评估材料对三维培养骨骼肌细胞的影响，以用于生物混合动力机器人

《Frontiers in Robotics and AI》：Evaluation of material effects on three-dimensional cultured skeletal muscle cells for biohybrid robots

　　摘要：传统上，机器人被限制在受控环境中，如工厂，其中人类与机器人的互动是有限的。然而，对于能够与人类协作的机器人的需求正在增加。为了实现共生，将生物体的物理灵活性和环境适应性整合到机器人系统中至关重要。这种机器人的一个例子是由三维（3D）培养的骨骼肌细胞驱动的生物混合机器人。这些肌肉细胞由肌母细胞和细胞外基质（ECM）组成，在外部刺激下会收缩并产生力量。这种3D培养的骨骼肌细胞的标准化对于实际应用是必不可少的。然而，它们的完全标准化尚未实现。通过3D打印技术生产的3D培养骨骼肌细胞的收缩力仍然不足以作为生物混合机器人的执行器使用。在先前的研究中，我们开发了一种简单的3D培养骨骼肌细胞的制造方法。这些生物培养的人工肌肉（BiCAM）细胞可以控制组织的形状和细胞排列。据报道，ECM的组成差异会影响3D骨骼肌组织的收缩力；然而，它们对响应特性的影响仍不清楚。在这项研究中，我们调查了ECM的组成如何影响生物混合机器人中3D骨骼肌细胞的收缩力，这是朝着其最终标准化迈出的一步。与在MF条件下培养的组织相比（之前已确认可以电诱导收缩），在CM条件下培养的组织在10伏和30伏的电压幅度下显示出大约两倍的收缩力。此外，在CM条件下的制造成功率为100％，而在其他ECM条件下仅为62.5％至70％。相比之下，尽管CM组织产生的力更大，但在MgF和CMg条件下培养的组织表现出更高的频率响应。这些发现表明BiCAM是一种可行的执行器，并为生物混合机器人的设计提供了新的可能性。

