《Microbial Cell Factories》：Endophytic fungi-assisted biological synthesis of zinc oxide nanoparticles using gamma-rays for promising antibacterial and antibiofilm potential against some gram-positive bacteria
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随着抗生素滥用导致耐药菌问题日益严峻，开发新型绿色抗菌剂迫在眉睫。本研究利用罗勒内生真菌Aspergillus tamarii的生物活性代谢物，结合γ射线辐照，成功实现了氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的绿色合成。所得纳米颗粒对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌展现出优异的抗菌和抗生物膜活性，其作用机制与破坏细菌细胞膜通透性相关。该研究为开发低成本、环境友好的新型纳米抗菌材料提供了新思路。
在微生物与人类健康的无声战场上，抗生素一度是我们最强大的武器。然而，随着这把武器的滥用，一个更狡猾的敌人——抗生素耐药菌——正悄然崛起。专家预测，到2050年，每年将有约一千万人死于耐药性细菌感染。这场迫在眉睫的公共卫生危机，迫使科学家们将目光投向新的前沿阵地：纳米技术。在众多候选者中，氧化锌纳米颗粒（Zinc Oxide Nanoparticles, ZnO NPs）因其独特的化学、物理和光学性质，低毒性、低成本及可生物降解性，被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为“公认安全”（GRAS）物质，在生物医学、食品安全、化妆品等领域展现出巨大潜力。
然而，传统的化学和物理合成方法往往使用有毒的还原剂，不仅可能限制纳米颗粒在食品和医药领域的应用，还可能造成环境污染。因此，开发一种绿色、经济、高效的合成方法成为当务之急。自然界本身就是一个卓越的“化学家”，植物内生真菌——那些栖息在健康植物组织内部而不引起明显病害的微生物——便是其中杰出的代表。它们能产生丰富的生物活性代谢物，这些代谢物可作为天然的还原剂和稳定剂，用于纳米颗粒的生物合成。此外，γ射线辐照作为一种清洁、高效的能源，能通过水溶液的辐解作用有效还原金属离子，为纳米颗粒的绿色合成提供了另一条捷径。那么，能否将内生真菌的“生物智慧”与γ射线的“物理力量”相结合，创造出一种全新的抗菌纳米武器呢？发表在《Microbial Cell Factories》上的一项研究对此给出了肯定的答案。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先，他们从药用植物罗勒（Ocimum basilicum）的叶片和茎中分离了16株内生真菌，并通过形态学和基于内转录间隔区（ITS）rDNA测序的分子生物学方法进行鉴定。其次，为了低成本生产抗菌代谢物，他们创新性地使用马齿苋（Portulaca oleracea）植物碎块和马铃薯皮作为马铃薯提取物的廉价替代品来制备真菌培养基。接着，他们利用从筛选出的最强效真菌中提取的代谢物，与硝酸锌溶液混合，并通过γ射线（20 kGy）辐照，实现了ZnO NPs的绿色合成。随后，他们采用紫外-可见光谱（UV-Vis. spectroscopy）、动态光散射（DLS）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和高分辨透射电子显微镜（HRTEM）等多种表征技术确认了纳米颗粒的形成、尺寸、形状和晶体结构。最后，通过琼脂孔扩散法、肉汤微量稀释法、结晶紫试管法和布拉德福德（Bradford）蛋白检测法等，系统评估了合成的ZnO NPs及其前体真菌代谢物的抗菌、抗生物膜活性及作用机制。
结果与讨论
从罗勒中分离和形态学鉴定内生真菌
研究从罗勒的不同部位共分离到16株内生真菌，其中10株来自叶片，6株来自茎。根据形态学特征，这些菌株被初步鉴定为曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium）、青霉属（Penicillium）、镰刀菌属（Fusarium）和链格孢属（Alternaria）。其中，曲霉属是最主要的属，占分离株的62.5%。
真菌分离株提取的生物活性次生代谢物的抗菌活性
在16株于马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中培养的真菌中，塔玛曲霉（Aspergillus tamarii）的生物活性代谢物显示出最高的抗菌活性，对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直径分别为16.0±0.13 mm和18.0±0.44 mm。这表明该菌株是生产抗菌物质的良好候选者。文献表明，革兰氏阳性菌因缺乏外膜，更容易受到脂溶性真菌活性代谢物的渗透。
与PDB相比，评估用于生物活性化合物生产的具有成本效益的发酵培养基
