利用高效逆流色谱法从亚马逊地区Andira parviflora（Ducke）废弃木材的细胞毒性提取物中分离黄酮类化合物

《Journal of Chromatography A》：High-performance countercurrent chromatography isolation of flavonoid from a cytotoxic extract of Andira parviflora (Ducke) waste wood from the Amazon region

从紫玉檀心材废料中分离出五种黄酮类化合物，其中二氢查耳酮异构体 coatlin A 为首次报道，isoliquiritigenin 为属内首次发现，均显示对多种癌细胞（胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、白血病）的细胞毒性。HPCCC-HPLC-UV 联合技术高效简化分离流程，降低溶剂消耗和成本。

　　

伊莎多拉·莫伊塔·德·阿劳茹（Isadora Moita de Araújo）| 萨拉·拉里萨·戈麦斯·弗洛雷斯（Sarah Larissa Gomes Flores）| 吉尔达·吉马良斯·莱唐（Gilda Guimar?es Leit?o）| 科林·布莱特（Colin Bright）| 若昂·维克托·德·梅洛·佩雷拉（Jo?o Victor de Melo Pereira）| 塞利娜·德·杰索斯·吉马良斯（Celina de Jesus Guimar?es）| 克劳迪娅·多·奥·佩索阿（Claudia do ó Pessoa）| 雅斯明·库尼亚·达·席尔瓦（Yasmin Cunha da Silva）| 瓦尔迪尔·弗洛伦西奥·达·维加·朱尼奥尔（Valdir Florêncio da Veiga Junior）| 费利佩·莫拉·阿劳茹·达·席尔瓦（Felipe Moura Araújo da Silva）| 雷娜塔·塔凯阿拉·哈托里（Renata Takeara Hatori）| 安德森·卡瓦尔坎特·吉马良斯（Anderson Cavalcante Guimar?es）

亚马逊联邦大学（Universidade Federal do Amazonas），精确科学研究所（Instituto de Ciências Exatas），DQ部门，天然产物实验室（Laboratório de Produtos Naturais），邮编69067-005，马瑙斯（Manaus），亚马逊州（AM），巴西

摘要

Andira parviflora Ducke（豆科植物），俗称“sucupira vermelha”，主要分布于亚马逊地区的干旱森林中。由于其巨大的体型和致密的木材，该物种被木材工业广泛利用。然而，关于其工业木材加工残渣的化学成分的研究却很少。文献中已报道了一些pterocarpans和异黄酮衍生物的存在。在本研究中，我们利用高效逆流色谱法（HPCCC）结合高效液相色谱-紫外光谱法（HPLC-UV）从A. parviflora的心材废料中分离出酚类化合物，这些化合物表现出潜在的细胞毒性。细胞毒性测试针对星形胶质瘤细胞、人类结肠癌细胞、前列腺癌细胞和早幼粒细胞白血病细胞系进行。4克乙酸乙酯提取物通过反相HPCCC进行纯化，使用了半制备型136毫升色谱柱和两相溶剂系统的非线性梯度洗脱：第一阶段为己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:3:1:3 v/v），第二阶段为1:2:1:2 v/v，两种体系的水相均作为流动相。HPLC-UV分析显示，从第四个组分中分离出了coatlin A的两种二氢查尔酮异构体（化合物1和2），以及isoliquiritigenin（3）、medicarpine（4）和biochanin A（5）。化合物1和2在该物种中是首次发现，而化合物3则是首次在该属中被报道。在HPLC纯化之前使用制备型HPCCC技术，不仅分离出了三种不同的黄酮类化合物，还简化了样品处理过程，并通过减少溶剂消耗、缩短处理时间和提高样品回收率降低了整体成本。

引言

巴西是全球第四大热带木材生产国，大部分木材产自该国北部地区。木材行业在当地经济中发挥着重要作用，对这一地区的小城镇经济贡献显著。然而，木材废料的数量显著增加，其中大部分尚未得到利用[1]。据估计，亚马逊地区伐木活动产生的废料中约有18%来自采集过程，约45%至55%来自木材生产过程。这些废料的主要用途是能源生产，部分被碳化处理，其余部分则被丢弃到环境中，成为严重的环境问题[2,3]。Andira parviflora Ducke（豆科植物），俗称“sucupira vermelha”或“angelim”，是一种木质坚硬的大型树木，广泛用于木材工业，原产于亚马逊地区的干旱森林[4]。除了其经济价值外，Andira属在化学生物分类学上也具有重要意义，因为它能产生萜类和黄酮类等次生代谢物，这些物质通常具有细胞毒性、抗菌和抗炎等生物活性[4,5]。因此，选择A. parviflora作为研究对象不仅基于其木材残渣的可用性，还基于其有希望的植物化学特性及其对属内化学生物分类学知识的贡献。

通过从Andira parviflora中分离黄酮类化合物，本研究推进了亚马逊木材资源生物多样性化学特征的探索。类似于对Trametes sanguinea的研究，基因组注释工作展示了分子数据如何增强对木材相关生物体的识别和功能分析[6]。靶向化学分离与非靶向基因组分析相结合，有助于全面了解研究不足物种的生物和化学潜力，尤其是在次生代谢物途径方面。