1. 引言
随着计算机、执行器和传感器的日益复杂化，机器人的性能得到了显著提高，特别是在工厂的流水线工作中发挥着重要作用。在已知的环境中，如工厂，传统的刚性机器人可以高速且高精度地运行，支持人类的工作。然而，当它们遇到未知的环境或情况时，它们无法表现出足够的性能。一般来说，生物体不能像机器人那样快速和精确地执行重复性任务；但是生物体具有高度适应性，并能够灵活地应对未知环境。这通常被称为适应性，人们已经尝试将生物体的适应性整合到机器人系统中。该领域最显著的趋势之一是开发由肌细胞驱动的软体机器人（生物混合机器人）（Webster-Wood等人，2017；Yuan等人，2023；Garmroudi等人，2025）。众所周知，作为生物体构建块的细胞会根据其生活环境改变其形态、谱系和其他特性（Engler等人，2006）。通过利用这种环境适应性并使用肌细胞，机器人可以更有效地适应环境。例如，3D培养的骨骼肌细胞是生物混合机器人的动力来源之一，具有低热量损失和高能量效率的优势（Kova?，2014）。已经提出了使用电刺激（Cvetkovic等人，2014）和光（Raman等人，2016）来外部控制3D培养的骨骼肌细胞的方法。此外，为了在更实际的环境中使用它们，已经开发了可以在空气中驱动的生物混合机器人（Morimoto等人，2020）、远程控制的生物混合机器人（Kim等人，2023）和生物混合手（Ren等人，2025）。已经开发了多种由3D培养的骨骼肌细胞驱动的生物混合机器人（Morimoto等人，2018；Kabumoto等人，2013；Guix等人，2021）。标准化3D培养的骨骼肌细胞对于实际应用是必不可少的；然而，至今尚未实现完全标准化（Raman等人，2017）。尽管使用3D打印技术可以生产出各种形状的3D培养骨骼肌细胞，但由于缺乏收缩力及其医疗开发用途，它们尚未在生物混合机器人中得到应用（Mestre等人，2019；Alave Reyes-Furrer等人，2021）。建立一种简单且可重复的方法来制造各种形状的3D培养骨骼肌细胞可能会提高执行器的多样性和性能。在之前的研究中，我们开发了一种易于制造的3D培养骨骼肌细胞方法，该方法具有很高的设计灵活性，包括使用3D生物打印机，并将所得到的3D培养骨骼肌细胞称为生物培养的人工肌肉（BiCAM）（Ohashi等人，2023）。这些3D培养的骨骼肌细胞是使用带有针的模具和培养皿制造的，这有助于形状和细胞排列。先前的研究表明，凝胶化过程决定了组织形态，凝胶边缘的固定有助于引导细胞排列以高效地产生力量，而没有针的组织则不会表现出这种排列（Ohashi等人，2023）。除了这些3D肌肉组织制造技术外，还需要考虑细胞外基质（ECM）的组成作为影响执行器性能的因素。3D培养的骨骼肌细胞通常是通过将肌母细胞与ECM混合并在三维空间中培养来制造的。由于ECM在维持组织结构和细胞间连接中起着重要作用，因此3D骨骼肌细胞的收缩力通常被认为会随着ECM组成的不同而变化（Chitcholtan等人，2013；Shima等人，2018；Soares等人，2012）。为了使3D骨骼肌细胞在生物混合机器人中有效作为执行器，它们必须产生足够的收缩力，同时能够适当地跟踪和响应周期性外部刺激。据报道，ECM组成的差异会影响3D培养骨骼肌组织的收缩力；然而，ECM组成如何影响其响应特性仍不清楚，定量评估仍然不足。在这里，我们研究了ECM的组成如何影响用作生物混合机器人执行器的3D培养骨骼肌细胞的收缩性能，这是朝着其最终标准化迈出的一步。如果这些关系能够被定量阐明，就有可能将具有适当定制响应特性的BiCAM嵌入生物混合机器人的不同区域。例如，在需要大驱动力的地方可以使用高力量生成结构，而在需要节奏性活动的地方可以使用优化的结构，从而显著提高机器人的整体运动性能。

2. 材料与方法
2.1 模具和培养皿的制备
模具和培养皿是根据先前的报告协议制造的（Ohashi等人，2023）。在本研究中，只准备了I形3D培养的骨骼肌结构（BiCAMs）。为了培养I形BiCAMs，培养皿被设计成针位于纵向轴的两端。首先，使用3D打印机（Guider2，Flashforge 3D Technology Co., Ltd.，中国浙江）从ABS树脂中制造了针插入的基础。然后将这个基础放入一个10厘米的培养皿中，并插入两个作为针的轴（直径：0.8毫米；长度：8-10毫米）。然后向培养皿中倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS），并在50°C下加热6小时进行固化。两个针之间的距离被设置为20毫米。此外，使用激光切割器（FABOOL Laser CO2，SmartDIYs，日本）从聚氧二甲塑料（POM）板材中切割出模具，并使用Autodesk Inventor（Autodesk Inc.，美国加利福尼亚州）创建了其设计。制造的模具的凹槽是一个长25毫米、宽3.5毫米的矩形，与我们之前研究中使用的I形BiCAM的模具尺寸相同（Ohashi等人，2023）。
2.2 肌母细胞
用于制造BiCAMs的主要培养的小鼠肌母细胞（MYB02）是从Cosmo Bio Co., Ltd.（东京，日本）购买的。
2.3 BiCAM的制造
本研究中制造的3D培养骨骼肌细胞的ECM组成总结在表1中。选择胶原蛋白、Matrigel和纤维蛋白原是因为它们已经用于生物混合机器人的3D培养骨骼肌细胞中（Cvetkovic等人，2014；Morimoto等人，2018）。下面描述了使用不同ECM组成制造BiCAMs的程序。基本协议基于先前报告的方法（Ohashi等人，2023）。需要注意的是，ECM被混合在一起，每个组分的最终浓度不可避免地会被稀释。表1列出了每种条件下的溶液组成（体积/体积，%）：
| ECM 条件 | 生长介质 | 胶原蛋白 | Matrigel | Fibrinogen | Thrombin |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| i) | C | 100 | ----- | ----- | --- |
| ii) | MgF | -60 | -20 | 41 | 6 |
| iii) | CMg | 45 | 45 | --- | 10 |
| iv) | CM | 45 | -45 | --- | 10 |

