《The FASEB Journal》：A Potential Novel Molecular Interaction in Bronchiolitis Obliterans Syndrome in Lung Transplantation Patients: The Role of SERPINA3 and Osteoprotegerin
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慢性肺移植物失功严重影响肺移植术后患者的生存，其中闭塞性细支气管炎综合征（BOS）是最常见的表型。为了探索BOS气道纤维性闭塞的新机制，研究人员聚焦于蛋白酶抑制剂SERPINA3和骨保护素OPG，并结合肥大细胞介质（类胰蛋白酶和糜蛋白酶）进行研究。结果表明，BOS患者血清SERPINA3水平升高，且肥大细胞可表达SERPINA3和OPG，二者可能在肺组织中形成复合物，共同参与BOS的气道重塑过程。这为理解BOS的发病机制和寻找潜在治疗靶点提供了新线索。
对于许多终末期肺病患者来说，肺移植是最后的希望。然而，手术成功并不意味着一劳永逸。大约一半的患者在移植后5年内，会遭遇一个名为“慢性肺移植物失功”（CLAD）的“隐形杀手”，它极大地限制了患者的长期生存。在CLAD的各种表现形式中，又以“闭塞性细支气管炎综合征”（BOS）最为常见。想象一下，本应通畅的细小气道，其管腔被异常的纤维组织逐渐堵塞、直至完全闭塞，这导致患者肺功能不可逆地下降，呼吸困难日益加重。尽管医学界已知BOS与异常的修复过程、细胞外基质过度沉积等有关，但其背后精确的分子“剧本”仍未完全揭开，这也使得针对性治疗面临瓶颈。
为此，一组研究人员将目光投向了两个可能与组织纤维化相关的蛋白质：SERPINA3（又称α1-抗胰凝乳蛋白酶）和骨保护素（OPG）。SERPINA3是一种急性期蛋白，与肺纤维化进程相关，并能与肥大细胞分泌的糜蛋白酶结合，抑制其活性。OPG则是一种糖蛋白，传统上在骨代谢中发挥作用，但新近研究也发现它在特发性肺纤维化等疾病中水平升高，与肺功能下降相关。有趣的是，表达类胰蛋白酶的肥大细胞能够产生OPG，而类胰蛋白酶正是肥大细胞的标志物。这不禁让人猜想：在BOS的气道中，肥大细胞、SERPINA3和OPG之间，是否存在某种“合作”，共同导演了这场气道“堵塞”的悲剧？
为了验证这一猜想，研究团队在《The FASEB Journal》上发表了一项研究。他们利用格罗宁根大学医学中心的肺移植患者生物样本库，开展了一项从血清到组织、从蛋白定位到分子互作的深入探索。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了匹配的BOS与非BOS患者纵向血清样本中的SERPINA3水平。其次，他们从因终末期BOS而接受再移植或死亡的患者中获取了肺组织样本。利用苏木精-伊红（H&E）和Verhoeff染色对气道进行识别和分类（正常、部分闭塞、完全闭塞）。接着，通过免疫组织化学（IHC）在组织切片上定位SERPINA3、OPG、类胰蛋白酶和糜蛋白酶。为了探究蛋白间的共存与互作，他们采用了免疫荧光（IF）进行共定位分析，以及邻位连接技术（PLA）检测蛋白-蛋白近距离（<40 nm）相互作用。最后，他们还利用AlphaFold服务器对SERPINA3、OPG、类胰蛋白酶和糜蛋白酶之间的潜在相互作用进行了计算建模预测。
研究结果
3.1 BOS患者血清SERPINA3水平更高
研究人员发现，在BOS诊断时（BOS 1期和3期），患者血清中的SERPINA3水平显著高于未患BOS的对照组患者。纵向数据分析显示，在BOS发生前的12个月内，患者血清SERPINA3水平呈上升趋势，而非BOS患者则呈下降趋势。此外，血清SERPINA3水平与一秒用力呼气容积（FEV1）呈负相关，提示其可能与肺功能恶化有关。
