通过iSCAT涨落显微镜检测可开关异质二聚体等离激元尺中的构象变化

《Nanoscale Horizons》：Detecting conformational changes in switchable heterodimer plasmon rulers through iSCAT fluctuation microscopy

为了解决如何在单分子水平上高时空分辨率地检测生物分子（如微小RNA）的结合事件及其引发的构象动力学问题，研究人员利用DNA链接的40 nm/20 nm金纳米粒子异质二聚体（Plasmon Ruler）结合干涉散射（iSCAT）涨落显微镜，开展了一项创新性研究。他们成功证明，当目标miRNA结合并打开DNA连接链中的分子信标发夹结构时，可通过测量iSCAT信号涨落的显著增加（如平均绝对偏差MAD）来检测这一构象变化。这项研究不仅为单分子生物物理传感提供了一种无需标记的新策略，也突显了iSCAT涨落显微镜在揭示等离激元分子结构动力学方面的巨大潜力。

　　

在生命科学的微观世界里，实时、精准地“看到”单个生物分子如何运动、如何相互作用，一直是科学家们追求的梦想。这不仅是理解生命基本过程的关键，也是疾病早期诊断和药物研发的核心。传统的荧光显微镜虽然功勋卓著，但存在光漂白、标记可能干扰分子功能等局限。而等离激元纳米结构，特别是被称为“等离激元尺”的DNA链接的金属纳米粒子对，因其距离依赖的光学响应和优异的光稳定性，为无标记、长时程监测纳米尺度距离变化提供了可能。然而，经典的等离激元尺多由两个尺寸相同的纳米粒子（同质二聚体）构成，较大的粒子在受限空间内运动时，其体积效应和空间位阻可能会干扰所连接生物分子的自然构象动力学，限制了其在探测更小、更精细生物分子结构变化中的应用。

为了克服这些挑战，并探索在单分子水平上检测如微小RNA（miRNA）这类重要生物标志物的新方法，一个研究团队在《Nanoscale Horizons》上发表了一项创新性工作。他们设计了一种由40纳米和20纳米金纳米粒子（Au NP）通过一段可开关的DNA链连接而成的异质二聚体“等离激元尺”。这项研究的核心是，利用干涉散射显微镜（iSCAT）极高的检测灵敏度，来“读取”由被拴住的20纳米金粒子运动所引起的信号涨落，并成功地将目标miRNA结合导致的DNA链构象变化，转化为可检测的光学信号波动变化。

为了开展这项研究，作者们运用了几个关键技术方法。首先，他们通过DNA程序化自组装，制备了40 nm/20 nm Au NP异质二聚体，并利用凝胶电泳进行了纯化。其次，他们搭建了高时间分辨率的iSCAT显微成像系统，该系统使用520纳米激光光源和高速光子探测器，能以50 kHz的采样率记录单个纳米散射体的iSCAT信号。最后，他们建立了一套完整的单粒子数据分析流程，通过计算iSCAT对比度（σ_iSCAT）及其涨落的统计量（如平均绝对偏差，MAD），来量化异质二聚体在不同条件下的动态行为，并与40纳米Au NP单体等对照组进行比较。

研究结果与讨论

异质二聚体的设计与表征：研究者设计了一个核心包含分子信标发夹序列的DNA连接链。在没有目标miRNA时，发夹闭合，DNA链较短；当目标miRNA（miRNA 574-3P，一种前列腺癌生物标志物）结合时，发夹打开，DNA链延伸。蠕虫状链模型预测，结合前后DNA链的末端到末端距离从14.6纳米增加到17.2纳米。扫描电子显微镜（SEM）图像证实了异质二聚体的成功组装与纯化。

iSCAT信号涨落揭示构象动力学：研究人员对单个异质二聚体在添加miRNA前后的iSCAT对比度（σ_iSCAT）时间轨迹进行了采集和分析。结果显示，在添加目标miRNA后，σ_iSCAT的涨落显著增加，表现为功率谱密度升高和平均绝对偏差（MAD）的统计学显著增大。而作为对照，添加非互补miRNA或使用亚精胺（spermidine）使DNA链塌缩固定后，信号涨落均维持在较低水平。40纳米Au NP单体也显示出较低的涨落，这证实了观察到的涨落确实源于异质二聚体中20纳米粒子的受限运动。对约100个异质二聚体的统计分析进一步证实，只有添加互补目标miRNA的组别表现出MAD值的显著增高和更宽的分布。

涨落增加的物理机制：研究者通过一个简单的几何模型解释了这一现象。miRNA结合导致DNA发夹打开，不仅增加了链的末端距离，也使20纳米粒子可探索的锥形空间（由连接点在40纳米粒子表面的位置决定）的开角从122.8度增大到143.3度。这使得20纳米粒子可探索的构象空间体积增加了约1.6倍，从而能够采样更多不同的粒子间距和相对取向。由于异质二聚体的iSCAT信号强烈依赖于粒子间的距离和相对取向（受等离激元耦合调制），构象空间的扩大自然导致了观测到的iSCAT信号涨落的增加。

初步的浓度响应：研究还探索了该方法的检测灵敏度。实验表明，即使在0.1 nM的低浓度下，添加互补miRNA也能导致部分等离激元尺的MAD值明显上升，而非互补对照组则无此变化，这证明了该方法具备检测低浓度目标物的潜力。

研究结论与展望

本研究证实，iSCAT涨落显微镜能够灵敏地检测等离激元尺中由等离激元耦合诱导的散射截面和相位变化所反映的DNA连接链构象动力学变化。通过使用40纳米/20纳米金纳米粒子异质二聚体，并整合一个可被miRNA打开的分子信标序列，研究人员成功地将一个22个核苷酸的小RNA目标物的结合事件，转化为iSCAT对比度涨落的统计学显著增加。这种异质二聚体结构减小了进行拴系粒子运动的纳米粒子尺寸，从而最大限度地减少了空间位阻和排除体积效应，为表征单个生物分子的结构动力学提供了新途径。

这项工作的重要意义在于多个层面。首先，它为无标记、单分子水平的生物传感，特别是针对miRNA等小分子量生物标志物的检测，提供了一种全新的光学读出力案，有望成为传统荧光分子信标方法的补充。其次，它展示了iSCAT涨落显微镜结合等离激元尺在揭示生物分子构象能态和动力学方面的巨大潜力，高时间分辨率与长观测时间的结合使得探索分子低能态与高能态构象及其随时间或外部刺激的变化成为可能。此外，该研究也指出了未来优化方向，例如通过缩短整体DNA连接链的长度来增强纳米粒子间的耦合强度和靶标结合引起的相对长度变化，从而提升传感器性能。最后，这项工作也激励了后续更深入的基础研究，例如探索在不同共振与非共振激发波长下，等离激元耦合对iSCAT信号涨落的具体贡献，以及研究不同尺寸纳米粒子构成的同质/异质二聚体，以进一步理解其光学-结构动力学关系。