两种细菌荧光素酶中醛结合位点的结构与进化分析及其与反应动力学的关系

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Structural and evolutionary analysis of aldehyde binding sites in two types of bacterial luciferase in relation to reaction kinetics

细菌 luciferase 的醛类底物结合与动力学差异研究，比较了 Vibrio harveyi（慢型）和 Photobacterium leiognathi（快型）对 C8-C14 醛的催化活性，通过实验动力学、分子对接、分子动力学和系统发育分析，揭示了活性位点结构差异（如 His44 和 Trp194 的保守性）对反应速率的影响，并发现进化压力作用于关键结合位点的氨基酸。

　　

安娜·A·迪瓦（Anna A. Deeva）|阿尔伯特·E·利西察（Albert E. Lisitsa）|安娜·K·利亚皮娜（Anna K. Lyapina）|瓦伦蒂娜·A·克拉塔苏克（Valentina A. Kratasyuk）|纳塔拉詹·阿鲁尔·穆鲁甘（Natarajan Arul Murugan）|埃莱娜·V·涅姆采娃（Elena V. Nemtseva）

西伯利亚联邦大学生物物理学系，基础生物学与生物技术学院，斯沃博德尼大街79号，克拉斯诺亚尔斯克660041，俄罗斯

摘要

细菌荧光素酶属于黄素单加氧酶大家族的一员，它能够进行独特的生物发光反应。我们利用实验动力学技术、分子对接、分子动力学和系统发育分析研究了两种细菌荧光素酶（Vibrio harveyi——“慢”型和Photobacterium leiognathi——“快”型）与脂肪醛的相互作用。研究的目的是为了理解这两种荧光素酶与醛底物之间不同动力学特性的结构基础。我们发现V. harveyi荧光素酶活性位点的一个显著特征是存在一个较小的醛结合口袋。而在P. leiognathi荧光素酶中，所有醛都以大致相同的构象结合到活性中心的疏水位点上，仅在结合亲和力上存在差异。V. harveyi荧光素酶中的C₈和C₁₂醛不与αTrp194相互作用，这与它们缓慢的反应动力学一致。分子动力学和自由能计算表明，醛与蛋白质之间的疏水相互作用是复合物稳定性的驱动力。对细菌荧光素酶序列的系统发育分析显示，位于6–8、191–195和228–229位置的氨基酸受到正向进化选择。这些数据表明，进化过程形成了一个通用的平台，使得“快”型和“慢”型荧光素酶都能有效地催化天然醛类物质（如十四烷醛）的氧化反应。然而，在生物发光实验中使用较短链的醛时，必须考虑它们在活性位点内的特定相互作用方式，因为这些相互作用方式决定了酶的反应动力学。

引言

酶作为有效的生物催化剂的一个显著特征是它们能够选择性地与特定底物相互作用，从而以极高的特异性促进生化反应。同时，即使是高度同源的酶的活性中心结构上的微小差异也会显著影响它们的动力学特性和底物结合能力。例如，已经观察到醛脱氢酶NahF[1]、苹果酸脱氢酶[2]以及还原脱卤酶[3]在处理醛类物质时的差异。这些细微的结构变化不仅影响酶的催化效率，还促进了酶在各种生物环境中的功能多样性。理解决定酶特异性的结构和功能模式对于阐明它们在代谢途径中的作用以及开发各种生物技术应用至关重要。

一个典型的例子是细菌荧光素酶的功能。这种酶属于黄素单加氧酶大家族，它具有独特的生物发光功能，即作为反应产物之一产生光量子[4]。细菌荧光素酶已经成为了研究半个多世纪的对象。然而，持续的研究不断揭示出关于其结构-功能关系的新见解，范围从编码细菌发光蛋白的lux操纵子的遗传多样性[5]，到导致酶活性位点产生电子激发态物种的详细化学机制[6],[7],[8]。与其他发光酶（如萤火虫和水母中的酶）一样，细菌荧光素酶被广泛用于无创的体内光学成像[9]以及各种分析方法，例如在生态毒理学领域[10],[11]。

