《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Europium (III)-salicylate embedded carboxymethyl cellulose thin film immunosensor for ultrasensitive detection of breast cancer biomarker CA15-3: comprehensive experimental and computational insights
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CA15-3荧光免疫传感器开发及性能优化研究，采用铕(III)-水杨酸复合物与交联羧甲基纤维素薄膜构建高灵敏度检测平台，结合计算化学揭示分子机制，检测限达0.085 U/mL，显著优于传统方法。
Karim G. Mohammed | El-Sayed M. Mahdy | Enas M. Radwan | Mona S. Abdellateif | Mohamed Essameldin Abdelgawad | Faisal K. Algethami | Mohamed S. Attia | Mona N. Abou-Omar
埃及开罗首都大学理学院化学系生物化学与分子生物技术系
摘要
准确量化碳水化合物抗原15-3（CA15-3）对于乳腺癌的诊断和监测至关重要。本研究报道了一种新型发光薄膜免疫传感器，该传感器基于嵌入环氧氯丙烷交联羧甲基纤维素（mCMC）基质中的Eu(III)水杨酸盐[Eu(sal)?]，并用抗CA15-3抗体进行功能化。该传感器通过抗原-抗体相互作用诱导的Eu(sal)?复合物荧光淬灭来工作。该生物传感器的线性响应范围为240–920 mU/mL，检测限低至0.085 U/mL，显著优于传统的免疫测定方法。该系统表现出优异的回收率（86.6–154.5%）和精确度（RSD < 0.59%）。使用DFT、TD-DFT和分子动力学模拟的补充计算研究提供了关于配位几何（Eu-O：2.38–2.42 ?）、电子结构（HOMO-LUMO能隙：4.3 eV）、光物理性质（量子产率：86.6%，寿命：612 μs）以及与CA15-3的结合相互作用（Kd：24.3 nM）的机制见解。这种集成方法确立了该免疫传感器作为快速、经济且超灵敏的临床乳腺癌诊断平台的地位。
引言
乳腺癌仍然是全球女性中最常被诊断出的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因，2022年报告了约230万新病例和67万例死亡病例[1]。预计全球乳腺癌负担将进一步增加，特别是在低收入和中等收入国家，这些国家获得早期筛查计划和先进治疗干预的机会仍然有限[2]。虽然传统的成像方法如乳腺X光摄影、乳腺超声和磁共振成像（MRI）是乳腺癌检测不可或缺的工具，但它们存在固有的局限性，包括对隐匿性或微转移性病变的检测灵敏度不足、较高的假阳性率，以及对于疾病进展和治疗反应的频繁动态监测的实际操作限制[3]。
在这种背景下，循环肿瘤相关生物标志物作为乳腺癌评估的补充性、微创工具应运而生。碳水化合物抗原15-3（CA15-3）是MUC-1糖蛋白的循环形式，是目前最广泛验证的乳腺癌生物标志物之一。CA15-3已被确立为早期检测、诊断、预后评估和治疗监测的宝贵指标。在正常生理条件下，血清CA15-3水平通常低于30 U/mL，其浓度升高与疾病进展、转移扩散和不良临床结果密切相关[4],[5]。CA15-3的临床效用还因其与传统成像技术的互补作用而得到增强，使临床医生能够提高诊断准确性、评估治疗效果，并在放射学证据出现之前检测到早期复发[5],[6]。因此，开发高灵敏度、特异性和可靠的生物样本中CA15-3定量方法对于有效管理乳腺癌至关重要。