从-80°C的储存中取出含有冷冻保存的肌母细胞的管子并解冻。解冻后，加入培养介质并离心以去除上清液。然后将细胞沉淀（3.0×10^6细胞）重新悬浮在1,000微升使用胶原蛋白凝胶培养试剂盒（A. Cellmatrix Type I-A；B. 10×× MEM；C. Reconstitution Buffer；Nitta Gelatin Inc.，日本）准备的胶原蛋白溶液中，得到均匀的细胞-凝胶混合物。随后，将200微升的细胞-ECM混合物分配到装有针的培养皿中的模具中。在37°C和5%的二氧化碳浓度下孵育40分钟以促进凝胶化，之后取出模具。
生长介质由高葡萄糖DMEM组成，并添加了10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素-链霉素，并添加了ACA（A2504-25G，Sigma-Aldrich，密苏里州，美国），最终浓度为1%（体积/体积），相当于每毫升培养基150毫克ACA。总共添加了10毫升这种含有ACA的生长介质，并在37°C和5%的二氧化碳浓度下孵育。在第3-4天更换培养介质，在第6天更换为分化介质。分化介质由MYBDM（Cosmo Bio Co., Ltd.，日本）组成，并添加了胰岛素溶液（每毫升低葡萄糖DMEM（D6046-500ML，Sigma-Aldrich）中含1毫克的胰岛素和ACA，最终浓度为1%（体积/体积），相当于每毫升低葡萄糖DMEM 200毫克ACA。
ii) MgF
按照上述方法解冻冷冻保存的肌母细胞，加入介质后离心并丢弃上清液。提前准备了Matrigel（Corning 356231），这是一种通过将20毫克纤维蛋白原（Sigma-Aldrich F3879）溶解在1毫升低葡萄糖DMEM中制备的纤维蛋白原溶液，以及含有50单位凝血酶（Sigma-Aldrich T7009）的凝血酶溶液（1毫升0.1% BSA）。向细胞悬浮液（3.0×10^6细胞）中加入164微升的介质、180微升的Matrigel和40微升的凝血酶溶液，然后加入420微升的Matrigel和200微升的纤维蛋白原溶液。轻轻混合以获得均匀的细胞-ECM混合物。后续的培养和分化程序按照之前的方法进行。
iii) CMg
使用胶原蛋白凝胶培养试剂盒（A. Cellmatrix Type I-A；B. 10×× MEM；C. Reconstitution Buffer；Nitta Gelatin Inc.，日本）制备的胶原蛋白（450微升）加入到细胞悬浮液（3.0×10^6细胞）中并彻底混合。随后加入100微升的培养介质和450微升的Matrigel（Corning 356231）并轻轻混合以获得均匀的细胞-ECM混合物。后续的培养和分化程序按照之前的方法进行。
iv) CM
基本制造程序与CMg相同。使用胶原蛋白凝胶培养试剂盒（A. Cellmatrix Type I-A；B. 10×× MEM；C. Reconstitution Buffer；Nitta Gelatin Inc.，日本）制备的胶原蛋白（450微升）加入到细胞悬浮液（3.0×10^6细胞）中并彻底混合。随后加入100微升的培养介质和450微升的Matrigel（Corning 356231）并轻轻混合以获得均匀的细胞-ECM混合物。后续的培养和分化程序按照之前的方法进行。
2.4 BiCAM收缩力测量
在组织制造后的第8天进行收缩力测量。这项实验是根据Ikeda等人描述的方法进行的。使用微力传感器（AE801，Kronex，美国加利福尼亚州）量化每个BiCAM样品的收缩力。由于传感器通过检测由应变引起的电阻变化来工作，因此通过建立电压输出与收缩力（mN）之间的关系来进行校准。在传感器的尖端安装了一个与用于BiCAM固定的针脚大小相同的轴。具体来说，使用镊子将50、100、200和500毫克的重量轻轻放在轴上，并记录加载过程中的相应电压信号。获取的电压数据在MATLAB（MathWorks，马萨诸塞州，美国）中进行处理；在去除基线漂移后，应用了一个巴特沃斯低通滤波器（截止频率：10 Hz）以消除高频噪声。对于每个重量，计算了加载前后0.25秒间隔内的平均电压差，并使用这些值推导出电压变化与施加力之间的校准方程。

