《Journal of Chromatography Open》：Stability Issue of Amino acids and Organic Acids in Exhaled Breath Condensate and The Potential Use for Lung Cancer Diagnosis
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本文聚焦于肺癌诊断中的关键挑战——缺乏可靠的无创生物标志物。研究人员针对肺癌患者和健康人呼出气冷凝液（EBC）中的氨基酸和有机酸，系统评估了样本储存稳定性，优化了LC-QTOF-MS分析方法，并探讨了其作为无创诊断标志物的潜力。研究发现EBC中特定代谢物存在组间差异，虽然单个代谢物尚缺乏绝对的区分能力，但为后续非侵入性诊断研究奠定了方法学基础。该研究为解决肺癌早期、无创诊断的难题提供了重要思路。
肺癌是全球范围内癌症相关死亡的主要原因，对男性而言是最常被诊断的癌症，对女性则是第三大常见癌症。目前的诊断“金标准”是活检，这种方法具有侵入性，存在风险，且不适合重复使用，这使得寻找无创诊断工具成为迫切需求。其中，呼出气（EB）分析作为一种极具前景的非侵入性方法，允许对代谢信息进行无痛、无限制的采样。除了大气气体和水分，呼出气还含有挥发性有机化合物，这些化合物从血液扩散到肺部，反映了人体的生理状态。而通过冷却呼出气获得的呼出气冷凝液，被证明能够捕获更广泛的生物标志物，包括蛋白质和细胞因子等非挥发性分子，为生物标志物发现提供了更丰富的基质。然而，这个充满希望的领域也面临挑战，其中之一就是缺乏标准化的方法，特别是样本采集、储存方案和分析策略的标准化，这些因素直接决定了分析的效能和可重复性。此外，尽管氨基酸和有机酸在许多疾病的诊断中显示出潜力，但在呼出气冷凝液中的研究却相当稀少。这些代谢物在生化网络中无处不在，这常常使其作为独立生物标志物的使用变得复杂，但它们又是理解疾病诱导的代谢失调的核心。为了推动无创诊断的发展，明确呼出气冷凝液中这些关键代谢物的分析方法、储存稳定性及其在疾病中的变化模式，就成了一项明确而紧迫的研究任务。近期，一项发表于《Journal of Chromatography Open》的研究，正是为了回答这些问题而展开。
为系统评估氨基酸和有机酸在呼出气冷凝液中的稳定性及诊断潜力，研究人员开展了一项涵盖方法学优化和临床验证的研究。他们首先招募了30名肺癌患者和19名健康受试者构成研究队列。利用定制的玻璃冷凝装置，在严格标准化条件下收集呼出气冷凝液样本。随后，采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）这一高灵敏度技术，对目标代谢物进行定性与定量分析。研究核心在于通过模拟不同储存温度和冻融循环条件，系统评估了多种氨基酸和有机酸的稳定性，以确定最优的样本前处理与储存参数。最后，运用曼-惠特尼U检验和受试者工作特征曲线下面积（AUC-ROC）分析等统计方法，评估了这些代谢物在两组间的浓度差异及其作为诊断标志物的区分能力。
优化和验证LC-QTOF-MS分析方法
研究人员对液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）的分析条件进行了系统优化。他们评估了双电离源（DUIS）与电喷雾电离（ESI）的性能，发现DUIS模式能产生更高的信号强度，因此被选为后续实验的电离方式。通过系统改变接口电压，最终将能产生最大响应的4 kV设置为最佳电压。在优化条件下，该方法对所有目标化合物都实现了高灵敏度，能够在十亿分比浓度水平上检测呼出气冷凝液中的目标分析物。基质效应评估结果显示，所有29种分析物的基质效应值均在可接受的±15%范围内，表明主要由水构成的呼出气冷凝液基质对信号抑制或增强的影响可忽略不计。
储存温度对分析物稳定性的影响