目前临床实验室中的乳腺癌生物标志物分析方法主要依赖于传统的免疫测定平台，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、化学发光免疫测定（CLIA）和电化学发光免疫测定（ECLIA）[7]。尽管这些成熟技术提供了可接受的分析性能，但它们通常伴随着显著的局限性，包括劳动密集型协议、高运营成本、较长的分析时间和复杂的仪器要求。此外，这些方法容易受到交叉反应的影响，并需要复杂的样本处理程序，这可能影响结果的一致性并限制其在即时检测中的应用[8]。这些局限性突显了迫切需要结合高灵敏度、特异性和操作简便性的创新分析平台。
生物传感器作为传统免疫测定的有希望的替代品出现，具有响应时间快、多功能性、成本效益高和微型化潜力等优点，同时不牺牲分析性能[9]。在各种生物传感平台中，基于镧系元素的发光探针由于其独特的光物理特性而受到越来越多的关注，包括较大的斯托克斯位移、毫秒级的发光寿命、尖锐的发射带和出色的光稳定性。这些特性使得能够有效抑制背景荧光，从而实现高通量筛选和敏感的生物标志物检测[10],[11]。
最近在CA15-3生物传感方面的进展探索了多种转导平台，见表S1。例如，一种用于检测人唾液和血清样本中CA15-3的一次性伏安免疫传感器实现了0.56 U/mL的检测限，但电极制备复杂且稳定性有限[12]。基于量子点的荧光免疫传感器提供了改进的灵敏度（LOD：0.027 U/mL），但受到量子点毒性和光漂白的限制[13]。表面等离子体共振（SPR）生物传感器[14]提供无标记检测，但需要昂贵的仪器，并且对低丰度生物标志物的灵敏度有限。基于镧系元素的发光传感器由于其独特的光物理特性而成为有希望的替代品，包括较大的斯托克斯位移（>200 nm）、毫秒级的寿命，允许时间分辨测量和出色的光稳定性。然而，现有的基于镧系元素的CA15-3检测传感器仍然存在局限性，报告的LOD通常高于0.5 U/mL。本研究通过将Eu(sal)?整合到优化的聚合物基质中，实现了0.085 U/mL的LOD，比现有方法提高了1.4至6.6倍。
Eu(III)复合物在生物传感应用中具有独特优势：(i) 特征性的窄带发射（FWHM < 10 nm），对应于5D? → 7F?跃迁，波长约为615 nm，能够从背景荧光中区分出来；(ii) 毫秒级的发光寿命（通常为500–2000 μs），允许时间分辨测量，有效抑制生物样本中的短寿命背景自荧光（寿命：1–10 ns）；(iii) 较大的斯托克斯位移（>200 nm），消除自淬灭并实现高灵敏度测量；(iv) 与有机染料和量子点相比出色的光稳定性；(v) 天线效应——配位的水杨酸盐配体吸收紫外线并将能量高效传递给Eu3?——提供强烈的信号放大（本研究中量子产率为86.6%）。在镧系元素中，Eu3?在红色光谱区域具有较高的量子产率，此时生物基质的干扰最小，5D? → 7F?跃迁对配位环境的变化非常敏感，从而能够敏感地检测抗原-抗体结合事件[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24]。将发光镧系复合物整合到生物相容性聚合物基质中是开发稳健传感平台的有希望策略。羧甲基纤维素（CMC）是一种可再生的纤维素衍生物，具有优异的生物相容性、化学多样性和丰富的功能基团，适合化学修饰和生物分子固定。用环氧氯丙烷（ECH）交联CMC生成环氧功能化的基质（mCMC），具有增强的机械稳定性、结构完整性和功能基团密度，为嵌入发光探针和固定生物识别元件提供了理想的支架。这种方法能够制造出耐用、光学透明的薄膜，适用于基于荧光的敏感检测[25],[26]。
尽管在发光生物传感器开发方面取得了显著进展，但这些平台的合理设计和优化需要全面理解控制传感器性能的分子相互作用。计算化学方法，包括密度泛函理论（DFT）、时间依赖性DFT（TD-DFT）、分子对接和分子动力学模拟，已成为阐明传感器功能基本机制的强大工具。这些计算方法能够详细表征配位几何、电子结构、光物理性质和与目标分析物的结合相互作用，为优化传感器设计和性能提供了关键见解。