为了降低生产成本，研究人员测试了两种低成本培养基：马铃薯皮培养基（PPM）和马齿苋培养基（POM）。结果显示，在POM培养基上培养的塔玛曲霉产生的生物活性代谢物抑菌活性最高，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别达到20.0±0.33 mm和23.0±0.26 mm，优于PPM和传统的PDB培养基。这可能是因为马齿苋富含酚类、类黄酮等植物化学物质，可以调节真菌代谢途径，刺激生物活性次生代谢物的生物合成。
最强效内生真菌的分子鉴定
通过对最强效菌株的ITS rDNA区域进行测序和系统发育分析，确认该菌株为塔玛曲霉（Aspergillus tamarii），其序列已提交至GenBank，登录号为PX474848.1。
γ射线对ZnO NPs合成的影响
利用真菌提取物与硝酸锌溶液混合，并经20 kGy剂量的γ射线辐照，成功合成了ZnO NPs。紫外-可见光谱在362 nm处出现特征吸收峰，证实了ZnO NPs的形成。γ射线提供了一种无需高温和额外化学品的清洁合成途径。
合成的ZnO NPs的表征
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XRD、DLS和Zeta电位测定：X射线衍射（XRD）图谱显示合成的ZnO NPs具有六方晶结构。动态光散射（DLS）分析显示纳米颗粒的平均粒径分布为21.9和204.2 nm。Zeta电位在pH 7.2时为-0.1 mV，表明颗粒表面带负电，这有助于其在溶液中的分散稳定性。
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HRTEM和SEM成像：高分辨透射电子显微镜（HRTEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像显示，合成的ZnO NPs呈球形和棒状混合形态，平均粒径为70.34 nm（范围30.22-90.23 nm）。颗粒分散均匀，形貌一致。
生物合成的ZnO NPs的抗菌活性
评估了从不同培养基（PDB、PPM、POM）培养的塔玛曲霉提取物合成的ZnO NPs的抗菌活性。其中，基于POM培养基提取物合成的ZnO NPs活性最强，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为26.0±0.30 mm和27.0±0.13 mm，对两种菌的最小抑菌浓度（MIC）均为31.25 μg/mL。ZnO NPs的抗菌机制可能涉及其高表面体积比导致的细胞膜损伤、活性氧（ROS）的产生、蛋白质和酶功能的破坏以及基因损伤等多重作用。
生物合成的ZnO NPs的抗生物膜活性
采用结晶紫试管法评估了ZnO NPs的抗生物膜活性。结果显示，经ZnO NPs（31.25 μg/mL）处理后，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜形成抑制率分别达到50.32%和55.33%。纳米颗粒能够穿透已形成的生物膜，消除内部的微生物细胞，展现出清除生物膜的潜力。
细菌蛋白渗漏调查
通过布拉德福德（Bradford）法检测了经ZnO NPs处理的细菌培养上清液中的蛋白质含量。结果表明，随着ZnO NPs浓度增加，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的蛋白泄漏量显著增加，在1.0 mg/mL ZnO NPs处理下，蛋白泄漏量分别达到140.40 μg/mL和101.23 μg/mL。这直接证明了ZnO NPs能破坏细菌细胞膜的通透性，导致细胞内含物外泄，从而发挥杀菌作用。
结论与意义
本研究成功开发了一种综合利用内生真菌生物活性代谢物和γ射线辐照的绿色、经济合成氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的方法。核心发现是，从罗勒中分离的塔玛曲霉（Aspergillus tamarii）在马齿苋（POM）低成本培养基中能高效生产抗菌代谢物，以此为基础，结合20 kGy γ射线辐照，成功合成了平均粒径约70.34 nm、形貌均一的ZnO NPs。
该生物合成的ZnO NPs对两种重要的革兰氏阳性病原菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）——表现出显著的抗菌和抗生物膜活性。其抗菌效力甚至超过了原始真菌提取物，最小抑菌浓度（MIC）低至31.25 μg/mL。机理研究表明，ZnO NPs的抗菌作用与其破坏细菌细胞膜完整性、增加膜通透性、导致细胞内蛋白质泄漏密切相关。
这项研究的意义在于，它提出并验证了一条从真菌分离、低成本培养基优化到纳米颗粒绿色合成的完整创新路径。首先，它利用农业副产品（马齿苋、马铃薯皮）降低生产成本，体现了可持续生物制造的理念。其次，将真菌的生物合成能力与γ射线的物理还原作用相结合，避免了有毒化学试剂的使用，是环境友好的“绿色化学”典范。最重要的是，所获得的ZnO NPs展现出优异的抗菌性能，为应对日益严峻的细菌耐药性问题提供了具有应用潜力的新型纳米抗菌剂候选，尤其在食品保鲜、医疗器械涂层、抗感染治疗等领域具有广阔的应用前景。这项研究不仅为ZnO NPs的绿色合成提供了新策略，也深化了人们对内生真菌资源及其在纳米生物技术中应用价值的认识。