移除了固定BiCAM的一个针脚，并将连接到传感器的轴插入由此产生的孔中。3D培养的骨骼肌细胞浸入高葡萄糖DMEM（D6046-500ML，Sigma-Aldrich，美国）中，并通过两端相距75毫米的铂电极施加电刺激。电刺激使用微控制器（Arduino Uno，Arduino SRL，意大利）进行控制。传感器输出电压和刺激时序信号被路由到模数转换器，并以1 kHz的频率采样。获取的电压数据在MATLAB中处理，首先去除基线漂移，然后应用巴特沃斯低通滤波器（截止频率：10 Hz）以抑制高频噪声。随后，计算收缩期间的电压峰值与刺激前基线之间的差值，并使用校准方程将其转换为力值。然而，如果该值为负，则将收缩力设置为零。

刺激参数定义如下：（1）持续时间：10–500毫秒，电压10伏特，频率1赫兹；（2）电压：2–30伏特，持续时间100毫秒，频率1赫兹；（3）频率：1–8赫兹，持续时间100毫秒，电压10伏特。在每种条件下，定量评估了收缩力响应。

2.5 组织分析通过抗体染色进行
在BiCAMs制作后的第8天进行了免疫荧光染色。为了便于染色，将每个执行器切成四到六块，用PBS冲洗两次，每次冲洗后浸泡在PBS中5分钟，重复两次。然后将这些切片固定在含有2％甲醛的PBS中60分钟，温度为4°4°C。再次用PBS冲洗两次后，将样品浸泡在含有0.5％Triton X-100的PBS中5分钟。为了释放抗原，将样品转移到含有0.05％Triton X-100的10毫摩尔柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，在95°95°C下孵育30分钟。接下来，在含有牛血清白蛋白（BSA；015-27053，Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.，日本）和0.3％Triton X-100的PBS中过夜封闭。第二天，用PBS冲洗样品两次，每次浸泡5分钟。然后将切片在含有抗肌球蛋白重链抗体（1:300；MAB4470，R&&D Systems）的PBST中37°37°C下孵育60分钟。经过两次PBS冲洗和两次5分钟的PBS浸泡后，将样品在含有二次抗体的PBST中在4°4°C下过夜孵育，二次抗体为驴抗小鼠IgG（1:1000；A32787，Invitrogen，马萨诸塞州，美国）。再经过两次PBS冲洗和两次5分钟的PBS浸泡后，将切片安装在带孔的硅胶支架中，并使用共聚焦激光扫描显微镜（FV1200-IX83，Olympus，日本）进行成像。

2.6 数据分析
所有统计分析均使用SPSS（版本26，IBM Japan, Ltd.，日本）进行。对于每个条件，使用15–20个数据点来评估正态性。当不满足正态性时，应用Kruskal–Wallis检验，然后使用Dunn–Bonferroni事后检验进行成对比较。每个数据点的箱形图使用R软件（版本4.4.1；R Core Team）绘制。使用MATLAB（2023b，MathWorks，马萨诸塞州，美国）的系统识别工具箱对BiCAM进行建模，并使用MATLAB创建Bode图。