本工作的依据基于四个关键观察结果：(i) 现有的CA15-3检测方法对于早期乳腺癌诊断的灵敏度不足，LOD通常高于0.3 U/mL；(ii) 基于镧系元素的发光探针具有较大的斯托克斯位移和长的发光寿命，但其在CA15-3检测中的应用尚未得到充分探索；(iii) 羧甲基纤维素为传感器制造提供了理想的生物相容性基质，但需要化学修饰才能达到最佳性能；(iv) 计算方法可以为合理设计传感器提供关键的机制见解，但尚未系统地与CA15-3免疫传感器的实验开发相结合。因此，本研究旨在：(1) 开发一种新型的Eu(sal)?嵌入mCMC薄膜免疫传感器；(2) 全面表征其结构和光学性质；(3) 评估其CA15-3检测的分析性能；(4) 利用DFT/TD-DFT和分子动力学模拟来阐明传感器功能的配位几何、电子结构、光物理性质和结合机制。
在这项工作中，我们展示了一种基于Eu(sal)?掺杂、环氧氯丙烷改性的羧甲基纤维素（mCMC）的新型发光薄膜免疫传感器，用于超灵敏地检测乳腺癌生物标志物CA15-3。制备的CA15-3 Ab/Eu(sal)?-mCMC TF结合了Eu(sal)?复合物的优异发光性能与改性纤维素基质的生物相容性、结构稳定性和功能多样性。传感机制基于特定的抗原-抗体相互作用诱导的荧光淬灭，实现选择性和敏感的CA15-3定量。使用FE-SEM/EDX、FT-IR、UV–Vis和荧光光谱的全面实验表征证实了传感器的成功制备，并阐明了结构-性质关系。利用DFT、TD-DFT、分子对接和分子动力学模拟的补充计算研究提供了关于Eu(sal)?复合物与CA15-3的配位化学、电子结构、光物理性质和结合机制的详细分子级见解。开发的生物传感器表现出优异的分析性能，具有超低的检测限、高选择性、出色的重复性和稳健的稳定性，使其成为临床乳腺癌诊断和实时治疗监测的有希望的平台。
化学试剂和材料
Eu(III)硝酸盐五水合物 [Eu(NO?)?·5H?O，纯度99.9%]，水杨酸（C?H?O?，≥99.0%），戊二醛（C?H?O?，50%水溶液），牛血清白蛋白（BSA，≥98%），环氧氯丙烷（ECH，纯度99.5%），羧甲基纤维素（CMC，平均分子量约250,000，取代度0.7–0.9），乙醇（C?H?OH，纯度≥99.8%），乙腈（CH?CN，HPLC级，≥99.9%），二甲基亚砜（DMSO，≥99.9%），N,N-二甲基甲酰胺（DMF，≥99.8%），氢氧化钠（NaOH，≥98%）等
电子结构和吸收性质
TD-DFT计算的UV–Vis吸收光谱（图1A）显示了特征性的配体中心跃迁，最强的吸收带位于300–320 nm，归因于n → π*和配体到金属的电荷转移（LMCT）跃迁。220–240 nm处的次要吸收带对应于水杨酸芳香环的π → π*跃迁。这些计算结果与实验UV–Vis光谱非常吻合，验证了计算方法的准确性。
未来展望和方向
虽然开发的CA15-3 Ab/Eu(sal)?-mCMC薄膜免疫传感器表现出优异的分析性能，但仍需进一步研究几个方向。首先，与便携式荧光读取器或基于智能手机的检测系统集成可以实现资源有限环境下的即时检测[40]。材料的低成本（估计每个传感器不到5美元）和简单的制备协议支持这一转化。其次，通过结合额外的
结论
在这项研究中，我们成功开发并全面表征了一种新型发光薄膜免疫传感器，用于超灵敏地检测乳腺癌生物标志物CA15-3，该传感器基于嵌入环氧氯丙烷交联羧甲基纤维素基质中的Eu(III)水杨酸盐复合物，并用抗CA15-3单克隆抗体进行功能化。结构分析证实了成功的制备和均匀的形态，而使用DFT的补充计算研究
资金声明
本研究得到了伊玛目穆罕默德·伊本·沙特伊斯兰大学（IMSIU）科研处的支持和资助（授权号：IMSIU-DDRSP2601）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
