《Journal of Chromatography A》：Retention Modeling of Oligonucleotides on an Amide-Based HILIC Column: A Descriptor-Driven Approach
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为解决HILIC模式下寡核苷酸分离机理不清的问题，研究人员通过系统的实验设计与描述符建模，揭示了溶剂化效应与氢键作用在寡核苷酸保留中的主导地位，挑战了传统的亲水分配认知。这为HILIC方法开发提供了新视角，并证明质子溶剂可有效调控选择性。
在生物医药领域，寡核苷酸（一种短链核酸）作为一种新兴的疗法，其研发管线正蓬勃发展。然而，要确保这些“药物分子”的质量，精确分析其组成和纯度是必不可少的关键环节。目前，离子对反相液相色谱（IP-RPLC）是主流分析手段，但它所使用的离子对试剂会抑制质谱信号并可能污染仪器。近年来，亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）凭借其高分辨率和出色的质谱兼容性，成为了一项颇具前景的替代技术。但问题是，HILIC技术用于分析大分子、高电荷的寡核苷酸时，其背后的保留机理却像一团迷雾。传统理论认为，分析物会在富含有机相的流动相和固定相表面的“水富集层”之间进行亲水分配，但寡核苷酸分子尺寸大，在其实用的洗脱条件下（水含量高达50%-70%），这个薄薄的水层可能根本不存在。机理不明，方法开发就如同“盲人摸象”，难以高效地优化分离条件。为了拨开这团迷雾，来自日内瓦大学和沃特世公司的研究人员开展了一项系统性研究，旨在解码寡核苷酸在酰胺基HILIC柱上的保留奥秘，相关成果发表在《Journal of Chromatography A》上。
为了揭示核心机理，研究人员运用了几项关键技术方法。首先，他们采用了多轮序贯的实验设计（DoE）策略，系统筛查了氢键、偶极-偶极相互作用、溶剂化效应和离子相互作用四种潜在机制的影响。其次，利用三元溶剂混合物设计，精细调节甲醇、异丙醇和乙腈的比例，以探究不同有机改性剂对保留行为的贡献。接着，研究引入了基于物理化学性质的描述符建模方法，将溶剂参数（如Kamlet–Taft氢键酸度α和极性参数π*）与寡核苷酸序列描述符（PARCH，一种量化核苷酸亲水性的指标）相结合，构建了定量的保留模型。最后，借助DryLab软件进行色谱模拟与优化，将机理认识转化为实际分离方法的提升。研究所用的寡核苷酸样本为商业合成的特定DNA序列，包括同聚物、线性和发夹结构的异聚物等。
4.1. 鉴定驱动ON保留的主要因素
通过两轮分辨率IV级部分因子设计筛查，研究人员发现，在所有测试的寡核苷酸中，有机共溶剂的特性是影响保留的最主要驱动力。具体而言，用甲醇替换乙腈会显著降低保留，这表明甲醇作为强氢键供体，与寡核苷酸竞争氢键的作用非常突出。而异丙醇也显示出显著但弱于甲醇的影响，这与其较弱的氢键酸度和较强的溶剂化性质相符。相比之下，添加剂尿素、Cyrene和醋酸铵在测试浓度范围内的影响均未达到统计显著性。这一结果明确表明，在寡核苷酸的HILIC分析中，溶剂化效应和质子溶剂的氢键竞争是主导机制，而亲水分配的贡献可以忽略。
4.2. 甲醇、异丙醇和乙腈贡献的混合物设计分析
