在大肠杆菌（Escherichia coli）中建立用于生产烟酸（nicotinic acid）和葫芦碱（trigonelline）的生物合成途径

《Metabolic Engineering》：Establishing biosynthetic pathways for the production of nicotinic acid and trigonelline in Escherichia coli

微生物细胞工厂通过人工生物合成途径实现烟酸（NA）和其衍生物 trigonelline（TG）的高效生产，NA产量达1.19 g/L，较原菌株提升200倍，并首次实现从葡萄糖直接合成TG（153.3 mg/L）。

　　

王彤|卢良宇|王小蕾|蔡光|王旭鑫|沈晓琳|孙欣晓|王佳|袁启鹏

北京化工大学化学资源工程国家重点实验室，北京，100029，中国

摘要

微生物细胞工厂为天然产物的生产提供了一个可持续的平台，但其发展往往受到效率低下或特性不明确的天然生物合成途径的限制。烟酸（NA）及其N-甲基衍生物葫芦巴碱（TG）是具有广泛应用的宝贵化合物，涵盖制药、营养保健品和化学工业领域。在这项研究中，我们提出了一种利用工程改造的大肠杆菌菌株从葡萄糖出发从头合成NA和TG的新策略。通过系统分析和重新设计生物合成途径，我们构建了一条人工合成NA的路径，显著降低了能量和辅因子的需求。我们优化了关键前体的供应，包括喹啉酸（QA）和5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），并消除了竞争性代谢途径，使得在3升发酵罐中的NA产量达到1.19克/升，比原始菌株提高了200倍。我们还通过筛选和引入NA N-甲基转移酶CTgS1扩展了该途径，实现了从葡萄糖从头合成TG，产量达到153.3毫克/升。这项工作展示了合理设计的异源生物合成途径在高效生产天然产物及其衍生物方面的潜力，为进一步的优化和大规模工业应用奠定了基础。

引言

烟酸（NA），也称为维生素B3，是一种必需的水溶性维生素，广泛存在于肝脏、谷物和坚果等天然来源中（Meyer-Ficca和Kirkland，2016）。在制药工业中，NA表现出多种生物活性，包括降脂作用、改善心血管功能、抗氧化作用、美白皮肤和抗炎作用（Tuteja等人，2018；D'Andrea等人，2019；Brown等人，2001；Nordin等人，2021；Ma等人，2016）。此外，NA还广泛应用于食品工业作为营养补充剂（Driscoll等人，2010），以及在化学工业中用于金属表面处理、腐蚀抑制和催化过程（Hasanin和Al Kiey，2020；Afradi等人，2018）。2023年全球烟酸市场的价值约为3.72亿美元，预计从2024年到2030年的年增长率为2.2%（grandviewresearch.com）。葫芦巴碱（TG）是NA的N-甲基衍生物，主要存在于咖啡和豆科植物中，如葫芦巴（Ashihara等人，2015）。与NA类似，TG也具有类似的调节脂质和保护心脏的作用，但在治疗糖尿病方面具有独特的药理特性（Ashihara等人，2015；Mohamadi等人，2018；Zhou等人，2012）。因此，TG在制药、食品和营养保健品行业引起了越来越多的关注，并显示出广泛的应用前景。

目前，NA及其衍生物TG主要通过化学合成或植物提取生产，这两种方法都存在显著的局限性。NA的化学合成通常涉及苛刻的反应条件，包括高温、高压以及使用强氧化剂如硝酸，还有锰等金属催化剂（Lisicki等人，2022）。而TG的合成则需要有毒的甲基化试剂，这增加了安全性和环境方面的问题（Pottabathini等人，2021）。虽然植物提取提供了一种天然来源，但其工业可行性受到目标化合物含量低（NA < 0.1毫克/克鲜重；TG < 10毫克/克鲜重）、提取效率低和培养周期长的限制（?atak，2019；Ashihara和Watanabe，2014）。相比之下，微生物细胞工厂已成为天然产物工业生产的高效和可持续平台。先前的研究探索了基于腈水解酶的生物催化过程，将3-氰基吡啶转化为NA（Liu等人，2023；Sripattanakul等人，2025）。然而，这些过程依赖于化学合成前体的持续供应，增加了生产成本并限制了这些方法的可持续性。因此，本研究旨在建立一条从头合成途径，使大肠杆菌能够直接从可再生原料葡萄糖中生产烟酸。这为NA及其衍生物葫芦巴碱的绿色生产提供了一种更可持续且潜在可扩展的策略。

