在序列多样性“海洋”中保持不变的蛋白质结构：酸鞘磷脂酶结构域的理论与进化模型

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：A conserved fold in a sea of sequence divergence: A theoretical and evolutionary model of the acid sphingomyelinase domain

酸鞘磷脂酶（aSMases）尽管序列水平无同源性，但三维结构高度保守，尤其在活性位点。通过扩散模型和序列比对预测，发现其核心结构由螺旋/折叠组成。研究揭示aSMases可能作为蛋白支架参与未知的相互作用网络，且在原核生物中存在趋同进化形成的类似酶。aSMases在膜修复和分泌外泌体中起关键作用，原核生物中多个无同源性的aSMases提示存在调控网络。结构进化而非序列保守性是aSMases功能维持的核心机制。

　　

Sairy Yarely Andrade-Guillen | José A. Martínez-álvarez | Jennifer Isabel López-Pérez | Ana Laura Medina-Nieto | Fátima Berenice Ramírez-Montiel | ángeles Rangel-Serrano | Naurú Idalia Vargas-Maya | Javier de la Mora | Abraham Asahel Gasca-Venegas | Claudia Leticia Mendoza-Macías | Patricia Cuéllar-Mata | Nayeli Alva-Murillo | Felipe Padilla-Vaca | Bernardo Franco

瓜纳华托大学生物系，自然科学与精确科学分部。墨西哥。邮政编码36050

摘要

酸性鞘磷脂酶（aSMases）是一类参与真核细胞质膜修复的酶。然而，关于它们的进化历程知之甚少。这些酶的一个重要特点是，尽管在序列水平上没有同源性，但它们在结构上高度保守，且催化结构在具有广泛活性的酶中似乎是完全相同的，这表明即使在序列上没有同源性，也存在一个进化上保守的“核心”。我们发现，尽管这些蛋白质在序列上没有显著的同源性，但它们在整体蛋白质结构上高度保守，尤其是在活性位点。通过基于多序列比对的扩散模型预测的结构显示，活性位点包含螺旋/折叠结构。此外，aSMase结构域存在于与特定aSMase酶活性无关的蛋白质中，这表明该结构域在真核生物中普遍存在。基于先前的研究和这里的发现，我们假设aSMase结构域的功能不仅限于鞘磷脂代谢，而且在原生生物中，这些酶在酶调控方面可能存在更大的差异，同一细胞中可能表达多个同源物。这里的数据表明，aSMases可能包含作为尚未确定的蛋白质相互作用网络和功能支架的结构域。进一步的实验研究可能会阐明aSMases在不同生物体中的功能作用和进化起源，并识别出新的治疗靶点。