细菌荧光素酶的一个显著特点是，对于这种酶来说，黄素单核苷酸不是辅因子，而是底物（还原形式为FMNH₂）和产物（氧化形式为FMN）。在反应过程中，FMNH₂被氧化，同时长链脂肪醛发生单加氧反应，分子氧也被还原（图1 A）。已描述的催化步骤包括形成4a-羟基黄素中间体和4a-过氧半缩醛加合物，后者随后转化为电子激发态中间体。反应中间体的详细化学结构可以在其他文献中找到[8],[9]。除了十四烷醛是细菌生物发光中的内源性醛类物质[12],[13],[14]外，使用其他碳原子数（8至16个）的醛类物质也能观察到光发射现象。然而，反应动力学和酶单次转化过程中发出的光强度本质上取决于荧光素酶的类型和醛类的链长。

早在细菌生物发光研究初期，人们就利用体外荧光素酶反应的动力学特性来初步区分新发现的发光细菌物种或菌株，而无需进行耗时的生理学和形态学研究[15]。人们注意到，在与十二烷醛的反应中，细菌荧光素酶表现出快速或缓慢的动力学特性，这可以作为它们所属细菌物种组的指标（图1 B）。例如，Photobacterium属和Aliivibrio fischeri的荧光素酶催化的反应速率为0.64–1.03?s^?1，而Vibrio harveyi和Photorhabdus luminescens的荧光素酶则表现出缓慢的动力学特性，反应速率为约0.12?s^?1[15],[16],[17]。进一步的研究表明，除了与某些醛类的反应动力学差异外，这两种类型的荧光素酶在其他功能特性上也存在差异，例如热稳定性和对醛类抑制的敏感性[18],[19],[20],[21]（图1 B）。功能上的差异与荧光素酶根据氨基酸序列分为两组的情况一致[22]。系统发育分析表明，活性位点腔由20个保守的氨基酸组成，每种类型的荧光素酶还各有11个保守的氨基酸。

因此，观察到的细菌荧光素酶功能特性的差异与其存在的不同结构亚家族相符，即反映了它们之间的系统发育关系。需要强调的是，“快”型和“慢”型荧光素酶的分类是相对的，例如在十四烷醛的反应中，所有荧光素酶的反应速率都是快速的。

尽管已经揭示了这两种类型细菌荧光素酶活性中心的结构特征，但导致它们与醛类反应动力学差异的详细机制尚未确定。部分原因在于，近几十年来大多数研究仅使用了“慢”型荧光素酶（V. harveyi、V. campbellii、Photorhabdus luminescens）。特别是对V. harveyi荧光素酶与4a-过氧半缩醛衍生物（E?FOOH?RCOH，图1 A）复合物的理论研究表明，生物发光反应中对醛类链长的选择性是由酶活性中心中由保守残基形成的疏水腔的大小决定的[8]。这项研究回答了为什么醛类链的长度必须在8到16个碳原子（C₈-C₁₆）之间的问题，但并未阐明V. harveyi荧光素酶与C₈和C₁₂反应缓慢、而与C₁₀和C₁₄反应快速的原因。该研究关注的是反应中间体（E?FOOH?RCOH，图1 A）中醛基团的构象，而不是前一个反应步骤（E?FOOH + RCOH）后底物的初始结合姿态。在另一项结构研究中，通过分子对接技术确定了长链醛在V. harveyi荧光素酶活性位点中FMN周围的狭窄搜索区域内的位置和姿态[23]。结果发现，保守的His44和Trp250在结合或与醛类底物相互作用中起着重要作用。

