异源生产巴内辛A：揭示一种含有罕见乙烯基化精氨酸基元的NRPS–PKS杂合体的生物合成平台

《ChemBioChem》：Heterologous Production of Barnesin A, an NRPS–PKS Hybrid Containing a Rare Vinylogous Arginine Moiety

本研究针对含罕见乙烯基化氨基酸（vinylogous amino acids）的天然产物巴内辛A（barnesin A）的生物合成机制尚未验证、且其天然产量极低的问题，通过异源表达其NRPS–PKS杂合基因簇，首次在E. coli中成功实现巴内辛A的生产，并发现其生物合成依赖FabD作为trans-AT（trans-acting acyltransferase）且NRPS–PKS megaenzyme对天然磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）具有严格选择性。该工作不仅证实了brn基因簇的生物合成功能，还为开发新型脂肽类乙烯基化蛋白酶抑制剂奠定了生物合成基础。

　　

天然产物长期以来一直是药物发现的重要宝库，尤其是那些结构复杂、具有显著生物活性的分子。在众多天然产物中，含乙烯基化氨基酸（vinylogous amino acids）的化合物尤为引人注目。这类分子因其α,β-不饱和酰胺结构（常被称为“分子弹头”）而具有高反应活性，能够通过迈克尔加成反应与靶酶共价结合，因此常作为高效的蛋白酶抑制剂。例如，已知的环西奥酰胺（cyclotheonamide）、丁香素（syringolins）和格利多巴汀（glidobactins）等都含有乙烯基化氨基酸基元，并显示出纳摩尔级的蛋白酶抑制活性。然而，这类稀有分子在自然界中产量极低，且其生物合成途径往往不明确，这极大地限制了对其深入研究和开发利用。

巴内辛A（barnesin A）是首个从厌氧细菌Sulfurospirillum barnesii中报道的、推测由非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）杂合途径生物合成的次级代谢产物。它含有一个罕见的乙烯基化精氨酸（vinylogous arginine, vin-arginine）基元，对半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶L（cathepsin L）和罗得辛（rhodesain）表现出纳摩尔级的抑制活性，在癌症和非洲昏睡病等领域具有潜在治疗价值。尽管前期研究通过基因组挖掘预测了一个NRPS–PKS杂合的生物合成基因簇（brn），并推测其依赖一个trans-AT（trans-acting acyltransferase）域，但这些假设一直缺乏实验验证。此外，巴内辛A的天然产量极低（0.014 mg L^-1），化学合成步骤复杂，因此，通过生物合成工程实现其异源生产与结构多样化，成为解决供应问题和进行药物开发的关键。

为解决上述问题，研究人员在本研究中致力于在E. coli中异源表达brn基因簇，以验证其生物合成功能，阐明关键酶的作用，并建立一个可持续生产巴内辛A及其类似物的平台。这项研究最终成功发表于《ChemBioChem》。

为开展此项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：1) 基因簇生物信息学分析：对S. barnesii中的brn基因簇进行序列分析，包括结构域预测（如NRPS的腺苷化结构域特异性）和trans-AT候选基因（Sulba_0581/FabD）的系统发育分析。2) 异源表达系统构建与优化：将brn基因簇（包括brnE(NRPS)、brnF(PKS)、brnI(PPTase) 和Sulba_0581）克隆到表达载体中，在E. coliBL21(DE3)和DH10B::mtaA等不同宿主中进行表达尝试，并通过密码子优化、更换启动子（如araBAD）、调整培养条件（温度、时间）等手段克服蛋白质表达难题。3) 代谢组学分析与质谱鉴定：利用高分辨质谱（HRMS）和MS²碎裂分析，对异源表达产物的提取物进行靶向和非靶向代谢物挖掘，通过与合成的巴内辛A标准品对比保留时间和碎片谱图，验证产物并发现新的巴内辛类似物。