3.2 部分和完全闭塞气道中低水平的SERPINA3沉积与肥大细胞共定位
在肺组织水平，研究发现SERPINA3阳性信号主要出现在气道外膜的结缔组织中，细胞形态呈圆形。在部分和完全闭塞的气道中，尽管阳性染色的面积百分比因结缔组织大量增加而相对降低，但SERPINA3阳性细胞出现在平滑肌周围乃至管腔内的闭塞组织中。进一步的免疫荧光显示，这些SERPINA3阳性信号与类胰蛋白酶阳性肥大细胞存在共定位，表明SERPINA3很可能由气道中的肥大细胞表达。
3.3 部分闭塞气道中存在更多糜蛋白酶阳性肥大细胞
糜蛋白酶是肥大细胞分泌的另一种丝氨酸蛋白酶，已知可与SERPINA3形成复合物。免疫组化显示，在完全闭塞的气道中，未与SERPINA3结合的“游离”糜蛋白酶阳性面积有升高趋势。AlphaFold建模分析提示，SERPINA3与糜蛋白酶的结合位点可能正好覆盖了所用检测抗体的结合表位，这解释了为何实验中观察到的SERPINA3与糜蛋白酶共定位有限——因为抗体可能无法识别已与SERPINA3结合的糜蛋白酶。
3.4 OPG沉积模式与SERPINA3相似并与后两者共定位
OPG在气道中的分布模式与SERPINA3和类胰蛋白酶相似，在正常气道中较多，在闭塞气道中相对减少。免疫荧光三标染色证实，存在同时表达SERPINA3、类胰蛋白酶和OPG的细胞，进一步支持了肥大细胞可能是SERPINA3和OPG的共同来源。
3.5 SERPINA3与OPG可能在BOS肺组织中形成复合物
为了探索这些蛋白是否在空间中足够接近以至可能发生相互作用，研究团队进行了邻位连接实验（PLA）。结果显示，SERPINA3与OPG之间、OPG与类胰蛋白酶之间均存在强烈的近距离信号，SERPINA3与类胰蛋白酶之间也有较弱的信号。这些信号不仅出现在细胞上，也弥散在部分和完全闭塞气道结缔组织的细胞外基质中。随后的AlphaFold建模预测，SERPINA3与OPG之间存在较强的潜在相互作用，OPG与类胰蛋白酶、SERPINA3与类胰蛋白酶之间也存在不同程度的相互作用。
3.6 在闭塞气道中SERPINA3与OPG表达呈正相关
相关性分析为蛋白间的功能联系提供了统计学支持。在部分闭塞和完全闭塞的气道中，SERPINA3与OPG的蛋白表达水平呈显著正相关。在完全闭塞的气道中，类胰蛋白酶不仅与SERPINA3呈正相关，也与OPG呈正相关。这些数据共同支持了“肥大细胞释放SERPINA3和OPG，二者在细胞外沉积并可能发生互作”的假设。
结论与意义
这项研究系统地揭示了在肺移植后BOS患者的气道病变中，肥大细胞、SERPINA3和OPG之间存在的潜在新型分子网络。研究表明，BOS患者血清SERPINA3水平升高且与疾病进程相关。在肺组织中，表达类胰蛋白酶的肥大细胞可能是SERPINA3和OPG的细胞来源。随着气道从正常到部分乃至完全闭塞，这些蛋白的表达位置发生改变，更多地出现在闭塞的结缔组织中。重要的是，SERPINA3与OPG不仅在蛋白表达量上正相关，在空间上也极为接近，计算模型预测二者可能形成复合物。
这些发现具有重要意义。它们为理解BOS的发病机制提供了一个新视角：活化的肥大细胞可能通过释放SERPINA3和OPG，并以某种形式（可能是复合物）将其沉积于细胞外微环境，从而参与并驱动了导致气道管腔闭塞的病理性气道重塑和纤维化过程。这挑战了以往对SERPINA3主要作为蛋白酶抑制剂、OPG主要参与骨代谢的传统认知，突出了它们在肺纤维化疾病中的新角色。该研究不仅深化了对BOS疾病生物学的理解，更重要的是，SERPINA3和OPG作为潜在的生物标志物和治疗靶点，为未来开发针对BOS的新的诊断策略和干预手段（例如靶向肥大细胞或这些特异性蛋白互作）奠定了重要的科学基础。