在自然界中，已经发现了两条NA的内源性生物合成途径。在真核生物中，如S. cerevisiae，从葡萄糖合成NA的途径大约涉及30个酶促步骤，资源消耗量大，需要2分子NADPH、PRPP和ATP，以及各1分子的NAD⁺、赤藓糖-4-磷酸（E4P）、谷氨酰胺和丝氨酸（Perli等人，2020；Bogan等人，2009）。这条途径的特点是复杂性高、能量需求大和辅因子消耗量大。其中一条关键步骤由吲哚胺2,3-双加氧酶催化，其催化效率低下，严重限制了向NA生物合成的碳流（Yuasa和Ball，2013）。此外，在原核生物中，如E. coli，NA的生物合成途径涉及18个酶促反应，需要3分子ATP，以及各1分子的PRPP、二羟基丙酮磷酸（DHAP）和NAD⁺（Acevedo-Rocha等人，2019；Vrablik等人，2009）。尽管尝试利用这条途径生产NAD⁺，但该过程的催化效率有限，报道的产量约为10毫克/升（Yang等人，2021）。总体而言，这两种天然生物合成途径都面临着由于途径过长、酶效率低下以及高能量和辅因子需求而导致的重大挑战，阻碍了NA及其衍生物的有效微生物生产。

在这项研究中，我们在E. coli中工程化了一条新的微生物生物合成途径，用于从葡萄糖从头合成NA及其衍生物TG。这条途径的特点是酶促过程简化，显著降低了能量和辅因子的需求（图1a和表1）。这是通过鉴定和表征能够将E. coli的天然中间体喹啉酸（QA）转化为NA的核苷酶来实现的，从而实现了5.6毫克/升的从头NA产量。为了进一步提高NA产量，我们阻断了NA的降解途径并加强了前体的供应，包括PRPP和QA，使得在摇瓶培养中的产量增加到213毫克/升。在随后的3升生物反应器中进行的分批发酵中，NA产量进一步提高到1.19克/升。最后，我们将NA生物合成平台扩展到生产其N-甲基衍生物TG。通过筛选关键的途径酶N-甲基转移酶，我们成功实现了TG的从头生物合成，产量达到153.3毫克/升。这项工作建立了第一个用于NA生产的微生物细胞工厂，并提出了一种从可再生碳源从头合成NA及其高价值衍生物的新策略。

菌株和质粒

使用E. coli DH5α进行质粒构建，而E. coli BW25113(F’)作为目标化合物生产的宿主。质粒pET-Lac和pCS27被用作质粒构建的骨架载体（Lin等人，2013）。本研究中使用的质粒和菌株分别列在表2和表3中。

培养基

Luria-Bertani（LB）培养基，含有5克/升酵母提取物、10克/升色氨酸和10克/升NaCl，用于感受态细胞的制备、种子培养和质粒

NA生产的人工生物合成途径的设计与构建

为了实现高效的NA生物合成，我们在E. coli中设计了一条新的人工途径，从内源性的NAD⁺从头合成途径开始。在这个途径中，喹啉酸合成酶（NadA）和天冬氨酸氧化酶（NadB）将天冬氨酸转化为QA，这是NA的关键前体。随后，喹啉酸磷酸核糖转移酶（NadC）催化QA和PRPP转化为NAMN。然后，一种核苷酸酶催化NAMN的脱磷酸化，生成烟酸核苷（NAR），

结论

微生物细胞工厂为天然产物的生产提供了一种可持续的方法；然而，它们的发展往往受到效率低下或特性不明确的天然生物合成途径的限制。为了解决这一挑战，我们提出了一种结合系统分析与合理设计的策略，以构建优化的人工途径。以NA生物合成为例，我们比较了不同生物体内的生物合成途径，并设计了一条非天然途径

CRediT作者贡献声明

王彤：撰写——初稿，形式分析，数据管理，概念化。卢良宇：数据管理，概念化。王小蕾：数据管理。蔡光：数据管理。王旭鑫：数据管理。沈晓琳：撰写——审阅与编辑。孙欣晓：撰写——审阅与编辑。王佳：撰写——初稿，监督，形式分析，概念化。袁启鹏：撰写——审阅与编辑，监督。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFF1106400）、国家自然科学基金（22238001、22378016和22478023）以及北京Nova计划（20250484890）的支持。