线粒体固定的荧光探针用于揭示过氧亚硝酸盐在细胞抵抗肼作用过程中的关键作用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Mitochondria-immobilized fluorescent probe to reveal the crucial roles of peroxynitrite during the cellular resistance to hydrazine

基于萘酚的荧光探针DCN-Cl可双发射模式下区分羟胺（N2H4）与活性氧物种ONOO?，揭示细胞对抗性毒素N2H4入侵时依赖ONOO?的抗氧化机制，并通过线粒体靶向设计提高短寿命ONOO?的检测灵敏度。

　　

薛孙|李莎杨|孔秀琪|田明刚|于发奇

济南大学化学与化学工程学院，中国山东省济南市250022

摘要

细胞对外源物质的抗性反应是生命科学领域的一个重要课题。活性氧（ROS）在抵抗还原性毒物方面被认为起着关键作用。然而，由于缺乏合适的分子工具，高活性氧物种ONOO^?在细胞防御肼入侵中的作用仍不清楚。为了解决这个问题，我们开发了一种能够以定量方式区分ONOO^?和肼的荧光探针。该探针发出深红色荧光。当与肼反应时，会形成具有强供体-弱受体结构的电子构型，由于分子内弱电荷转移（ICT）效应而产生蓝色荧光；相反，当与ONOO^?反应时，会形成具有强供体-强受体结构的电子构型，从而由于强ICT效应而产生绿色荧光。通常，ONOO^?是在线粒体内产生的，并且在细胞中的半衰期很短。因此，我们设计了这种探针使其靶向线粒体并固定在线粒体上，从而提高其对细胞内ONOO^?的检测效率。利用这种探针，我们在细胞和体内水平上证明了细胞会产生大量ONOO^?来对抗肼的入侵。

引言

人类不可避免地会接触到各种外源性有毒化学物质。生物和化学研究人员经常接触各种化学试剂，其中大多数都具有毒性。对于普通人群来说，他们服用的药物也具有生物毒性。食物通常含有防腐剂、添加剂、农药等物质，这些物质也具有毒性。细胞具有对抗外源性化学物质的复杂机制。[1] 研究细胞对这些物质的抗性机制对于避免、预防和应对毒素，以及设计药品、食品添加剂、农药等相关产品具有重要意义。[2],[3],[4] 然而，到目前为止，细胞抵抗外源性有毒物质的过程仍然知之甚少，相关报道也非常有限。肼是一种具有还原反应性的外源性有毒物质。[5],[6] 它是DNA测序的重要生物试剂，火箭的重要能源，也是化学合成中常用的试剂之一。[7],[8] 因此，研究细胞对外源性肼的抗性机制非常重要。此外，研究细胞对肼的抗性可以为理解细胞如何应对还原性毒物提供理论基础。

为了研究细胞对肼的抗性机制，首先需要观察细胞内肼的含量及其变化。质谱法和色谱法是量化细胞内肼的有效方法。[10] 然而，这些方法需要裂解细胞并提取细胞液进行分析，属于破坏性方法，无法在活细胞和组织中实时原位研究肼的含量。相比之下，荧光成像能够观察活细胞和组织，具有独特的优势。[11],[12],[13] 目前，已有报道了用于检测肼的荧光探针，其中大多数基于肼的亲核反应性。[14] 例如，Jung等人开发了一种使用醛作为识别基团的荧光探针，用于定量检测肼。[15] Zeng及其同事设计了一种基于肼与α, β-不饱和结构反应的荧光探针，具有增强的发光性能。[16] Yang的研究小组开发了一种使用吲哚二酮衍生物作为识别部分的荧光探针，用于定量检测肼。[17]

据报道，细胞可能通过产生过量的活性氧（ROS）来应对入侵性毒素的降解。[18] ONOO^?是细胞内最具活性的ROS之一。因此，细胞可能产生ONOO^?来对抗肼的入侵。为了研究这一现象，有必要检测细胞内的ONOO^?。由于其高反应性，ONOO^?在细胞内的半衰期极短，传统的分析方法（如质谱法和色谱法）无法检测到细胞内的ONOO^?。目前，荧光成像主要用于检测细胞微环境和小分子（如ONOO^?）。[19],[20],[21] 例如，Cheng等人开发了一种用于检测细胞内ONOO^?的荧光探针，并在炎症期间观察到ONOO^?水平的升高。[22] Wang及其同事开发了一种基于激发态分子内质子转移（ESIPT）机制的荧光探针，用于检测ONOO^?。[23] Chai等人制备了一种用于检测线粒体氧化应激诱导的ONOO^?生成的荧光探针。[24] 为了研究ONOO^?在细胞抵抗肼中的重要作用，需要同时并区分这两种化合物。然而，能够区分这两种化合物的荧光探针很少见，这阻碍了相关研究的进展。

在这项工作中，我们修改了萘作为核心骨架，开发了一种能够与ONOO^?和肼反应的荧光探针，实现了两种化合物在不同发射颜色下的清晰可视化，如图1所示。这种探针DCN具有较大的共轭系统，发出深红色荧光。一方面，探针可以被ONOO^?氧化，形成具有强推拉电子系统的氨基萘醛衍生物，发出绿色荧光；另一方面，探针与肼水合物发生亲核加成和消除反应，生成具有强电子供体和弱电子受体的萘腙衍生物，发出蓝色荧光。因此，实现了对这两种化合物的定量成像和区分。此外，人们普遍认为ONOO^?是在线粒体的氧化呼吸过程中产生的。因此，我们设计了一种固定在线粒体上的荧光探针（DCN-Cl），以确保线粒体膜电位的波动不会干扰探针的靶向。这种设计保证了探针在ONOO^?生成时与其反应，从而提高了对这种短寿命物质的检测效率。利用这种探针，我们在细胞和体内水平上研究了细胞对肼的抗性机制，发现在这一过程中细胞和体内的ONOO^?水平显著增加。

荧光探针DCN-Cl的合成

将化合物1（149.57 mg，0.50 mmol）和1,4-双(氯甲基)苯（612.68 mg，3.50 mmol）溶解在乙腈中。反应需要在氮气保护条件下进行，温度为90°C，搅拌5小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，通过真空过滤收集，然后用石油醚洗涤三次并干燥，得到产品（130 mg，产率：59.22%）。¹1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 9.23 (s)

设计与合成

在我们之前的工作中，[25] 我们利用噻唑乙腈与醛缩合形成的双键结构构建了一种用于检测肼的荧光探针。这种探针可以被肼切割并最终转化为腙。另一方面，文献表明，与吸电子基团相连的双键结构可以被ONOO^?氧化并水解为醛。[26] 因此，在这项工作中，我们打算使用...

结论

总结来说，在这项工作中，我们设计并构建了一种荧光探针DCN-Cl，能够区分检测N₂H₄和ONOO^?，以研究ONOO^?在细胞和生物体抵抗N₂H₄过程中的可能作用。我们通过阳离子和苄氯结构使DCN-Cl靶向线粒体并固定在线粒体上，从而有效检测这种短寿命的物种ONOO^?。光谱测试结果表明DCN-Cl能够实现高度...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22174052）、山东省自然科学基金（ZR2023MB022、ZR2020QB151）以及济南大学科技计划（XBS2107）的财政支持。