研究评估了储存条件对呼出气冷凝液中氨基酸和有机酸水平的影响。将加标样本分装后，分别在+4°C、-20°C和-80°C下储存8天，并监测其稳定性。在+4°C下，所有分析物都表现出逐步降解的趋势，但速率和程度差异显著。丝氨酸、琥珀酸和马尿酸等物质降解迅速，而甘氨酸、脯氨酸和甜菜碱等则表现出较强的稳定性。在-20°C下，冻融过程虽然比+4°C保存效果更好，但一些不稳定化合物（如丝氨酸和琥珀酸）在8天后仍出现显著降解。在-80°C下，经过反复冻融，大多数分析物表现出高度稳定性，但丝氨酸和琥珀酸仍损失明显。研究还发现，冻融过程本身会引入额外的降解。比较表明，降低储存温度能显著提高稳定性，-80°C储存为大多数分析物提供了超过7天的最佳保存。然而，即使在-80°C下，一些不稳定化合物的降解以及不可预测的基质效应，也表明需要针对具体化合物采取稳定策略。因此，本研究中的所有分析均在样本于-80°C储存最多三天内完成，以最小化前分析误差。
真实样本分析
对来自肺癌患者和健康对照组的呼出气冷凝液样本进行分析。在检测的16种氨基酸中，只有丙氨酸未在任何样本中检出，这可能是由于其浓度低于方法的检出限。天冬氨酸、亮氨酸和组氨酸是最常被检出的氨基酸。在13种有机酸中，甜菜碱、肌酸、马尿酸、次黄嘌呤、左旋肉碱、烟酰胺、牛磺胆酸和香草醛在所有呼出气冷凝液样本中均未检出。相反，哌啶酸、牛磺酸、琥珀酸和葫芦巴碱这四种有机酸在所有呼出气冷凝液样本中均被检出。值得注意的是，葫芦巴碱并非主要的内源性人类代谢物，而是一种被广泛认可的饮食生物标志物和微生物组产物。通过比较肺癌组和对照组之间的检出频率，发现一组由五种代谢物（哌啶酸、天冬氨酸、牛磺酸、琥珀酸和葫芦巴碱）构成的核心组合在两组的所有样本中普遍存在。此外，一些化合物表现出显著的组间特异性趋势：苯丙氨酸在83%的肺癌患者样本中被检出，而对照组仅为53%；色氨酸仅在两名健康个体中检出，在所有肺癌患者样本中均缺失；苏氨酸仅在三名肺癌患者中检出。这些检出频率的差异，特别是色氨酸在肺癌组中几乎缺失以及苯丙氨酸检出率更高，提示了相关代谢途径可能存在改变。
数据统计分析
对数据集进行了统计分析。曼-惠特尼U检验显示，肺癌患者和健康对照组之间目标氨基酸或有机酸的中位浓度无显著差异。箱线图显示关键代谢物（如哌啶酸、牛磺酸和琥珀酸）的浓度范围存在大量重叠。热图分析中观察到的马赛克样聚类进一步表明，呼出气冷凝液基质固有的高个体间变异似乎掩盖了疾病特异性改变。随后的AUC-ROC分析证实，没有任何一种氨基酸或有机酸具有显著的区分能力，所有AUC值均低于0.65，表明其诊断能力较差。哌啶酸、甘氨酸和琥珀酸产生了最高的AUC-ROC值，但无统计学意义。这与曼-惠特尼U检验结果一致，表明基于呼出气冷凝液，单个化合物的浓度不足以区分肺癌患者和健康个体。
综上所述，本研究建立并验证了一套用于可靠定量呼出气冷凝液中氨基酸和有机酸的分析方法，全面优化了样本储存策略和分析参数。研究发现，储存条件对呼出气冷凝液基质中大多数氨基酸和有机酸的稳定性有深远影响。因此，在收集后立即分析呼出气冷凝液样本对于防止降解和确保准确的代谢谱分析至关重要。当无法避免延迟分析时，必须将长期保存温度维持在-80°C或更低。然而，考虑到即使在-80°C下仍可观察到明显的分析物损失，研究人员提出，使用-150°C的低温储存可能提供更优的策略，以完全保护分子完整性。将这套验证过的方法应用于临床队列表明，目标氨基酸和有机酸谱缺乏区分肺癌患者与健康对照所需的统计学显著性。因此，在本研究框架内，这些特定的初级代谢物不能作为肺癌检测的独立、区分性生物标志物。未来的研究需要在更大的队列中进行，并严格按关键的混杂变量（特别是吸烟状况和饮食习惯）进行亚分类，同时关注氨基酸/有机酸比率或多变量模式分析的研究可能有助于发现更具区分性的生物标志物组合。无法在呼出气冷凝液样本中检测到大多数目标分析物，凸显了该基质固有的稀释挑战。因此，研究人员强烈建议，未来采用先进预浓缩技术的研究，对于识别这些难以捉摸的代谢物并充分阐明其作为新型癌症生物标志物的潜力将至关重要。最后，尽管这些标志物的单变量诊断效用有限，但本研究为呼出气冷凝液的处理和分析提供了关键的方法学进展，强调了无妥协的前分析标准化的绝对必要性。