3 结果
3.1 在各种ECM条件下的BiCAMs力测量
为了检验BiCAMs作为生物混合机器人的执行器的适用性，我们在制作过程中修改了ECM的组成，并测量了在电刺激下的收缩力。四种ECM组成列在表1中。条件i) C和ii) MgF对应于之前的研究（Ohashi等人，2023年）中使用的条件。条件iii)由胶原蛋白和低生长因子的Matrigel（GFR Matrigel；CMg条件）组成。选择这一条件是基于之前的证据，即Matrigel可以促进肌母细胞融合，这对肌纤维的发展至关重要（Grefte等人，2012年；Cheng等人，2014年），而胶原蛋白是生物骨骼肌的主要细胞外基质成分（Csapo等人，2020年）。在条件iv)中，使用的是非低生长因子的Matrigel。由于这种配方中的生长因子含量高于GFR Matrigel（Corning Inc，2023年），我们假设这些因子可能有助于增强收缩力。本研究没有优化CMg和CM条件。使用这四种ECM条件，制作了I形BiCAMs，如图1所示，并对其收缩力进行了系统评估。在力测量过程中，改变了刺激持续时间、电压和频率，并全面分析了收缩力的变化。

图1 生物培养人工肌肉（BiCAM）的概览。(A) 去除模具前的BiCAM。(B) 去除模具后的BiCAM。
首先，为了确定适当的刺激持续时间，在10伏特和1赫兹的条件下，测量了10、20、50、100和500毫秒的脉冲持续时间下的收缩力（图2）。在C条件下，当刺激持续时间为10–20毫秒时，其中一个样本没有观察到明显的收缩反应（也见补充材料）。相比之下，在所有其他ECM条件下都观察到了收缩。在所有情况下，更长的刺激持续时间会导致更大的收缩力：i) C条件约为0.1–0.3毫牛顿，ii) MgF条件约为0.2–0.5毫牛顿，iii) CMg条件约为0.2–0.7毫牛顿，iv) CM条件约为0.1–1.7毫牛顿。值得注意的是，在100毫秒或更长时间的刺激持续时间下，观察到显著的力增加。然而，当持续时间延长到500毫秒时，在刺激结束后也观察到了收缩（数据未显示）。基于这些观察结果，认为100–200毫秒的刺激持续时间是合适的。

图2 每个持续时间的收缩力箱形图。(A–D) 持续时间== 10、20、50、100、500毫秒，电压幅度== 10伏特，刺激脉冲频率== 1赫兹。箱子的顶部表示第三四分位数。箱子的底部表示第一四分位数。箱子中的线表示中位数。上须和下须分别表示上界和下界。点表示异常值。红色十字标记表示平均值。对每种ECM条件进行了统计分析。使用Dunn的方法和Bonferroni调整进行了事后成对比较，之前进行了显著的Kruskal–Wallis检验。条形上方不同的字母表示显著差异（p<0.05）；相同的字母表示无显著差异。n=n=20（每个样本五个重复）。在不同ECM条件下培养的BiCAMs：(A) C，(B) MgF，(C) CMg，和(D) CM。
接下来，在保持脉冲持续时间为100毫秒的情况下，研究了刺激电压对收缩力的影响（图3）。在所有ECM条件下，更高的电压导致了更大的收缩力，尽管响应在大约30伏特时达到饱和。相比之下，在更高的电压下没有观察到重复或多次收缩（补充电影1）。这些发现表明，增加电压是引发BiCAMs更强收缩的有效方法。比较不同ECM条件下的平均收缩力时，数值范围为：i) C条件0.1至0.3毫牛顿，ii) MgF条件0.2–0.9毫牛顿，iii) CMg条件0.2–1.0毫牛顿，iv) CM条件0.1–2.3毫牛顿（最大值：3.5毫牛顿）。