通过三元混合物设计，研究人员更细致地观察了溶剂组成的影响。如图1所示，对于大多数分析物，乙腈导致最高的保留，而甲醇导致最低的保留，异丙醇通常介于两者之间。等高线图显示出强烈的非线性混合效应，表明从甲醇向乙腈转变时，保留的增加存在协同增强。这证实了流动相的溶剂化能力和氢键竞争能力是调控保留的关键。此外，不同二级结构（线性、发夹、双链）的寡核苷酸并未表现出一致的保留顺序，其相对保留值随溶剂组成而变化，进一步说明保留主要由溶剂控制的去溶剂化和竞争效应决定，而非简单的亲水分配或碱基特异性极性。
4.3. 使用联合溶剂描述符和PARCH亲水性进行保留建模
为了整合溶剂性质和寡核苷酸结构特征，研究人员建立了一个多元模型，将表观保留因子（k_app）的自然对数与流动相氢键酸度（α_MP）、极性参数（π_MP）以及序列依赖的PARCH描述符相关联。模型在30°C下拟合优度（R2）高达0.938，准确再现了实验数据。回归系数显示，溶剂化效应（由π_MP代表）是保留的最主要贡献者，氢键酸度也有正向贡献但程度较小，而PARCH描述符具有统计显著性。这表明PARCH作为分析物亲水性的度量，能有效预测其保留趋势。如图2B所示，在不同溶剂组成下，ln k与PARCH值均呈现显著相关。
4.4. 温度效应
将柱温从30°C升至80°C，模型系数发生了有规律的变化。溶剂化效应系数（β_S）显著增加，表明高温下溶剂化排斥作用增强。而氢键贡献系数（β_H）基本不变。最显著的变化是序列依赖系数（β_PARCH）下降了近50%，意味着高温削弱了寡核苷酸自身结构亲水性差异对保留的影响，可能是由于水化壳层被破坏及二级结构变得松散所致。这进一步印证了在升温条件下，保留更加由溶剂控制的相互作用主导。
4.5. 结合HILIC保留对PARCH的解释
在本文的洗脱条件下，固定的水富集层并不存在。因此，PARCH与保留的正相关性不能解释为经典的亲水分配。相反，PARCH值高的寡核苷酸具有更大的可及极性表面和更多氢键位点，它们在乙腈为主的流动相中溶剂化更差，从而受到更强的溶剂化排斥而被“推向”极性固定相表面，随后通过氢键等作用吸附在表面。因此，PARCH描述符量化的是寡核苷酸在经历溶剂化排斥后，与固定相发生表面相互作用的整体趋势。
4.6. 方法优化建议
基于上述机理认识，研究人员提出，使用甲醇-乙腈混合溶剂而非纯乙腈，能提供更灵活的方法开发空间。通过DryLab软件对梯度时间和三元溶剂组成进行优化，发现甲醇比例高的条件能提供更高的分离度，并可改变洗脱顺序。如图4所示，分辨率图清晰地显示了溶剂组成对选择性的强大调控作用。最终，研究人员成功优化出一个基线分离5种20聚体寡核苷酸序列变体的方法，其流动相B为20%水、76%甲醇和仅4%乙腈的混合物，这在传统的纯乙腈流动相中是无法实现的。优化方法在长柱上成功验证，预测与实验色谱图吻合良好，如图5所示。
本研究的结论清晰而有力：对于酰胺基HILIC柱上的寡核苷酸分离，传统的亲水分配机制并非主导作用。实验证据表明，溶剂化效应和氢键作用才是驱动保留的主要因素。因此，这种保留机制被重新定义为“溶剂化效应主导的HILIC”机制。这一认知转变具有重要的方法论意义。它打破了HILIC必须使用高比例乙腈的思维定式，证明引入质子共溶剂（如甲醇）可以有效且精细地调控分离选择性，为解决结构相近的寡核苷酸分离难题提供了新武器。研究成功展示的、基于甲醇-乙腈混合溶剂的优化方法，其分离效果优于传统纯乙腈体系，这为色谱工作者开发高效的HILIC分析方法提供了切实可行的新策略。最终，这项工作推动了对HILIC的理解，将其从一个单一的亲水分配模型，拓展为一个包含多种相互作用、其平衡取决于分析物大小、电荷和溶剂环境的“光谱式”保留机制体系。
