《Metabolic Engineering》：Exploring shikimate pathway enzyme diversity for engineering of glycopeptide antibiotic biosynthesis
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本研究聚焦糖肽类抗生素（GPA）生物合成中前体供应受限的瓶颈问题。研究人员通过系统发育与生化表征，揭示了不同GPA生产菌株中关键莽草酸途径酶Dahpsec和Pdhsec的反馈调节机制存在显著差异。基于此，他们利用反馈感知的酶选择策略，在替考拉宁（teicoplanin）生产菌中实现了抗生素产量的显著提升。这项工作为理性代谢工程改造GPA生产提供了新策略，证明了反馈调控而非单纯的催化效率是维持前体持续供应的关键。
在对抗日益严峻的细菌耐药性战争中，糖肽类抗生素（Glycopeptide Antibiotics, GPAs）如万古霉素和替考拉宁，是抵御革兰氏阳性菌感染的“最后防线”。然而，这类复杂天然产物的工业化生产面临一个根本性挑战：其七肽核心骨架的合成高度依赖于一系列非蛋白原性芳香族氨基酸（如β-羟基酪氨酸、4-羟基苯基甘氨酸等），而这些前体物质的供应，最终受制于一个名为“莽草酸途径”的中心代谢通路。这个途径本身受到严格的反馈调节，以确保细胞不浪费资源。为了“突围”，许多GPA生产菌（如放线菌）在自身的抗生素合成基因簇内“安插”了关键莽草酸途径酶的“副本”，即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, Dahpsec）和预苯酸脱氢酶（prephenate dehydrogenase, Pdhsec）。但这些“副本”酶在不同菌株中功能各异，其多样性、进化关系及调控逻辑尚不清晰。理解这些酶的“脾性”，并从中挑选出最有利于前体“开源”的版本，对于通过理性代谢工程手段提升GPA产量至关重要。
为此，一个由Jens-Peter Rodler、Oleksandr Yushchuk、Athina Gavriilidou等人组成的研究团队开展了一项深入探索。他们的研究成果以“Exploring shikimate pathway enzyme diversity for engineering of glycopeptide antibiotic biosynthesis”为题，发表在《Metabolic Engineering》期刊上。研究团队从系统发育分析入手，描绘了不同GPA生产菌中Dahpsec和Pdhsec的进化图谱，然后精选出来自产阿伏帕星的Amycolatopsis coloradensis和产替考拉宁的Actinoplanes teichomyceticus的酶进行生化“解剖”，最后在活体菌株中验证了基于酶调控特性设计的工程化策略的有效性，成功提高了替考拉宁的产量。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：1) 系统发育分析：利用从已表征和未表征的GPA生物合成基因簇中获取的Dahpsec和Pdhsec序列，通过多序列比对和最大似然法构建进化树，分析酶的多样性及其与GPA类型、生产菌属的关联。2) 蛋白质异源表达与纯化：将目标Dahp和Pdh基因在大肠杆菌中表达，并纯化获得带有His标签或Strep标签的重组蛋白，用于后续的酶学表征。3) 酶动力学与抑制表征：通过光谱法测定纯化酶的米氏常数（KM）、最大反应速度（Vmax）等动力学参数，并评估芳香族氨基酸（酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp）对其活性的反馈抑制作用。4) 体内基因操作与表型分析：在A. coloradensis和Act. teichomyceticus中，利用接合转移技术构建了目标基因的过表达株和缺失突变株，并在生产培养基中培养，通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）或高效液相色谱（HPLC）定量分析阿伏帕星或替考拉宁的产量，以评估遗传改造对抗生素生产的影响。
研究结果
3.1. GPA生产放线菌中Dahpsec和Pdhsec的系统发育分析
通过对来自I-IV型GPA生物合成基因簇的Dahpsec和Pdhsec进行系统发育分析，研究人员发现这些酶的进化多样化程度很高，且与GPA类型或生产菌属没有明确的相关性。例如，来自A. coloradensis的DahpACOL_sec在进化树上与其他Amycolatopsis的Dahpsec分开，反而与Act. teichomyceticus的DahpATE_sec亲缘关系更近。同样，PdhATE_sec也形成了自己独立的分支。这提示酶的功能可能无法单纯从序列或进化位置预测，需要实验验证。
3.2. 在A. coloradensisDSM 4425中过表达DahpACOL_sec和PdhACOL_sec导致阿伏帕星产量显著下降**
与之前在A. balhimycina（巴利霉素生产者）中的发现相反，在A. coloradensis中过表达其自身的dahpACOL_sec或pdhACOL_sec基因，反而会降低阿伏帕星产量，同时过表达两者则导致产量骤降至野生型的5%。而删除dahpACOL_sec则使产量翻倍。这一矛盾现象暗示A. coloradensis的酶可能存在不同的反馈调节机制。