引言

膜结构和调控仍然是活跃的研究领域，对细胞生物学具有广泛的影响（Go?i, 2025）。正如Go?i（2025）所指出的，鞘磷脂是一种膜成分，对于打破脂质不对称性至关重要，它通过诱导跨膜脂质运动（即“翻转”）来促进脂质的翻转，这一过程被称为脂质重排。这包括体积较大的神经节苷脂。导致这种不对称性的主要因素是酸性鞘磷脂酶（aSMases；EC 3.1.4.12；全称：鞘磷脂磷酸二酯酶），其产物是神经酰胺。细胞膜的动态特性是生物过程的核心，因为细胞外环境与细胞内部环境之间的相互作用驱动着对变化条件的生理适应，从而维持稳态或引发疾病（Hermann等人，2023）。 质膜定义了细胞的基本动态边界，介导了细胞内部世界与外部环境之间的复杂相互作用（Lombard, 2014）。维持这一屏障的完整性对细胞生存至关重要，需要强大的膜修复和稳态调节机制。其中心是aSMases，这是一类催化鞘磷脂水解为神经酰胺和磷脂胆碱的酶，它们存在于溶酶体中（Go?i & Alonso, 2002; Shuchman, 2010; Slotte, 2013; Lombard, 2014）。这种酶促转化不仅仅是一个代谢步骤，而是一个深远的生物物理触发因素；生成的神经酰胺具有独特的物理化学性质，会自发地在膜内形成凝胶状、有序的结构。这种局部化的脂质双层重塑改变了膜的流动性、曲率和组织结构，产生了重要的生理效应，例如富含神经酰胺的膜区域对于正确的免疫功能至关重要，并且现在已被确定为病毒载量控制的额外靶点，如SARS-CoV-2病毒，其中神经酰胺含量的增加会对患者造成伤害，可能也适用于其他病原体（Contreras等人，2003; Boulgaropoulos等人，2010; Chung & Claus, 2021; Kornhuber等人，2022）。这种由神经酰胺引起的重组的深远性质已被强调为膜不对称性实验研究中的关键混淆因素，突显了脂质介质的强大生物物理活性。这些效应共同构成了信号转导、病原体入侵（例如COVID-19）和细胞应激反应的基本机制（Li等人，2019; Chung & Claus, 2021; Kornhuber等人，2022）。因此，aSMases在健康方面起着关键作用，主要体现在细胞膜维持和脂质代谢的正常调节上（由于它们位于内溶酶体区室），并与细胞信号传导相关；在病理情况下，如尼曼-皮克病（Mir & Thirunavukkarasu, 2023; Choi等人，2024）。迄今为止，至少有64种药物被归类为酸性鞘磷脂酶的功能抑制剂（Loas & Le Corre, 2021），并与减少或抑制病毒入侵有关（Kornhuber等人，2010），最近的研究还表明，它们可以通过促进血管生成和减轻内质网压力来改善脑缺血患者的预后（Mohamud Yusuf等人，2024）。因此，aSMases具有很高的相关性，值得进一步研究。 这种快速、局部化的膜重塑能力不仅用于内部信号传导或修复，还是细胞间通信的基石。细胞间通信的一个关键途径是受调控的细胞外囊泡（EVs）的释放——这些囊泡是包裹着蛋白质、脂质和核酸的纳米颗粒，被运输到受体细胞（Jahnke & Staufer, 2024; D’Angelo等人，2025）。EVs的生物发生与鞘磷脂酶活性密切相关。具体来说，中性鞘磷脂酶（nSMase）参与了多囊泡体内部囊泡的形成，这些囊泡是外泌体的前体。相比之下，酸性鞘磷脂酶（aSMases）作用于质膜的外层，其生成的神经酰胺会诱导膜负曲率，从而驱动巨噬泡的外向出芽和脱落（D’Angelo等人，2025）。因此，aSMase/神经酰胺系统代表了一种直接且进化上保守的途径，用于将细胞信息包装并释放到细胞外空间。然而，EV介导的通信的重要性不仅限于哺乳动物系统，它是生命树中普遍采用的策略，包括病原性原生动物如Giardia intestinalis、Entamoeba histolytica和Trichomonas vaginalis（Jahnke & Staufer, 2024; Kumar等人，2024a,b; D’Angelo等人，2025）。对于这些寄生虫来说，EVs是关键的毒力因子，它们可以操纵宿主的免疫反应，促进入侵并建立成功的感染。然而，识别驱动这些远缘生物中EV形成的具体分子机制（如aSMases）一直具有挑战性，尤其是由于缺乏生成靶向突变体的分子工具。

在我们小组之前的两项研究中，我们发现来自两种寄生原生动物（Entamoeba histolytica和Trichomonas vaginalis）的aSMases尽管具有对催化至关重要的保守三维结构核心，但在不同原生动物门中的初级氨基酸序列上存在广泛的差异（Ramírez-Montiel等人，2025; Medina-Nieto等人，2025）。这种序列同源性的缺失意味着这些酶可能是通过趋同进化产生的，正如Cordes和Binford所提出的，基于一种具有保守结构的细菌甘油磷酸二酯酶（Cordes & Binford, 2006），其中的主要选择压力是保持生物物理功能（底物结合和生成神经酰胺以重塑膜），而不是特定遗传蓝图的保守。因此，使用传统的基于序列的同源性搜索在原生动物寄生虫（以及其他生物）中识别功能性aSMase同源物通常是徒劳的。此外，我们小组分析的生物体还显示另一个有趣的特征：它们的基因组中编码了多个aSMases，这些aSMases之间没有同源性，而且其中一些副本的结构非常灵活（Ramírez-Montiel等人，2025; Medina-Nieto等人，2025），这表明这些生物体中可能存在调控网络，同时也表明aSMases在原生动物基因组中存在多个副本的原因可能不是冗余。