天然产物及其半合成衍生物仍是发现新药物（包括抗癌药物）的重要起点[7,8]。结肠癌是全球第三大常见癌症类型，2020年报告的病例约为100万例。其高死亡率很大程度上归因于诊断阶段较晚[9,10]。目前的治疗方法包括手术、放射治疗、化疗、靶向治疗和抗血管生成治疗，但这些方法常常伴随着显著的副作用和药物耐药性的产生，这凸显了继续研究具有抗癌活性的生物活性化合物的必要性[11]。为了有效开展此类研究，需要可靠的分离和纯化方法从复杂的天然产物基质中分离活性成分。逆流色谱法（CCC）是一种有效的技术，它在生物活性化合物的鉴定和手性分子的分辨方面具有独特优势[12,13]。CCC基于液-液分配原理，使用两种不相溶的液体相，其中一个作为流动相，另一个作为固定相，从而无需使用昂贵的固体支撑物，并减少了有机溶剂的消耗[16, [17], [18]]。固定相的液态特性还带来了样品完全回收、高负载能力、多种洗脱模式以及与广泛极性范围的溶剂兼容性[14, [15], [16], [17], [18], [19], [20]]。此外，该技术具有可重复性，适用于工业规模的应用，能够大量纯化化合物或化合物混合物[21]。不同制备色谱技术的结合使用有助于纯化复杂的天然产物提取物。例如，CCC可用于将复杂的粗提物简化为目标化合物组，而HPLC等补充技术可进一步精炼分离过程[22,23]。Figueiredo等人利用CCC从Ampelozizphus amazonicus的乙醇提取物中获得了富含皂苷的组分，随后通过HPLC进一步纯化了目标化合物[24,25]。类似地，Guo等人将正相快速色谱与CCC结合使用，从Thymus quinquecostaus中分离出黄酮类化合物[25]。

在涉及生物测定的研究中，确保分离出的化合物的可追溯性以及生产足够量的纯化合物以进行药理学评估至关重要[15, [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]]。这些优势凸显了CCC在致力于生物活性化合物开发和发现的实验室中的日益广泛应用。例如，Santos等人成功使用CCC从绿色蜂胶的己烷提取物中分离出了artepillin C和baccharin，获得了高产率和纯度。这些分离出的生物标志物及绿色蜂胶的乙醇提取物均表现出抗SARS-CoV-2活性。因此，CCC被证明是一种有效的天然产物中生物活性化合物的分离和纯化方法，尤其是在复杂基质中[12,25]。

在本研究中，我们利用高效逆流色谱法（HPCCC）结合HPLC-UV从A. parviflora的心材提取物中分离出酚类化合物。据我们所知，这是首次使用HPCCC从该植物的心材废料中分离天然产物的报道。

这项研究强调了木材废料的潜在价值，并有助于更深入地了解A. parviflora的化学组成和药理特性。

化学品和试剂

提取物和所有HPCCC分离过程均使用了分析级有机溶剂：乙醇（Cinética，圣保罗，巴西）、正己烷、氯仿（Vetec Química LTDA，里约热内卢，巴西）、乙酸乙酯、丁醇（Dinamica Química Contemporanea LTDA，圣保罗，巴西）和甲醇（Synth，圣保罗，巴西）。HPLC级甲醇来自Merck（达姆施塔特，德国），超纯水来自Milli-Q纯化系统（Millipore，波士顿，马萨诸塞州）。

细胞毒性活性

通过细胞毒性测定指导化合物的分离过程，体现了将生物筛选与制备色谱法结合的有效性。这种方法与类似的方向性分离方法（如Zeng等人的研究[31]）类似，后者通过生物活性导向分离成功鉴定了抗痛成分。

结论

HPCCC和HPLC技术的结合使得从A. parviflora的乙酸乙酯提取物中分离出五种黄酮类化合物，这些化合物对肿瘤细胞表现出细胞毒性。此外，该研究还证明了HPCCC在半制备规模上分离复杂木材废料的有效性。首次从该植物中分离出了二氢查尔酮异构体α-epi-coatlin A和coatlin A以及isoliquiritigenin。

作者贡献声明

伊莎多拉·莫伊塔·德·阿劳茹（Isadora Moita de Araújo）：撰写原始稿件、方法设计、数据整理、研究及数据分析。萨拉·拉里萨·戈麦斯·弗洛雷斯（Sarah Larissa Gomes Flores）：撰写原始稿件、方法设计、数据整理。吉尔达·吉马良斯·莱唐（Gilda Guimar?es Leit?o）：撰写/审稿、编辑、监督、方法设计。科林·布莱特（Colin Bright）：撰写/审稿、编辑、监督、方法设计。若昂·维克托·德·梅洛·佩雷拉（Jo?o Victor de Melo Pereira）：概念构思、方法设计、数据分析。塞利娜·德·杰索斯·吉马良斯（Celina de Jesus Guimar?es）：撰写/审稿、编辑、监督。

CRediT作者贡献声明

伊莎多拉·莫伊塔·德·阿劳茹（Isadora Moita de Araújo）：撰写/审稿、撰写原始稿件、方法设计、数据分析、概念构思。萨拉·拉里萨·戈麦斯·弗洛雷斯（Sarah Larissa Gomes Flores）：撰写/审稿、撰写原始稿件、方法设计、数据整理。吉尔达·吉马良斯·莱唐（Gilda Guimar?es Leit?o）：撰写/审稿、撰写原始稿件、监督、方法设计、研究、数据分析、概念构思。科林·布莱特（Colin Bright）：撰写/审稿、方法设计。若昂·维克托·德·梅洛·佩雷拉（Jo?o Victor de Melo Pereira）：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢FAPEAM（亚马逊州研究基金会）、INCT（国家科学技术创新研究所，通过INCT T-Bio2——转化生物发现和生物模型项目[资助编号408566/2024-8]、CNPq（国家科学技术发展委员会）的财政支持。同时感谢UFAM的分析中心，以及Mil Madeiras公司提供的植物材料。