2.1 brn基因簇分析

通过对brn基因簇及其同源序列gvb的深入分析，研究人员确认该簇编码一个NRPS（BrnE）、一个PKS（BrnF）、一个环肽转运蛋白（BrnBCD）和一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase, BrnI）。其中，BrnF是一个缺少内源酰基转移酶（AT）域的trans-AT PKS，因此需要外部的trans-AT来提供丙二酸延伸单元。生物信息学分析将Sulba_0581（注释为FabD，一种丙二酰CoA-酰基载体蛋白转酰基酶）确定为最可能的trans-AT候选基因。系统发育树分析显示，Sulba_0581与E. coli、Bacillus subtilis等中的FabD变体聚为一支，提示它可能在初级代谢和次级代谢中扮演双重角色。

2.2 brn生物合成基因簇的异源表达

初步在E. coliBL21(DE3)中单独表达各基因时，较小的sulba_0581和brnI可成功表达，但大型PKS基因brnF需要长时间低温培养才能检测到，而NRPS基因brnE则无法检测到表达。即使共表达所有基因并使用已携带广谱PPTase Sfp的BAP1菌株，仍无法检测到巴内辛A。研究人员随后将宿主更换为E. coliDH10B::mtaA（其带有araD139突变并能表达广谱PPTase MtaA），并使用密码子优化的brnE_mcu和brnF_mcu，在araBAD启动子控制下，最终实现了BrnE_mcu的可溶性表达。然而，即便在补充trans-2-辛烯酸的情况下，共表达brnE_mcu、brnF_mcu和sulba_0581仍未检测到目标产物。

2.3 天然PPTase BrnI对激活NRPS–PKS杂合体至关重要

研究人员推测，异源的广谱PPTase MtaA可能无法有效激活BrnE_mcu和BrnF_mcu。因此，他们在表达体系中额外引入了天然的PPTase基因brnI，并在15°C下延长培养至5天。在此条件下，通过HRMS成功检测到了一个与合成的巴内辛A（5）具有相同m/z（488.2869 [M+H]⁺）和MS²碎片谱图的特征峰，从而首次实验验证了brn基因簇是巴内辛A的生物合成来源。实验还发现，即使不补充trans-2-辛烯酸，或不共表达trans-AT候选基因sulba_0581，巴内辛A仍能产生，表明E. coli内源的脂肪酸生物合成途径可能提供了所需的酰基链，且其内源的FabD同源物可以补偿trans-AT功能。

代谢组挖掘发现新的巴内辛类似物

通过对代谢组的深入分析，研究人员除了确认巴内辛A（5）外，还发现了三个新的巴内辛类似物：巴内辛A₁（6，携带饱和的辛酸）、巴内辛B（7，携带trans-2-辛烯酸和精氨酸，缺少乙烯基）以及巴内辛B₁（8，携带饱和辛酸和精氨酸）。这些发现表明，该生物合成途径对相关的脂肪酸链具有一定程度的底物杂泛性。

本研究成功在E. coli中通过异源表达验证了brn生物合成途径。研究首次证实，巴内辛A的产生需要其天然的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶BrnI来激活NRPS–PKS megaenzyme，凸显了该酶系统对专一性辅助因子的严格依赖。同时，研究发现初级代谢酶FabD（Sulba_0581）在S. barnesii中可能扮演着trans-AT的双重角色，但在异源宿主E. coli中，其功能可被内源同源物部分替代。此外，代谢组学分析揭示了该途径能产生多种巴内辛类似物，表明其起始缩合（C）结构域对脂肪酸底物具有一定的灵活性。

这项工作的意义重大。首先，它通过实验确证了一个推测已久的、可产生含稀有乙烯基化精氨酸天然产物的NRPS–PKS杂合基因簇，解决了其生物合成起源的悬疑。其次，研究建立了一个在E. coli中生产巴内辛A的功能性异源表达平台，为克服其天然产量极低的瓶颈、实现规模化生产提供了可行方案。最重要的是，该平台为后续通过生物合成工程手段对巴内辛进行结构衍生化、从而开发新型且更具潜力的脂肽类乙烯基化蛋白酶抑制剂奠定了坚实基础，为针对半胱氨酸蛋白酶相关疾病（如癌症、寄生虫病）的新药研发开辟了新路径。