aSMases在寄生原生动物中的重要性与其所寄生的环境有关。从黏膜驻留细菌到先天免疫系统的裂解成分，这些成分都会对细胞膜造成损害（Nievas等人，2020）。因此，每种原生动物都是独特的，面临着由宿主饮食和其他环境因素影响的不同危险。我们小组之前已经证明，酸性鞘磷脂酶（aSMase）是肠道寄生虫Entamoeba histolytica中的关键膜修复酶（Ramírez-Montiel等人，2019）。发现一种肠道寄生虫进化出了修复其质膜的机制，表明这种机制可能在其他病原性真核生物中普遍存在，并可能在具有新功能的远缘门中也有存在。

本研究的主要目的是分析不同门中aSMases的多样性、aSMases的结构，并利用已表征的Entamoeba histolytica aSMase 6（UniProt登录号C4LVV3）来寻找序列和结构层面的进化特征，该酶与两种不同的生物活性相关：膜修复和溶血活性（Ramírez-Montiel等人，2025），这两种活性都作为毒力因子和决定因素。因此，我们旨在利用这种结构-功能范式来研究不同门中类似aSMase的活性。我们假设，尽管在序列上存在差异，但aSMase的功能类似物在各个门中都存在，并且对于基本的细胞过程（如膜修复和分泌EV的生成调控）至关重要。我们的发现表明，aSMases的最基本基础在于结构而非初级序列，为针对这些酶的新实验分析开辟了途径。

蛋白质序列分析

同源性搜索无法识别远古祖先的序列。因此，我们使用了位于EMBL-EBI服务器上的HMMER工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/home [Potter等人，2018]），使用默认参数和UniProt数据库版本2025_01（The UniProt Consortium, 2025）来搜索Entamoeba histolytica aSMase 6的蛋白质序列（UniProt登录号C4LVV3）。使用E值为0.001作为阈值来排除序列片段和不相关的序列。

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一个最有趣的进化问题是存在同功酶或异酶，这些酶是非同源的蛋白质，但能够催化与真正酶相同的生化反应（Omelchenko等人，2010）。这些酶被称为非同源同功酶或NISE。已经报道了几个例子，这些酶的功能性与结构灵活性有关，使它们能够适应变化

讨论

尽管随着模式生物基因组数据的不断增长，进化历史已经得到了更好的理解（Hedges, 2002），但对于非模式生物来说，相关信息仍然有限。核苷酸和氨基酸序列的使用提高了对地球上主要进化事件的理解，但由于缺乏准确的化石记录，微生物是主要限制因素（Douzery等人，2004）。使用多种蛋白质而不是传统的

Bernardo Franco：写作——审阅与编辑，撰写初稿，监督，资源管理，项目管理。 Fátima Ramírez-Montiel：可视化，形式分析。 Ana Medina-Nieto：研究，数据管理。 Naurú Vargas-Maya：可视化，验证，方法学。 ángeles Rangel-Serrano：可视化，验证，方法学。 Abraham Gasca-Venegas：监督，研究，数据管理。 Javier de la Mora：监督，研究，数据管理。 Patricia Cuéllar-Mata：

未引用参考文献

Rzhetsky和Nei, 1992; Schuchman, 2010.

利益冲突声明

作者声明他们没有可能不当影响其工作或手稿评审的财务利益或其他个人关系。

资助来源

作者感谢来自瓜纳华托大学（2018/2023年和2023-G-1274）和CONAHCYT（CF 2023-G-1274）的资助。

作者声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或其他个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢两位专家对这项工作的评估，他们的意见极大地改进了本文的分析和呈现。