图3 每个电压幅度下的收缩力箱形图。(A–D) 持续时间==100毫秒，电压幅度== 2、5、10、20、30伏特，刺激脉冲频率== 1赫兹。箱子的顶部表示第三四分位数。箱子的底部表示第一四分位数。箱子中的线表示中位数。上须和下须分别表示上界和下界。点表示异常值。红色十字标记表示平均值。对每种ECM条件进行了统计分析。使用Dunn的方法和Bonferroni调整进行了事后成对比较，之前进行了显著的Kruskal–Wallis检验。条形上方不同的字母表示显著差异（p<0.05）；相同的字母表示无显著差异。(A)n=n=15，(B–D)n=n=20（每个样本五个重复）。在(A) C，(B) MgF，(C) CMg，和(D) CM条件下培养的BiCAMs。
最后，在固定电压下比较了不同ECM条件下的收缩力（图4）。在2伏特时，所有ECM条件产生的力大致相同，约为0.2毫牛顿，其中ii) MgF条件显示出最高的值（图4A）。相比之下，在10伏特和30伏特时，出现了不同的趋势，iv) CM条件产生的收缩力最大。具体来说，在30伏特时，i) C条件的平均收缩力为0.25毫牛顿，ii) MgF条件为0.77毫牛顿，iii) CMg条件为1.12毫牛顿，iv) CM条件为2.5毫牛顿。

图4 不同ECM条件下的收缩力比较箱形图。(A–C) 箱子的顶部表示第三四分位数。箱子的底部表示第一四分位数。箱子中的线表示中位数。上须和下须分别表示上界和下界。点表示异常值。红色十字标记表示平均值。对每个电压条件进行了统计分析。使用Dunn的方法和Bonferroni调整进行了事后成对比较，之前进行了显著的Kruskal–Wallis检验。条形上方不同的字母表示显著差异（p<0.05）；相同的字母表示无显著差异。电压幅度分别为(A) 2伏特，(B) 10伏特，(C) 30伏特。i) C条件：n=n=15，ii) MgF，iii) CMg，和(iv) CM条件：n=n=20（每个样本五个重复）。此外，在CM条件下，制造成功率达到了100％，而在其他ECM条件下为62.5％–70％（补充文件2）。这些结果表明，可以通过电刺激优化BiCAM的收缩力，并且CM条件适用于该结构的制造和功能性能（图2–4）。

3.2 通过建模BiCAMs评估响应特性
我们发现产生的力大小取决于ECM的组成。当BiCAMs嵌入生物混合机器人中时，可以施加周期性电刺激以诱导连续运动。在这种情况下，执行器对电刺激的响应速度是性能的关键决定因素。因此，从控制理论的角度出发，我们研究了响应性如何随ECM组成而变化。使用不同的ECM制造的BiCAMs在1、2.5、5和8赫兹的频率下受到电刺激，并记录了它们的时间序列响应。随后使用状态空间表示法对这些时间域数据进行了建模。由于先前的研究表明肌肉动力学可以用质量-弹簧-阻尼系统来近似（Ohashi等人，2023年；Winters，1990年），因此当前模型采用了二阶状态空间公式。使用MATLAB（2023b；MathWorks，Inc.，马萨诸塞州，美国）中的系统识别工具箱进行了系统识别。针对每种ECM条件得到的模型用于分析频率-响应特性，如图5所示，其中上面板显示了增益图，下面板显示了相位图。

