF-1高表达）逐渐下调，以防止过度的炎症反应损害组织修复。
这项研究的重要意义在于，它首次在普通海星E. sepositus的创伤修复过程中，将体腔细胞的动态功能变化（溶菌酶活性、ROS、AIF-1）与时间进程联系起来，为理解无脊椎动物，特别是棘皮动物中，免疫系统与再生过程在早期阶段的紧密耦合提供了实证。它强有力地表明，在动物界，免疫细胞远不止是“保安”，它们很可能是组织再生这场“重建工程”的“先锋官”兼“协调员”。由于棘皮动物与脊椎动物在发育机制上具有深远的进化保守性，对此类“基础”模式生物中免疫-再生交互作用的研究，不仅能揭示生命自我修复能力的古老进化根源，也可能为人类再生医学带来启发，例如，如何恰当地调控损伤后的炎症反应以促进而非阻碍组织的完美再生。该研究发表于《Fish & Shellfish Immunology》，深化了对海洋无脊椎动物生物学和比较免疫学的认识。