尽管对长链醛在生物发光反应中的作用进行了广泛研究，但它们在各种细菌荧光素酶活性位点内的结合特性仍然属于假设阶段。先前的研究发现，来自两个亚家族的密切相关的细菌荧光素酶在与十二烷醛的反应中表现出显著不同的动力学特性，这可能是由于底物结合模式的不同。我们研究的目的是比较两种类型细菌荧光素酶对不同长度醛类的结合位点，并分析结合特性与观察到的反应动力学之间的关系。我们应用了分子建模的计算方法和实验中的停流技术来获取两种荧光素酶（一种“慢”型Vibrio harveyi荧光素酶和一种“快”型Photobacterium leiognathi荧光素酶）对C₈–C₁₄醛类物质的结合特性和反应动力学。此外，还使用了生物信息学方法来确定负责醛类结合的位点是否受到进化压力。通过这种方法，我们试图回答以下问题：(i)“快”型和“慢”型荧光素酶活性位点中结合的醛类分子的构象是否有所不同？(ii)参与醛类结合的氨基酸在数量和类型上是否存在差异，这些差异是否导致了快速和缓慢的反应动力学？(iii)“快”型和“慢”型荧光素酶之间观察到的醛类结合位点差异在多大程度上是保守的？换句话说，醛类结合位点的形成是主要由正向进化选择还是通过负选择和功能保守性维持的？

材料

冻干的重组Photobacterium leiognathi荧光素酶（纯度90–95%）购自“Prikladnye Biosistemy Ltd.”（克拉斯诺亚尔斯克，俄罗斯）。V. harveyi荧光素酶是在俄罗斯克拉斯诺亚尔斯克生物物理学研究所的光生物学实验室中，使用E. coli BL21（DE3）菌株表达后冻干的，具体方法在其他文献中有描述[24]。黄素单核苷酸（FMN，Sigma-Aldrich，美国）、正辛醛和正癸醛（C₈和C₁₀，Acros Organics，美国）、正十二醛（C₁₂，Sigma-Aldrich，美国）也用于实验。

细菌生物发光反应与不同醛类的动力学

我们在非稳态模式下（单次转化测定）测量了两种荧光素酶与不同链长（C₈-C₁₄）醛类物质的生物发光动力学。尽管之前已经报道了这些酶的各种动力学特性，但尚未在相同的实验条件下进行过直接比较。

典型的动力学曲线呈现出双相特征，即初始快速增加后逐渐衰减（图2）。

结论

在这项研究中，我们旨在比较“快”型和“慢”型细菌荧光素酶活性位点上结合的饱和脂肪醛类的构象。这两种荧光素酶在整体上具有高度同源性，但在活性位点上存在特定的局部差异，并且动力学特性也有所不同。为此，我们选择了广泛使用且特性明确的V. harveyi荧光素酶作为“慢”型的代表，以及一种研究较少但根据我们的数据其发光强度更高的荧光素酶。

计算数据

支持本研究结果的数据可在https://zenodo.org/获取，DOI为：https://doi.org/10.5281/zenodo.18937222。

CRediT作者贡献声明

安娜·A·迪瓦（Anna A. Deeva）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学研究，数据分析，数据管理。阿尔伯特·E·利西察（Albert E. Lisitsa）：可视化，方法学研究，数据分析，数据管理。安娜·K·利亚皮娜（Anna K. Lyapina）：数据分析。瓦伦蒂娜·A·克拉塔苏克（Valentina A. Kratasyuk）：验证，监督，概念化。纳塔拉詹·阿鲁尔·穆鲁甘（Natarajan Arul Murugan）：软件开发，数据管理。埃莱娜·V·涅姆采娃（Elena V. Nemtseva）：撰写 – 审稿与编辑，可视化，监督，项目协调。

资金来源

本研究得到了俄罗斯科学基金会的资助，项目编号为25-24-00617。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢乌普萨拉大学物理与天文学系的汉斯·奥格伦（Hans ?gren）教授在方法学方面提供的技术支持和有益的建议。