图5 每种ECM条件下建模的BiCAM的频率响应特性。基于每种ECM条件的代表性样本，创建了Bode图。i) 胶原蛋白（C）条件用灰色虚线表示，ii) Matrigel GFR + 凝血酶原（MgF）条件用橙色线表示，iii) 胶原蛋白 + Matrigel GFR（CMg）条件用深蓝色虚线表示，iv) 胶原蛋白 + Matrigel（CM）条件用浅蓝色虚线和虚线的组合表示。对增益图的检查表明，各BiCAM的带宽分别约为i) 0.8 Hz，ii) 2.6 Hz，iii) 2.5 Hz，iv) 1.4 Hz。带宽大小作为响应性的定量指标，在此背景下，响应性表示输出快速跟踪和响应输入信号变化的能力，BiCAM反映了它们在周期性电刺激下产生预期力量的能力。在测试的条件中，iv) CM条件在低频或单脉冲电刺激下产生了最大的力。相比之下，在周期性输入下，ii) MgF和iii) CMg条件表现出更优的性能。值得注意的是，峰值频率的比较表明，iii) CMg条件产生的输出力大于ii) MgF条件，这表明总体而言，使用CMg ECM组成的BiCAM是最合适的选择。综合这些结果表明，仅仅改变ECM组成就能显著调节力的大小和频率响应特性。这一发现意味着，通过适当选择ECM，可以为生物混合机器人赋予所需的动态或运动特性。

3.3 在每种ECM条件下对BiCAM进行组织学分析
最后，我们使用抗体染色进行了组织学分析，以探究力大小和频率响应差异的原因（图6）。根据先前的研究结果（Ohashi等人，2023年），I型BiCAM中的肌肉细胞应沿纵向轴（y轴）排列。因此，i) C条件由于收缩力较低，未观察到肌肉细胞纤维，肌肉组织发育不足。而在其他条件下，观察到肌肉细胞沿y轴排列。然而，肌肉细胞的宽度或排列程度没有显著差异，无法确定不同组织特性的原因。据报道，MHC表达模式随肌母细胞发育而变化（Brown等人，2012年）。因此，为了进一步探讨这些特性的差异，需要进行基因表达比较。

图6
用肌球蛋白重链（MHC）免疫染色的骨骼肌组织共聚焦图像。(A–D) 粉红色表示肌球蛋白重链。刻度尺，50 μm。(A) 在(A) C条件、(B) MgF条件、(C) CMg条件、(D) CM条件下培养的BiCAM。