3.3. DahpACOL_sec受到强烈的反馈调节
随后的酶学表征证实了这一猜想。DahpACOL_sec虽然催化效率高于其初级代谢同工酶DahpACOL_prim，但它同时受到Tyr、Phe和Trp的强烈抑制。而DahpACOL_prim仅被Phe和Trp抑制，且Phe的抑制可被Tyr拮抗。因此，过表达DahpACOL_sec可能通过增加细胞内Tyr和Phe的浓度，反过来强烈抑制自身活性，从而限制了莽草酸途径通量，解释了其过表达导致产量下降的原因。
3.4. DahpATE_sec的Tyr依赖性抑制可被Phe拮抗
对Act. teichomyceticus的Dahp酶分析显示，DahpATE_sec主要受Tyr抑制，而Phe能够拮抗这种抑制。这与之前研究的DahpABAL_sec的调控模式相似，尽管它们在进化树上关系较远。这表明进化上的差异并不总是转化为生化特性的差异。
3.5. A. coloradensis的PdhACOL_prim和PdhACOL_sec受酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制
对A. coloradensis的Pdh酶分析表明，PdhACOL_sec受Tyr强烈抑制，而Phe对其有轻微激活作用，且能部分拮抗Tyr的抑制。这与缺乏反馈抑制的PdhABAL_sec形成鲜明对比。
3.6. PdhATE_sec受酪氨酸反馈抑制
Act. teichomyceticus的PdhATE_sec对其底物预苯酸的亲和力很低，且受Tyr和Phe的抑制。该酶拥有一个C端的ACT-like调节结构域，可能介导了这种反馈调节。
3.7. 过表达来自不同GPA生产菌的Dahp酶基因可提高Act. teichomyceticusNRRL B-16726的替考拉宁产量**
基于DahpATE_sec和DahpABAL_sec相似的调控特性（Tyr抑制，Phe拮抗），研究人员在Act. teichomyceticus中过表达了这两个基因。结果表明，过表达异源的dahpABAL_sec能使替考拉宁产量提高2倍以上，过表达额外的自身dahpATE_sec拷贝也能使产量提高1.5倍。
3.8. 调节性ACT-like结构域影响Pdh的活性和Act. teichomyceticus中的替考拉宁生产**
为了探究Pdh的影响，研究人员在Act. teichomyceticus中过表达了不同的pdh基因。过表达具有完整ACT结构域的全长pdhATE_sec，能使替考拉宁产量提高3倍以上；而过表达缺少该结构域的截短版本pdhATE_sectr，或过表达本身没有ACT结构域、无反馈抑制的pdhABAL_sec，则对产量没有显著影响。这说明PdhATE_sec的C端调节结构域对于其提升产量的正面效应是必需的，适当的反馈调节有助于在增加前体供应的同时，避免代谢流向不利方向分流。
3.9. 重新平衡苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成可增加糖肽类抗生素的产量
研究人员还尝试了另一种策略：过表达预苯酸脱水酶（prephenate dehydratase, Pdt）基因。细菌的Pdt通常受其产物Phe的反馈抑制。因此，过表达pdt预计会导致胞内Phe暂时升高，从而抑制Pdt自身，将更多前体预苯酸导向Tyr合成途径。实验证实，在培养基中添加Phe或过表达pdtABAL或pdtATE，均能显著提高替考拉宁产量。
研究结论与讨论
本研究系统地探索了不同GPA生产放线菌中莽草酸途径关键酶Dahpsec和Pdhsec的多样性。研究得出几个核心结论：首先，这些酶存在显著的进化分化和功能差异，且与GPA类型或菌属无直接关联，其功能无法仅从系统发育位置准确预测。其次，不同酶的同工酶之间反馈调节模式各异，这是决定其能否为GPA生物合成提供持续前体供应的关键因素，而不仅仅是催化效率的高低。例如，DahpACOL_sec的多重强烈反馈抑制使其过表达反而限制生产，而DahpATE_sec和DahpABAL_sec中Phe对Tyr抑制的拮抗作用则有利于维持通量。第三，PdhATE_sec的ACT-like调节结构域对其在过表达时提升产量起着必要作用，表明受调控的酶活性改变比完全解除调控更为有效。最后，通过理性选择具有有利反馈调节特性的酶（如DahpABAL_sec、DahpATE_sec、全长PdhATE_sec）进行过表达，或通过工程化手段重新平衡Tyr/Phe合成分支（如过表达Pdt），均可成功提高Act. teichomyceticus中替考拉宁的产量。
这项研究的重要意义在于，它超越了传统的、主要关注催化效率的代谢工程思路，强调并证明了“反馈感知”的酶选择策略的强大潜力。研究结果表明，深入理解并利用天然酶固有的、精细的变构调控机制，可以为理性设计更高效的细胞工厂提供关键依据。这不仅为提升重要抗生素（如替考拉宁）的工业发酵产量提供了具体、有效的工程策略，也为通过挖掘天然酶多样性来优化其他依赖特定前体的天然产物生物合成途径开辟了新道路。未来，继续探索GPA生物合成中关键酶的多样性，将有望进一步扩大可用于体内和体外生物催化工程的酶工具箱。