4. 讨论
在这项研究中，我们分析了使用先前研究中开发的简单3D培养骨骼肌细胞生产方法制造的BiCAM的收缩力，目的是将其应用于生物混合机器人（图2-5）。具体来说，我们在改变ECM条件的同时测量了收缩力，以确定能够最大化收缩力的ECM条件（图2-4）。为了实现周期性运动，我们研究了每种BiCAM在间歇性电刺激下的响应特性（图5）。在这项研究中，我们在四种ECM条件下分析了BiCAM的功能：i) 仅胶原蛋白（C），ii) 含GFR和凝血酶原的Matrigel（MgF），iii) 含GFR的胶原蛋白和Matrigel（CMg），以及iv) 胶原蛋白和Matrigel（CM）。
当我们关注在不同ECM下培养的BiCAM的收缩力时，发现i) C条件的收缩力较低，ii) MgF和iii) CMg条件的收缩力适中，而iv) CM条件的收缩力最高（图3）。这些结果表明，收缩力的差异是由于Matrigel中含有的生长因子（GFs）以及Matrigel和胶原蛋白的组合造成的。根据康宁的产品信息，Matrigel含有IGF（平均Matrigel：15.6 ng/mL，典型GFR Matrigel：5 ng/mL）和PDGF（平均Matrigel：12 pg/mL，典型GFR Matrigel：<<5 pg/mL），与GFR Matrigel相比。已有研究表明IGF和PDGF-B参与肌肉发育（Yoshida和Delafontaine，2020年；Hamaguchi等人，2023年）。未来，对这些共同途径的分析可能会揭示这些结果的分子基础。
接下来，我们讨论响应性，即对电刺激输入的响应速度的指标。在产生最强收缩力的iv) CM条件下，响应性并不一定最好。相比之下，产生中等收缩力的i) MgF和iii) CMg条件的响应性值更好。换句话说，ECM不仅影响收缩力，还影响响应性（图5），这表明通过选择合适的ECM，可以设计出能够自由调节力量和响应性的BiCAM。脊椎动物的骨骼肌包含两种类型的肌肉纤维：I型和II型。I型（慢 twitch）纤维收缩速度慢且收缩力低，但耐力强（Plotkin等人，2021年）。另一方面，II型（快 twitch）纤维收缩速度快且收缩力大于慢 twitch纤维，但缺乏耐力（Smerdu等人，1994年；Schiaffino和Reggiani，2011年）。这些纤维并不是均匀分布的，每种肌肉中的组成不同；重要的是，生物体可以改变肌肉纤维的组成，使肌肉适应不同的用途（Talbot和Maves，2016年）。这意味着生物体会根据肌肉的用途改变其组成的肌肉纤维。同样的原理也适用于用于生物混合机器人的3D培养骨骼肌细胞，为每个机器人部件提供适当的肌肉属性非常重要。通过改变ECM组成，我们定量表征了BiCAM响应特性的差异，从而为生物混合机器人设计提供了宝贵的见解。这些结果表明，ECM依赖的响应特性变化可能反映了肌肉纤维类型的差异。然而，由于未检测到肌肉细胞宽度或排列的显著差异，未来的工作将采用基因表达分析和/或免疫染色来估计纤维类型组成。此外，本研究的局限性在于BiCAM的响应特性仅在四种ECM条件下进行了评估。通过改变ECM组成，可以设计出具有多种特性的BiCAM。未来，我们将进行更详细的分析，并开发出能够根据功能和用途适当定位BiCAM的生物混合机器人。
用于生物混合机器人的3D培养骨骼肌细胞的收缩力通常在几百微牛顿到大约10毫牛顿之间（Cvetkovic等人，2014年；Morimoto等人，2018年；Guix等人，2021年）。BiCAM在各种刺激和ECM条件下表现出大约1-2毫牛顿的收缩力（图2-4）。基于此，我们得出结论，BiCAM的收缩力与传统生物混合机器人中使用的肌肉相当，可以用作生物混合机器人的执行器。已经开发出通过增加组织层数（Morimoto等人，2018年）和将多个肌肉束组装成卷状（Ren等人，2025年）来提高收缩力的方法。结合这些方法，未来可能会显著提升BiCAM的收缩力。尽管这些方法可能提高收缩力，但由于生物混合机器人需要长期运行，因此纵向评估是必不可少的。在本研究中，功能分析仅在第8天进行。未来的研究应评估制造组织的刺激后寿命和耐久性。
先前的研究主要集中在简化的3D培养骨骼肌细胞方法上，ECM组成与其响应特性之间的关系尚未充分讨论。通过将我们的形状可控制造方法（Ohashi等人，2023年）与基于ECM的响应特性调整相结合，可以独立于形状生产出具有所需性能的BiCAM。本研究的主要目的是澄清ECM组成与功能和响应特性之间的关系，我们还发现ECM不仅影响功能和响应特性，还影响培养过程本身。这可能是由于ECM改变了组织的物理特性。例如，在ii) MgF和iii) CMg条件下，制造成功率较低，其原因可能是时间常数较短（图5）。这可能反映了产生更大恢复力的较强弹性元素，偶尔导致BiCAM在培养过程中撕裂。这些结果表明，通过改变ECM组成，可以调节BiCAM的物理特性，这可能是BiCAM标准化的重要因素。然而，由于使用了活细胞，细胞间的固有变异性不可避免。因此，建立无论细胞成熟状态如何都能保持收缩力一致性的技术也很重要（见补充材料）。从这些角度进行系统研究将是未来研究的重要方向。总之，使用我们的方法制造的BiCAM为生物混合机器人设计提供了新的可能性，并可能实现3D培养骨骼肌细胞的稳定制造。